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双顺反子表达载体DV的构建及其表达效率
目的 构建双顺反子表达载体DV,并检测其表达效率.方法 以载体VR1012为模板,PCR扩增BGH基因和启动子CMV-intronA基因片段,分别连接至载体VR1012启动子和终止子之间的相应位点上,构建双顺反子表达载体DV.另以质粒pshuttle-luciferase为模板,PCR扩增报告基因luciferase片段,分别连接至DV的两个启动子后,得到质粒DV-luc1和DVluc2.将质粒DV-luc1、DV-luc2和阳性质粒pshuttle-luciferase分别转染COS-7细胞,Western blot检测lucfferase蛋白的表达情况,荧光酶标仪检测luciferase降解底物的水平.结果 双顺反子表达载体DV经双酶切鉴定证明构建正确；转染重组质粒DV-luc1和DV-luc2的COS-7细胞中均有luciferase的表达,且表达效率DV-luc2略高于DV-luc1.结论 已成功构建了双顺反子表达载体DV,且载体的第2个启动子的启动效率略高于第1个启动子,为基因治疗、转录调控、多价疫苗等的研究奠定了基础.
关键词： 双顺反子 启动效率 CMV启动子 luciferase报告基因 -
人Tim-3启动子的克隆及其真核报告质粒的构建
目的 克隆人Tim-3基因5'端非编码区处具有启动子活性的片段,构建其真核报告质粒,为进一步研究Trm3表达调控奠定基础.方法 以人基因组DNA为模板,针对人Ttm-3启动子5'端非编码区处包括翻译起始点ATG和转录起始点TSS在内的-898～+242片段,设计特异性引物,PCR扩增该片段,命名为Tnn-3P2,经双酶切后克隆入pGL3-Basic裁体SacI、XhoI位点,构建pGL3-Tim-3P2荧光素酶报告质粒,与内参照pRL-TK用脂质体法瞬时共转染COS-7、RAW264.7和B16细胞系,通过双荧光素酶活性检测确定其启动子活性.结果 pGL3-Tim-3P2经Ⅸ淑、双酶切及DNA测序分析鉴定正确无误;pGL3-Tim-3P2转染RAW264.7和B16细胞(两种细胞均可表达内源性Tim-3)24h和48h,双荧光素酶活性检测显示其启动子相对活性约为pGL3-Basic空载体的2倍;而pGl3-Tim-3P2转染不表达内源性Tim-3的COS-7细胞后检测不到荧光素酶活性.结论 成功克隆并构建含有人Tim-3启动子的真核报告质粒,该载体具有特异性Tim-3启动子活性,为进一步研究Tim-3表达调控奠定了基础.
关键词： 基因 Tim-3 人 启动子 luciferase报告基因
