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人β-地中海贫血CD41-42型突变基因慢病毒载体的构建和293T的转染
目的:构建介导人β-地中海贫血CD41-42突变基因为目的基因的慢病毒载体,为基因治疗的细胞模型和转基因小鼠的建立提供基础.方法:抽提β-地中海贫血CD41-42突变纯合子患者的DNA,设计合成相应特异性引物,PCR扩增CD41-42突变基因,加上SphI和NotⅠ两个酶切位点进行T载体克隆,通过筛选获得重组质粒.用限制性内切酶将目的基因片段和LV5慢病毒载体连接,转入感受态细胞,筛选获得慢病毒表达载体LV5-βCD41-42,并进行测序.将慢病毒载体转染293T细胞,包装病毒,测定病毒浓度.结果:通过PCR获得长度为2128bp带有SphⅠ和NotⅠ序列的目的基因.pUC57载体和慢病毒表达载体LV5连接,慢病毒表达载体LV5-βCD41-42构建成功,序列正确.结论:成功构建并包装含β-地中海贫血CD41-42突变基因的人慢病毒.
关键词： β-地中海贫血 CD41-42突变基因 慢病毒 293T细胞 -
CD41-42突变型β地中海贫血重组载体pEGFP-C2-CD41-42的构建及其稳定转染HeLa细胞模型的建立
目的:构建CD41-42突变型β地中海贫血重组载体pEGFP-C2-CD41-42和HeLaCD41-42细胞模型,为β地中海贫血CD41-42突变型细胞、小鼠模型建立及进一步基因治疗提供依据.方法:在β地中海贫血CD41-42突变的纯合子患者外周血中提取DNA,PCR法扩增含有βCD41-42的β-珠蛋白基因片段.将PCR产物βCD41-42珠蛋白基因克隆到pEGFP-C2载体中,用脂质体2000将pEGFP-C2-βCD41-42质粒转染HeLa细胞,观察转染后βCD41-42在HeLa细胞中荧光表达情况.RT-PCR法检测βCD41-42在HeLa细胞中的表达.结果:重组质粒pEGFP-C2-βCD41-42转染HeLa细胞24 h后细胞发出绿色荧光,G418筛选后,有大量荧光表达.RT-PCR扩增得到227 bp的特异性条带,而稳定转染pEGFP-C2空质粒的HeLa细胞中不表达特异性条带.结论:成功构建β地中海贫血pEGFP-C2-βCD41-42突变基因重组载体,并成功构建HeLaCD41-42细胞模型.
关键词： β地中海贫血 CD41-42突变基因 重组载体 Hela细胞
