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腺苷酸激酶4的表达对张氏肝细胞增殖的影响
目的 检测腺苷酸激酶4(adenylate kinase 4,AK4)在张氏肝细胞中的表达及其对张氏肝细胞增殖的影响.方法 用慢病毒介导的RNA干扰法干扰AK4在张氏肝细胞中的表达,Western blot法检测干扰AK4表达后对AKI和AK2表达的影响;细胞计数法检测干扰AK4表达后对细胞增殖速度的影响;流式细胞术检测干扰AK4表达后对细胞周期的影响.结果 AK4在张氏肝细胞中高表达,使用慢病毒干扰AK4表达后,AK1表达下降,AK2表达明显上升;细胞增殖速度明显降低;细胞周期阻滞在S期,G2期细胞明显减少.结论 AK4能够促进张氏肝细胞由S期进入G2期,从而影响细胞增殖.
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TRAIL诱导正常人肝细胞线粒体损伤的实验研究
探讨可溶性TRAIL蛋白对体外培养的正常人肝细胞增殖和凋亡的影响机制.应用体外培养的张氏肝细胞株,分别加入不间浓度的TRAIL蛋白,在不同时间点,用MTT法检测细胞增殖,Annexin V-FITC检测细胞凋亡,荧光显微镜及流式细胞仪检测线粒体损伤情况.结果表明,低浓度TRAIL对肝细胞生长抑制作用不明显,而中高浓度TRAIL作用3 d后对肝细胞有显著的抑制作用.再更换为培养液后,肝细胞生长抑制率均有明显降低.培养24 h后,100 ng/ml TRAIL诱导肝细胞早期凋亡率比对照组显著增加(P<0.05);培养48 h后,20、100 ng/ml TRAIL诱导肝细胞晚期凋亡率分别为(9.1%±2.6%)及(10.7%±2.5%),与对照组相比,具有统计学意义(P<0.05).TRAIL作用12 h后荧光强度明显降低,随着作用时间延长,荧光减弱更明显,表明线粒体损伤严重.结果提示,高浓度TRAIL蛋白通过线粒体损伤途径,诱导张氏肝细胞凋亡.
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Caveolin-1介导张氏肝细胞X射线诱导的DNA损伤修复的信号转导
已知Caveolin-1 (Cav-1)是胞膜窖的重要结构蛋白,通过介导多条信号转导途径广泛参与细胞的生理和病理过程.引人关注的是,Cav-1的表达通常具有组织特异性和功能多样性,在乳腺癌、肝癌等肿瘤的发生和发展中起到重要的调节作用.近年研究表明,Cav-1参与胰腺癌细胞放射引起的DNA损伤修复过程,从而对放疗产生抵抗.但其是否对其它种类细胞的DNA损伤也存在类似作用并不清楚.本文采用RNA干扰技术建立稳定敲低Cav-1表达的张氏肝细胞系(Chang liver cell line,CHL),即CHL-CAV7细胞,旨在探讨Cav-1在CHL细胞DNA损伤修复中的作用.Western blot结果显示,与转染非靶向质粒的对照细胞(CHL-C细胞)相比,CHL-CAV7细胞Cav-1蛋白表达水平被抑制了60％.采用X射线对细胞进行辐射,并对细胞的存活能力及DNA损伤修复相关蛋白的表达水平进行检测.克隆形成实验结果显示,在8和10 Gy X射线照射下,CHL-CAV7细胞的存活能力相对CHL-C细胞明显降低.Western blot结果显示,与CHL-C细胞相比,CHL-CAV7细胞照射后γH2AX蛋白表达量增加,p-ATM、DNA依赖蛋白激酶催化亚单位(DNA-dependent protein kinase,catalytic subunit,DNA-PKcs)和p53蛋白表达量减少.免疫荧光分析结果显示,CHL-CAV7细胞Mdm2和Cav-1的共定位相对CHL-C细胞显著减少.上述结果提示,Cav-1表达下降后,CHL细胞DNA的损伤加重,这可能与Cav-1与Mdm2相互作用减少,进而导致p53的降解增加有关.本文为了解肝细胞的放疗抵抗作用机制提供了一定的实验依据.
