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Rab7GTPase负向调节巨噬细胞中poly I:C诱导的细胞因子的表达
目的:通过构建Rab7的失活突变载体tRab7(Rab7T22N),研究Rab7失活突变后对poly I:C诱导的RAW264.7巨噬细胞中细胞因子的影响.方法:利用PCR定点突变法构建Rab7的失活突变载体Rab7T22N,将Rab7的真核表达载体及其突变体tRab7通过脂质体法瞬时转染RAW264.7细胞,通过Western blot方法检测Rab7的表达情况.poly I:C刺激转染细胞不同时间后检测细胞因子IFN-β、IP10、TNF-α和IL-1β的表达变化.结果:Western blot检测结果显示,与转染空质粒的对照细胞相比,转染Rab7和tRab7的细胞中Rab7的蛋白水平显著增高.Rab7过表达后,抑制了巨噬细胞RAW264.7中poly I:C刺激后IFN-β、IP10、TNF-α和IL-1β的产生,而Rab7失活突变体tRab7(Rab7T22N)过表达后显著促进了IFN-β、IP10、TNF-α和IL-1β的表达.结论:Rab7抑制了poly I:C刺激的巨噬细胞中IFN-β、IP10、TNF-α和IL-1β的表达,该抑制作用依赖于其GTP结合活性.本研究为进一步阐明Rab7在TLR3信号转导通路中的作用奠定了基础.
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Poly I: C刺激下原发性干燥综合征患者单核细胞分泌Ⅰ型干扰素能力增强
目的:研究在Poly I:C刺激下原发性干燥综合征(pSS)患者单核细胞分泌Ⅰ型干扰素的能力.方法:分别以50 μg/ml和100 μg/ml的Poly I:C刺激pSS和健康个体的单核细胞,于刺激后第6和第12小时采用ELISA法检测培养基内IFN-α和IFN-β水平.分别用pSS患者和健康个体的血清培养来自二者的单核细胞,并用50 μg/ml的Poly I:C刺激12小时后 ELISA法检测培养基内IFN-α和IFN-β水平.结果:Poly I:C能够诱导pSS患者和健康个体的单核细胞呈时间和计量依赖性地释放IFN-α和IFN-β,pSS患者释放IFN-α和IFN-β的能力强于健康个体.pSS血清可以增强Poly I:C诱导单核细胞释放IFN-α和IFN-β的能力.结论:pSS患者单核细胞Poly I:C刺激下分泌Ⅰ型干扰素能力增强,而患者血清可以进一步增强其反应性.天然免疫应答异常可能在pSS发病机制中发挥重要作用.
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Poly I:C对结肠炎小鼠肠黏膜通透性的影响
目的 探索Poly I:C对结肠炎模型小鼠肠黏膜通透性的影响.方法 30只小鼠随机分为正常组、模型组和Poly I:C组各10只,建立结肠炎小鼠模型;观察各组的一般情况、体质量变化及结肠病理学表现,应用偶氮基质显色法测定血清脂多糖(LPS)含量,采用异硫氰酸荧光素标记的右旋葡聚糖(FITC-D,MW.4000)及细菌移位方法来检测肠黏膜通透性,免疫组织化学染色测定结肠组织中紧密连接蛋白ZO-1、claudin-1的变化.结果 实验期间,与正常组相比较,模型组小鼠体质量出现下降,饮水和进食明显减少且结肠黏膜缺损,腺体破坏或消失,可见黏膜、黏膜下层甚至肌层大量炎性细胞浸润;给予Poly I:C治疗后,小鼠的体质量回升明显,且结肠组织炎性细胞浸润较少,症状明显减轻.相较于模型组,Poly I:C组血清中LPS的含量、细菌移位率及FITC-D渗透率均降低.相较于正常组,ZO-1、claudin-1细胞在模型组中表达明显降低且染色强度减弱.但给予Poly I:C治疗后,ZO-1和claudin-1细胞的染色强度显著升高.结论 Poly I:C可降低急性期溃疡性结肠炎模型小鼠结肠黏膜的通透性.
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CD11b+NKT细胞抑制Poly I:C诱导小鼠肝损伤中CD8+T细胞增殖反应
目的:研究Poly I:C诱导的肝损伤模型中肝脏内上调的CD11b+ NKT细胞对CD8+T细胞增殖反应的作用.方法:经腹腔注射Poly I:C(20μg/g)制备Poly I:C诱导小鼠肝损伤模型,流式细胞术检测CD11b+ NKT细胞的比例、T细胞增殖反应和CD8+T细胞的杀伤功能,ELISA法检测细胞培养上清中的细胞因子浓度.结果:Poly I:C诱导的肝损伤模型小鼠的肝脏中CD11b+ NKT细胞的比例显著上升[(71.7±5.3)％vs(12.4±3.6)％,P＜0.01].细胞因子表达谱分析发现,CD11b+ NKT细胞分泌IFN-γ、IL-4和IL-10的能力显著低于CD11b-NKT细胞.功能分析发现,CD11b+ NKT细胞能够显著抑制anti-CD3/CD28单抗诱导非特异性的和OVA特异性的CD8+T细胞增殖反应,而CD11b-NKT细胞没有此抑制功能;进一步分析发现,CD11b+ NKT细胞并不影响CD8+T细胞的杀伤功能.结论:Poly I:C诱导的肝损伤模型小鼠肝脏中CD11b+NKT细胞比例升高,该细胞能够负反馈抑制CD8+T细胞的增殖反应,但是并不影响CD8+T细胞的杀伤功能.
