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20S蛋白酶体β5亚单位基因沉默对人骨髓间充质干细胞增殖能力的影响
目的:应用基因沉默技术,观察下调20S蛋白酶体β5亚单位(PSMB5)对人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)增殖能力的影响及其潜在机制,寻求调节干细胞活力的关键靶点.方法:构建PSMB5-shRNA慢病毒载体感染早期hBMSCs,根据感染条件不同将细胞分为绿色荧光蛋白(GFP)对照组和shRNA组.倒置荧光显微镜观察转染效率,RT-PCR和免疫印迹检测PSMB5沉默效率,荧光分光光度法检测蛋白酶体活性;BrdU掺入实验观察PSMB5基因沉默对早期hBMSCs增殖潜能的影响,流式细胞术检测细胞周期分布,免疫印迹检测细胞周期相关蛋白1(cyclin D1)及其激酶CDK4的表达变化.结果:慢病毒感染早期hBMSCs 72 h可见约95％以上细胞表达绿色荧光蛋白.shRNA组PSMB5 mRNA和蛋白表达水平较GFP对照组分别降低93.31％±0.59％和56.83％±13.31％,且蛋白酶体活性较对照组降低37.47％±0.41％.此外,shRNA组BrdU阳性率26.14％±8.13％较对照组49.53％±11.18％显著降低,G1期细胞较GFP对照组增多,而S期和G2/M期细胞却较对照组减少,Cyclin D1和CDK4的表达水平分别下降54.55％±7.76％和63.26％±15.76％.结论:PSMB5基因沉默能够下调Cyclin D1和CDK4的表达,导致细胞G1/S转换停滞,影响hBMSCs增殖潜能.
关键词： 人骨髓间充质干细胞 20S蛋白酶体β5亚单位 基因沉默 增殖 -
靶向PSMB5基因的shRNA慢病毒载体对神经干细胞增殖和分化潜能的影响
目的:优化20S蛋白酶体β5亚单位(proteasome subunit beta type-5,PSMB5)-shRNA慢病毒感染神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的方案,观察PSMB5表达下调对NSCs增殖和分化能力的影响,探讨调控NSCs潜能的分子机制.方法:构建携带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因的PSMB5-shRNA慢病毒载体,并设错义序列对照,感染新生小鼠(postnatal day 0,P0) NSCs.倒置荧光显微镜观察GFP阳性率,计算感染率,RT-PCR、免疫印迹和荧光分光光度法检测PSMB5沉默效率和蛋白酶体活性.比较对照组和shRNA组神经球的数量和直径,利用CCK-8实验观察PSMB5基因沉默对NSCs增殖潜能的影响.Tuj1染色观察PSMB5基因沉默对NSCs分化能力的影响.结果:PSMB5-shRNA慢病毒感染NSCs24h后可见GFP荧光表达,48 h达峰值,传代后可见GFP稳定表达.其感染复数MOI为40,polybrene 3μg/ml时,感染48 h GFP阳性率可达92.5％±2.3％;PSMB5-shRNA组PSMB5 mRNA和蛋白表达水平分别较对照组降低66.49％ ±4.81％ (P＜0.001)和33.1％±2.54％ (P ＜0.001).PSMB5-shRNA组蛋白酶体活性较对照组下降43.4％±1.48％ (P＜0.01).shRNA组NSCs的增殖能力降低,神经球数量为126.5±8.4显著低于对照组163.5 ±9.5(P ＜0.01),神经球的平均直径为29.9μm±2.6 μm显著低于对照组42.9 μm±2.3μm(P＜0.01).CCK-8结果表明PSMB5-shRNA组细胞吸光度值0.36±0.04,显著低于对照组0.59±0.03(P ＜0.001),PSMB5-shRNA组Tuj1+阳性率为39.13％±8.14％,较对照组显著降低(P＜0.01).结论:PSMB5基因沉默可降低NSCs蛋白酶体活性抑制P0期小鼠NSCs增殖分化能力.