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异位过表达Pim-2诱导正常肝细胞恶变的实验研究
目的:研究Pim-2基因异位过表达与肝细胞性肝癌的关系.方法:将转染Pim-2基因质粒(转染组)、对照空质粒(空质粒组)转染张氏肝细胞,并设未转染组,通过MTT实验、流式细胞仪检测、Millicell小室细胞迁移实验、RT-PCR、细胞免疫组织化学及裸鼠体内接种成瘤等方法检测肝细胞在体内外增殖的变化,应用光学显微镜和透射电镜(TEM)观察细胞形态.结果:(1)转染组细胞形态发生明显变化,细胞接种48、72、96、120 h的平均OD值、细胞凋亡率、细胞迁移的平均细胞数与空质粒组相比差异有统计学意义(P＜0.05),而空质粒组与未转染组比较差异无统计学意义(P＞0.05);(2)转染组细胞Pim-2mRNA表达明显高于空质粒组、未转染组;转染组细胞胞质、胞核均有Pim-2蛋白表达,空质粒组、未转染组表达转弱;(3)3组细胞接种裸鼠后,成瘤组织光学显微镜及TEM均见明确肿瘤细胞形态改变.结论:Pim-2基因能够诱导张氏肝细胞恶性转变,造成细胞在形态、生长、增殖、凋亡及迁移能力的改变.
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解偶联蛋白2过表达张氏肝细胞的构建及其对线粒体膜电位和活性氧的影响
目的 构建稳定过表达人解偶联蛋白2 (UCP2)的张氏肝细胞株,观察UCP2对线粒体膜电位(MMP)和活性氧(ROS)的作用. 方法 将含有人UCP2 cDNA全长的重组质粒(pcDNA3.1-hU CP2)转染张氏肝细胞系,pcDNA3.1空载体作为对照.Zeocin筛选稳定表达UCP2的细胞株,Western blot和免疫细胞化学鉴定UCP2蛋白表达.利用不同剂量UCP2抑制剂京尼平(25、50、100μmol/L),预处理稳定表达UCP2的细胞株.荧光分光光度法检测MMP和ROS水平变化.数据分析用单因素方差分析和q检验(Newman-keuls法),P＜0.05为差异有统计学意义.结果 pcDNA3.1-hU CP2成功转染张氏肝细胞,UCP2相对表达量约为对照组的1.6倍.过表达细胞罗丹明123和2 ′,7 ′ -二氯氢化荧光素二脂荧光强度(分别为11.11±2.76和4.97±0.62)均明显低于正常对照组张氏肝细胞(分别为15.56±2.55和6.14±1.25,q值分别为4.80和3.35,P＜0.01和P＜ 0.05)和空载体对照组肝细胞(分别为16.11±2.93和6.23±1.13,q值分别为5.40和3.60,P＜0.01和P＜ 0.05)；空载体组上述两指标与正常对照组相比,差异均无统计学意义.京尼平低、中、高剂量组与过表达组相比,罗丹明123的荧光强度(分别为14.89±2.89,17.89±2.93,24.00±2.55,q值分别为4.08,7.33和13.93,P值均＜0.01)和2 ′,7 ′-二氯氢化荧光素二脂的荧光强度(分别为9.16±0.78,10.84±1.09, 11.83±1.25,q值分别为12.00,16.83和19.67,P值均＜0.01)均明显升高,并呈现剂量依赖性.结论 成功构建稳定过表达人U CP2的张氏肝细胞株,UCP2表达水平及活性变化可通过MMP和ROS影响线粒体功能.
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肝细胞氧化损伤中MAPK蛋白活化的变化
目的 观察过氧化氢(H2O2)所致肝细胞氧化应激损伤中丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)蛋白表达的变化规律.方法 用H2O2刺激张氏肝细胞制备肝细胞氧化应激损伤模型,利用蛋白印迹法观察细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)蛋白及其磷酸化蛋白表达情况.结果 H2O2时间依赖性地诱导肝细胞MAPK蛋白磷酸化,JNK及ERK活化水平较高,在0.5h迅速达到高峰;p38 MAPK早期活化程度不高,其活化从8h开始显著增高并持续至24h.结论 过氧化氢所致张氏肝细胞氧化应激损伤中MAPK蛋白均被激活,但三者活化水平随时间的变化趋势存在差异.
关键词： 过氧化氢(H2O2) 张氏肝细胞 丝裂原活化蛋白激酶 -
肝细胞氧化损伤中氧化应激指标的动态变化
目的:观察H2O2所致肝细胞损伤中氧化应激指标的动态变化.方法:用H2O2诱导制备肝细胞损伤模型,噻唑蓝法检测细胞生长抑制率;比色法测定培养液乳酸脱氢酶(LDH)活性、细胞超氧化物歧化酶(SOD)活性、还原型谷胱甘肽(GSH)及丙二醛(MDA)含量.结果:H2O2可时间依赖性抑制肝细胞增殖,增高LDH向培养液的释放,升高肝细胞MDA含量,降低肝细胞SOD和GSH水平.结论:H2O2刺激2～24 h可成功构建肝细胞损伤模型,氧化应激时间依赖性增高.