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Poly IC对急性期溃疡性结肠炎小鼠免疫机制的影响
目的:研究Poly I:C(Polyinosinic-polycytidylic acid)对急性期溃疡性结肠炎模型小鼠免疫机制调节作用.方法:30只小鼠随机分为正常组(control)、模型组(model)、Poly I:C组(Poly I:C),建立急性溃疡性结肠炎动物模型;观察小鼠疾病活动指数(DAI)、结肠病理学变化、流式细胞术检测T淋巴细胞亚群变化、免疫比浊法检测血清免疫球蛋白变化、免疫组织化学染色测定结肠组织ICAM-1变化;结果:经Poly I:C治疗后模型小鼠的疾病活动指数及病理组织评分明显下降;与model组比较,Poly I:C组免疫细胞反应明显减轻弱,结肠组织ICAM-1蛋白表达明显降低.结论:可见Poly I:C对急性溃疡性结肠炎模型小鼠有免疫调节作用.
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MUC1蛋白在侵袭性垂体腺瘤表达及其诱导抗肿瘤免疫反应的研究
目的 探讨MUC1蛋白在侵袭性和非侵袭性垂体腺瘤中的表达及其诱导的抗肿瘤免疫反应. 方法 收集滨州医学院附属医院及山东大学齐鲁医院神经外科自2009年3月至2014年12月手术切除的人垂体腺瘤标本86例,其中侵袭性垂体腺瘤42例,非侵袭性垂体腺瘤44例,采用免疫组化染色、Western blotting检测标本MUC1蛋白的表达;术前取患者外周全血400 mL,分离外周血单个核细胞(PBMC)并诱导培养树突状细胞(DCs),将DCs分为MUC1组、5 μg/mL polyI:C组、25 μg/mL poly I:C组、50 μg/mL poly I:C组、脂多糖(LPS)组、对照组,分别加入100 μL 50μg/mL MUC1、5μg/mL poly I:C、25 μg/mL poly I:C、50 μg/mL poly I:C、50 μg/mL LPS和100 μL溶剂,培养48 h后ELISA法检测上清液中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素(IL)-1β、Ⅱ-6的浓度;将DCs分为PBS对照组、poly I:C组、MUC1+poly I:C组,分别加入100 μL PBS、50 μg/mL poly I:C、50μg/mL MUC1+50 μg/mL poly I:C,培养48 h后流式细胞仪(FCM)检测细胞CD40、CD80、CD83、CD14、组织相容性基因位点抗原DR(HLA-DR)的表达;C57BL/6小鼠24只按随机数字表法分为MUC1组、MUC 1+poly I:C、PBS对照组,每组8只,分别在第1、15天皮下注射1 mL 50 μg/mLMUC1抗原、50μg/mL MUC1抗原+50 μg/mL poly I:C和PBS.注射后7d取各组小鼠脾细胞(CTL)加入到体外培养的小鼠垂体瘤细胞AtT20中,D-乳酸脱氢酶(D-LDH)释放试剂盒检测各组CTL的杀伤活性. 结果 侵袭性和非侵袭性垂体腺瘤中MUC1表达阳性率分别为90.4％(38/42)、20.5％(9/44),MUC1蛋白在侵袭性垂体腺瘤中表达(2.0353±0.0359)高于非侵袭性垂体腺瘤(0.3488±0.0205),差异有统计学意义(P＜0.05);ELISA检测显示MUC1组、5μg/mL poly I:C组、25 μg/mL polyI:C组、50 μg/mL poly I:C组DCs上清液中3种细胞因子的浓度均依次增加,差异有统计学意义(P＜0.05);FCM检测显示PBS对照组、poly I:C组、MUC1+poly I:C组细胞CD14的表达依次减少,CD40、CD80、CD83、HLA-DR的表达依次增加,差异有统计学意义(P＜0.05).D-LDH释放试剂盒检测结果显示PBS对照组、MUC1组、MUC1+poly I:C小鼠CTL细胞活性依次增加,差异均有统计学意义(P＜0.05). 结论 MUC1蛋白在侵袭性垂体腺瘤中表达较高,MUC1 +poly I:C可以有效的诱导抗肿瘤免疫反应,抑制侵袭性垂体腺瘤的进展.
