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RNA干扰P115基因对胃癌细胞巨噬细胞移动抑制因子表达的抑制作用
目的 构建高尔基体转运蛋白P115基因shRNA表达载体,探讨P115基因沉默对胃癌细胞株BGC-823中巨噬细胞移动抑制因子(Macrophage migration inhibitory factor,MIF)表达的影响.方法 设计4对针对P115基因的shRNA序列,构建重组表达质粒,转染高表达P115的胃癌细胞株BGC-823.RT-PCR、Western blot和免疫细胞化学检测P115及MIF的mRNA 和蛋白的表达.结果 4个P115基因shRNA质粒经单酶切和测序证实构建正确;转染BGC-823细胞后,均能抑制P115基因的表达,其中以pGPU6/GFP/Neo-shP115-2的沉默效果好,其对P115基因mRNA表达的抑制率为75.07%,对P115蛋白表达的抑制率为70.97%;转染pGPU6/GFP/Neo-shP115-2后,MIF基因的mRNA及蛋白表达水平均明显降低(P<0.05).结论 P115基因沉默后,BGC-823细胞MIF的表达明显降低,提示P115可能参与调节胃癌细胞MIF的表达,P115基因可作为研究胃癌发生发展分子机理的新靶点.
关键词： 胃肿瘤 高尔基体转运蛋白 巨噬细胞移动抑制因子 RNA干扰 -
人P115基因重组真核表达质粒的构建及其对肝癌细胞增殖的影响
目的 构建人P115基因重组真核表达质粒,并探讨其过表达对人肝癌细胞HepG2增殖活性的影响.方法 采用RT-PCR从HepG2细胞中扩增人P115基因,插入pEGFP-N1 Vector(+)载体,构建重组真核表达质粒pEGFP-N1 Vector(+)-USO1,将重组质粒转染至HepG2细胞,免疫荧光及流式细胞术检测转染效率;RT-PCR及Western blot检测转染细胞中P115基因及蛋白的表达;MTT法检测转染细胞的增殖活性、流式细胞术检测细胞周期变化.结果 重组真核表达质粒pEGFP-N1 Vector(+)-USO1经酶切鉴定及测序证明构建正确;重组质粒转染HepG2细胞的转染效率达84.83%;重组质粒转染的HepG2细胞中P115基因和蛋白的表达水平及细胞增殖活性均明显高于空载体转染和未转染的细胞;重组质粒转染的细胞G1/G2期比例明显减少,S期比例明显增加.结论 已成功构建了人P115基因重组真核表达质粒,其在肝癌细胞中过表达P115可促进肝癌细胞增殖.
