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三种荧光染料 SYBR GreenⅠ、LCGreen PLUS、EvaGreen在实时定量 PCR应用中的比较
目的：探讨定量PCR中三种荧光染料SYBR GreenⅠ、LC Green PLUS、EvaGreen定量效果的差异。方法以三个样品基因组DNA为模板，应用巢氏PCR法先扩增G6PDH大片段，纯化回收产物，定量，并分别以10倍、5倍和2倍倍比稀释，作为定量PCR制作标准曲线的模板。应用real－time PCR仪指定试剂盒检测模板质量，再分别以含有相同Taq酶并分别含有SYBR GreenⅠ、LC Green PLUS、EvaGreen染料的试剂进行小片段定量PCR扩增，每个浓度3复孔。标准曲线拟合，结果分析用仪器自带分析软件完成。结果应用三种荧光染料获得的标准曲线回归系数≥0．98（除1个样品为0．97），10倍、5倍梯度稀释标准曲线PCR效率为0．8～1．0，2倍稀释标准曲线PCR效率应用SYBR GreenⅠ有2／3样品＞1．2，而后两种染料为0．9～1．2。应用SYBR GreenⅠ较另两种染料的标准曲线误差较大，且样品间分散度也较大。结论在定量PCR中饱和染料LC Green PLUS、EvaGreen的定量效果好于SYBR GreenⅠ。
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EVAGreen实时荧光定量PCR检测类志贺邻单胞菌的方法建立
目的 建立实时荧光定量PCR快速检测类志贺邻单胞菌的方法.方法 以类志贺邻单胞菌23S rRNA基因为目标设计引物,使用EVAGreen染料建立实时荧光定量PCR方法并优化反应条件,构建重组质粒作为标准DNA,建立标准曲线；评估该方法的灵敏度、重复性和特异性,并将所建方法用于粪便模拟样品的检测,与常规培养法比较.结果 在反应体系为10μl,模板为1μl的条件下,该方法可测的低拷贝数为2.18×101拷贝/体系；重组质粒标准建立的标准曲线具有较大的线性范围(108～102 copies/μl)；批间差异小于5％,批内差异小于3％；特异性试验中类志贺邻单胞菌检测结果均为阳性,其他常见肠道致病菌、常见弧菌以及常见正常肠道菌均为阴性；粪便模拟样品前增菌处理后检测灵敏度为25 cfu/10 ml增菌液,检测结果和传统培养法相符.结论 成功建立EVAGreen实时荧光定量PCR方法,该方法的建立为类志贺邻单胞菌的检测提供了一种简便、快捷的途径,并可对样品中类志贺邻单胞菌进行快速定量检测.
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EvaGreen实时荧光定量PCR检测猪细小病毒方法的建立
目的 建立以EvaGreen为染料的实时荧光定量PCR检测猪细小病毒(PPV)的方法,为血液制品中病毒去除效果的工艺验证提供高效准确的技术平台.方法 根据PPV的VP2基因保守序列,设计并合成引物.对目的片段进行PCR扩增,将扩增的PPV病毒VP2基因片段克隆入PMD19-T载体,重组质粒PMD19-T-VP2经测序鉴定正确后,作为标准品模板,用于标准曲线的绘制和该实时荧光定量PCR方法的灵敏度、特异性和重复性检测的材料.结果 应用重组质粒PMD19-T-VP2制作的荧光定量PCR扩增曲线循环阈值与模板浓度具有良好的线性关系;该方法检测灵敏度的下限能达到102copies/μl;与其他DNA病毒和同种属的细小病毒无明显的交叉反应;连续重复检测高、中、低浓度样品,批内批间变异系数小,重复性好.结论 以EvaGreen为染料的实时荧光定量PCR检测PPV的方法提高了检测灵敏度,缩短了工艺验证的时间.
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PCR-HRM技术在华法林佳用药剂量关联基因单核苷酸多态性检测中的应用
目的 新研究显示华法林佳用药剂量关联基因CYP2C9,CYP4F2和VKORC1可指导临床个体化用药,该成果的临床应用有赖于临床快速分子诊断方法的建立,为此该论文建立PCR-HRM(High-resolution melting)技术检测华法林佳用药剂量关联基因单核苷酸多态性(SNP)并进行应用评价.方法 采用国际前沿的基因突变筛查技术-HRM和新型荧光染料Eva Green对华法林佳用药剂量关联基因CYP2C9*2,CYP2C9*3,CYP4F2 V433M和VKORC1 1173C/T四个SNP位点先进行染料法荧光PCR,接着进行PCR产物的高分辨熔解,依据熔解峰的特点进行SNP分型即PCR-HRM技术建立,后通过检测临床181例标本进行临床应用评价.结果 在181例服用华法林的患者中检测到CYP2C9*2杂合子2例,CYP2C9*3杂合子15例,CYP4F2 V433M杂合子74例,纯合子14例,VKORC1 1173C/T杂合子33例.随机选择各类基因型PCR产物共24例进行测序,验证结果与检测结果一致.结论 PCR-HRM技术检测华法林佳用药剂量关联基因SNP是一种灵敏、简便、快捷的低成本检测方法,可用于临床常规化分子诊断.
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无标记探针技术检测IL-6基因启动子单核苷酸多态性
目的:探讨无标记探针技术检测IL-6基因启动子单核苷酸多态性(SNP)的实用性.方法:采用新型荧光染料EvaGreen和无标记探针技术对IL-6基因启动子SNP进行基因分型.以其-597G>A位点为例设计PCR扩增引物和无标记探针,按PCR扩增效率和产物特异性进行Mg2+浓度、不对称PCR引物比例以及模板浓度等条件的优化.并用此优化体系基因分型100例临床标本,杂合型与突变型以测序验证.结果:结果显示EvaGreen荧光PCR检测体系是适Mg2+浓度为2.5 mmol/L,不对称PCR引物比例为0.1/0.5 μmol/L,模板浓度为10 ng/10 μL的两步法不对称PCR.该体系对100例样本进行IL-6基因-597G>A位点基因分型,发现7例杂合型和1例突变型,经测序与检测结果一致.结论:无标记探针技术检测基因SNP是一种值得推广的简便易行、低成本、常规化的基因分型方法.
