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Caco-2建立肠黏膜屏障模型及其在通透性研究中的应用
目的：利用 Caco-2细胞建立体外肠黏膜屏障模型,系统评价并初步探讨其在炎症损伤后黏膜通透性改变中的应用。方法体外培养 Caco-2细胞,接种于 Transwell 板上,每日观察细胞形态；自培养第5天起,隔日测细胞膜的跨上皮电阻(transepithelial electrical resistance,TEER)；对于 TEER 值达标准的孔测定荧光黄透过率,进行透射电镜的完整性验证。应用培养21 d 的 Caco-2细胞屏障,加入不同浓度(0、50、100、200 nmol /L)的血小板活化因子(platelet-activating factor,PAF)孵育24 h,光镜、电镜观察形态学改变,检测 TEER 和荧光黄透过率,应用间接免疫荧光和 Western blot 观察 ZO-1蛋白的分布及表达。结果Caco-2细胞单层 TEER 从第5～15天逐渐增加,在第15天已经达到600Ω?cm2,平台期保持至第21天；在此期间,细胞形成紧密单层,电镜下细胞呈高分化,细胞间形成紧密连接,绒毛整齐,极性形成；荧光黄透过量极低,体外肠上皮细胞屏障形成。加入 PAF 后,以100 nmol /L 对黏膜屏障通透性影响大：电镜下见紧密连接结构破坏、断裂,细胞表面微绒毛脱落、稀疏；免疫荧光可见紧密连接的标志蛋白 ZO-1荧光信号减弱,ZO-1环断裂,胞浆内可见阳性染色,提示其向膜下转移。此时,TEER 值下降,荧光黄透过量明显增加,与对照组比较差异有统计学意义(P ＜0.01),与形态学改变规律一致；ZO-1蛋白表达亦降至低,与对照组相比差异有统计学意义(P ＜0.01)。结论经形态学及细胞通透性验证,培养2～3周的 Caco-2细胞可形成肠屏障模型,用于体外肠黏膜屏障的研究；PAF 影响紧密连接相关蛋白的表达,破坏紧密连接结构,从而影响肠黏膜屏障通透性。
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野生型p53基因抑制人结肠癌细胞的体内抑瘤效应观察
目的研究人野生型p53基因对人结肠癌SW1116细胞生长的影响.方法采用电穿孔法将正向携带有野生型p53基因cDNA的重组反转录病毒质粒导入有p53基因突变的人结肠腺癌SW1116细胞,筛选带外源p53基因的G418抗药性SW1116细胞克隆,对其进行生长速度、软琼脂集落形成及裸鼠成瘤等方面的检测,分析其生物学特性变化.结果导入人野生型p53基因使人结肠腺癌SW1116细胞的生长速度明显减慢(P＜0.05或0.01)、软琼脂集落数量明显较对照组减少(P＜0.05或0.01),移植瘤体积较对照组明显小(P＜0.05).结论人野生型p53基因对人结肠腺癌SW1116细胞有明确的抑瘤效应.
