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衔接蛋白2敲除对AT1受体介导的AngⅡ内吞的影响
目的 通过RNAi沉默AP2-μ2亚单位的表达,观察其是否影响AT1R介导的AngⅡ内吞.方法 通过设计构建的AP2-μ2 RNAi表达载体,转染H9C2细胞,通过Western印迹验证沉默效果;激光共聚焦显微镜观察沉默AP2-μ2基因对AT1R介导的AngⅡ内吞的影响.结果 蛋白质水平检测siRNA重组质粒对AP2-μ2蛋白表达的影响,可见pSH1Si-AP2 plasmid-1表达质粒可明显抑制AP2-μ2蛋白表达.给予AngⅡ不同时间点,可见其在15 min时受体内吞至胞内数量多.重组质粒沉默AP2-μ2亚单位后,外源加入AngⅡ后,可明显抑制AT1R介导的AngⅡ内吞. 结论 AT1R介导AngⅡ内吞的发生,与其他GPCR一样,主要通过网格蛋白依赖的内吞方式进行,并且需要AP2蛋白参与.
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衔接蛋白2基因siRNA表达载体的构建及鉴定
目的:构建针对衔接蛋白2的μ2亚单位 (AP2-μ2) 的短链干涉RNA(siRNA)及其表达载体,转染细胞后观察其对AP2-μ2基因的干涉作用.方法:设计AP2-μ2靶向的发夹状siRNA,据此设计合成3条互补的寡核苷酸链,退火后分别连接到 pSilencer 3.1 neo H1 载体,转化扩增后进行序列测定.待转染细胞分为对照组、Scramble plasmid、AP2 plasmid-1,AP2 plasmid-2 和 AP2 plasmid-3组.用脂质体转染法将3组 siRNA 重组质粒与阴性对照质粒 (Scramble plasmid) 转染大鼠心肌细胞株H9C2,通过RT-PCR法检测 AP2-μ2基因表达水平的变化.结果:合成的6条寡核苷酸单链凝胶电泳显示多个电泳条带,分别退火后,产物经凝胶电泳显示形成单一条带.双链DNA模板与载体质粒连接后,用BamH I和HindⅢ双酶切,凝胶电泳可见4 300和66 bp的酶切片段.DNA测序连接的核酸序列与设计序列一致,表明AP2-μ2基因的3条 siRNA 载体构建成功.RT-PCR检测,在AP2 plasmid-1组,转染的H9C2细胞中AP2-μ2的基因表达水平较阴性对照组降低约96%.结论:成功地构建了针对AP2-μ2基因的3条siRNA载体,其中AP2 plasmid-1 转染细胞后可显著抑制AP2-μ2 基因表达.
