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海藻糖合成酶基因的克隆及原核表达
目的 克隆海藻糖合成酶(Trehalose synthase,Tres)基因,并在大肠杆菌中表达重组酶.方法 以长白山温泉The rmus thermophilus SH-110基因组DNA为模板,PCR扩增Tres基因,克隆至原核表达载体pET-30a(+)中,构建重组表达质粒pET-30a(+)-Tres,转化E.coli BL21(DE3),分别采用IPTG和乳糖诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE、Western blot和薄层色谱(Thin layer chromatography,TLC)分析.结果 重组表达质粒pET-30a(+)-Tres经双酶切及测序证实构建正确;IPTG和乳糖均能诱导重组蛋白的表达,且乳糖诱导的蛋白表达量较高;表达的重组酶Tres相对分子质量约为110 000,可与鼠抗6×His单克隆抗体特异性结合;粗酶液的酶活力为8 760 U/μg,是野生菌酶活的10倍;重组酶水解麦芽糖产物经TLC分析证实,其具有较强的海藻糖合成酶活性.结论 已成功在大肠杆菌中表达了重组Tres,为大规模生产海藻糖奠定了基础.
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密码子优化提高海藻糖合成酶基因在大肠杆菌中的表达水平
目的 优化灰色链霉菌海藻糖合成酶(Trehalose synthase,TreS)基因密码子,提高海藻糖合成酶大肠杆菌基因工程菌株表达水平.方法 基于大肠杆菌基因组密码子偏好数据表对tres基因进行密码子优化得基因tres1.基因工程法构建分别含tres及tres1基因的表达载体pET-26b(+)-tres和pET-26b(+)-tres1,CaCl2法转入大肠杆菌BL21(DE3)获得表达海藻糖合成酶的大肠杆菌基因工程菌株,采用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,对摇瓶发酵粗酶液进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析及酶活性测定以确定表达水平.结果 1707 bp海藻糖合成酶tres基因共优化碱基序列268 bp,优化后序列的GC含量由65.8％降低至54.4％,密码子适应指数(CAI)由0.37提升至0.97,SDS-PAGE及酶活性分析表明,含pet-26b(+)-tres1表达载体的大肠杆菌基因工程菌株海藻糖合成酶蛋白表达量高,酶活性比含pet-26b(+)-tres工程菌提高60.3％ 以上.结论 密码子优化可有效提高海藻糖合成酶TreS蛋白在大肠杆菌中的表达,为海藻糖合成酶的异源高效表达提供了重要参考.
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海藻糖合成酶活性测定方法的研究
目的 研究一种测定海藻糖合成酶活性的方法.方法 用薄层色谱法定性分析海藻糖合成酶反应体系中的海藻糖,用α-葡糖苷酶将麦芽糖水解为葡萄糖,DNS法测定还原糖,差值法计算海藻糖合成酶活性.结果 获得了海藻糖合成酶活性的定性、定量分析方法,成功测定出粗酶液中海藻糖合成酶的活性.结论 此方法设备简单,易于同时测定较多的样品,适用于实验室选育海藻糖合成酶产生菌时大量样品的测定.
