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弓形虫复合抗原ROP2-SAG1优势表位与人乳头瘤病毒16型晚期结构蛋白L1融合体的构建及其在真核细胞中的表达
目的 构建弓形虫复合抗原ROP2-SAG1免疫优势表位(RSepitope)与人乳头瘤病毒16型晚期结构蛋白L1 (HPV16L1)的融合体(RSepitope-HPV16L1),验证其在真核细胞中的表达. 方法 优化RSepitope基因序列,构建pcDNA3.1/RSepitope重组真核表达质粒.从T-HPV16L1质粒中扩增HPV16L1基因片段,构建pcD-NA3.1/RSepitope-HPV16L1重组质粒.双酶切、PCR、测序鉴定正确后,将2个重组质粒分别转染至非洲绿猴肾细胞COS-7细胞,培养48 h后收集细胞,提取RNA,RT-PCR扩增相应的目的基因.Western blotting和间接免疫荧光实验检测重组蛋白RSepitope和RSepitope-HPV 16L1在细胞中的表达. 结果 构建的重组质粒pcDNA3.1/RSepitope和pcDNA3.1/RSepitope-HPV 16L1经PCR扩增和双酶切分别获得282 bp和1 500 bp片段,与预期结果一致,测序结果正确.RT-PCR结果显示,以2个重组质粒转染细胞的cDNA为模板,分别扩增到282 bp和1 500 bp的目的条带.Western blotting分析结果显示,以RSepitope免疫血清为一抗,重组蛋白RSepitope和RSepitope-HPV16L1分别在相对分子质量(Mr)约为10 000和65 000处出现特异性条带;以HPV16L1单克隆抗体为一抗,重组蛋白RSepitope-HPV 16L1在Mr 65 000处出现特异性条带.间接免疫荧光实验结果显示,以RSepitope免疫血清为一抗,重组质粒pcDNA3.1/RSepitope和pcDNA3.1/RSepitope-HPV 16L1转染细胞内均观察到绿色荧光;以HPV16L1单克隆抗体为一抗,重组质粒pcDNA3.1/RSepitope-HPV 16L1转染细胞内观察到特异性绿色荧光. 结论 弓形虫优势表位RSepitope与HPV16L1融合体构建成功,且可在真核细胞中表达.
关键词： 弓形虫 优势表位 人乳头瘤病毒16型晚期结构蛋白 表达
