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埃可病毒9型分离株MSH-KM812 VP1基因的遗传特征
目的 分析2010年昆明市引起手足口病(Hand,foot and mouth disease,HFMD)的病原埃可病毒9型(Echo virus 9,E9)分离株MSH-KM812 VP1基因的遗传特征.方法 分别采用RD细胞和Hep-2细胞对3份HFMD患儿粪便标本进行病毒分离,应用RT-PCR法分2段扩增病毒VP1基因,并进行序列测定.应用NCBI BLAST软件对所测定的节段序列进行比对；Omiga软件对所测定的节段序列的核苷酸及推导的氨基酸序列进行编辑、比对和拼接；应用Mega 5.05软件进行序列分析,并与15个E9参考株的VP1基因序列进行比较,构建基因系统进化树.结果 从3份HFMD患儿粪便标本中分离到1株E9,命名为MSH-KM812,其VP1区的核苷酸长度为888 bp.MSH-KM812株与其他15个E9参考株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为78.6％ ～ 98.0％和87.5％ ～ 99.3％,与中国分离株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为92.7％～98.0％和97.0％ ～ 99.3％,其中与中国江苏分离株M10MF37 China 2010核苷酸和氨基酸序列同源性高,分别为98.0％和99.3％,而与德国分离株Hill的核苷酸和氨基酸序列同源性低,分别为78.6％和87.5％.基因进化树分析显示,MSH-KM812分离株与中国江苏分离株M10MF37 China 2010和中国山东分离株05189-SD-CHN-2005-E9属于同一个进化分枝.结论 MSH-KM812分离株为E9,与中国其他分离株同属一个进化分枝.
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某幼儿园一起脑炎疫情流行病学及病原研究
目的 查明杭州某县市一家幼儿园无菌性脑炎疫情的流行病学特征及病原.方法 通过查阅幼儿园晨检、因病缺课记录;某医院发热门诊就诊记录和现场个案调查展开流行病学调查.采集患儿粪便、血清标本先通过荧光RT-PCR和ELISA方法初筛,然后选肠道病毒通用阳性标本进行病毒分离、培养;通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)鉴定上述培养物,并扩增埃可病毒9型(简称ECHO-9)VP1区全长基因和序列测定,利用生物信息学软件对序列进行分析,构建基因进化树.结果 该幼儿园共累计报告病例18例,发热、头痛、呕吐为主要症状.从采集的7份样本中分离到ECHO阳性毒株2株,VP1基因全序列测定结果显示其与ECHO-9代表株核苷酸和氨基酸的相似性高,分别为73.5％ ～ 93.6％、85.4％ ～ 97.0％.结论 引起此次疫情的病原为ECHO-9.进化树分析表明与近年来已报道的ECHO-9相比有一定的亲缘关系.
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埃可病毒9型VP1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备
目的 原核表达并纯化埃可病毒9型(ECHO9) VP1蛋白,免疫兔子制备多克隆抗体,鉴定重组蛋白的免疫活性,为ECHO9血清学检测试剂和疫苗研究提供依据.方法 PCR方法扩增VP1基因,构建原核表达质粒pET28a-VP1并转化到大肠杆菌(E.coli BL21),诱导表达并纯化VP1重组蛋白,免疫兔子制备抗VP1多克隆抗体,ELISA检测抗VP1抗体效价,Western blot鉴定抗体特异性.病毒中和试验鉴定抗体中和ECHO9病毒的能力.结果 VP1重组蛋白在大肠杆菌BL21中高效表达,制备的抗VP1抗体效价为1∶105.Western blot检测结果显示,抗VP1多克隆抗体可以识别原核表达的VP1蛋白.中和试验显示抗体对ECHO9病毒有中和作用,其效价为1∶10.结论 本研究成功原核表达了ECHO9的VP1蛋白并制备出抗VP1多克隆抗体,有助于ECHO9的临床诊断、疫苗开发和分子病毒学研究.
