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幽门螺杆菌热休克蛋白A在乳酸乳球菌中的表达及免疫学活性分析
目的 构建含幽门螺杆菌(H.pylori)热休克蛋白A编码基因的重组载体,并电转入乳酸乳球菌MG1363,表达目的 蛋白并分析其免疫原性,为H.pylori基因工程口服疫苗的研究和开发奠定基础.方法 以H.py-lori NCTC 11637株基因组DNA为模板,PCR扩增hspA基因,并克隆至乳酸乳球菌表达载体pMG36e中.将重组质粒转化E. coli DH5α,经鉴定的阳性重组质粒命名为pMG36e/hspA.以电穿孔法将pMG36e/hspA转化乳酸乳球菌MG1363并用Western blot检测HspA蛋白的表达.结果克隆重组后得到pMG36e/hspA.将pMG36e/hspA电转化MG1363后,收集菌体蛋白进行Western blot分析,在HspA的相对分子质量(Mr≈13 kDa)处出现特异性条带.结论 首次成功构建了表达 H.pylori HspA的重组乳酸乳球菌MG1363,为进一步口服疫苗的相关研究奠定了基础.
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幽门螺杆菌融合蛋白HspA-UreB在大肠杆菌中的表达与鉴定
目的在大肠杆菌中表达幽门螺杆菌(简称Hp)HspA-UreB融合蛋白,并探索其免疫反应性,为Hp基因工程疫苗的研制奠定基础.方法用PCR方法扩增郑州分离Hp菌株MEL-HP27的hspA 和ureB基因,分别克隆入pNEB193中.测序后,回收两种基因片段,并以hspA-ureB的顺序连接插入原核表达载体pMAL-C2x进行融合表达.采用蛋白印迹法对表达产物进行鉴定.结果特异PCR法和酶切鉴定证实融合基因hspA-ureB克隆入表达载体中;重组质粒转化大肠杆菌TB1后,经IPTG诱导3h,SDS-PAGE电泳显示在119 kDa处出现一条特异蛋白带,即麦芽糖结合蛋白(MBP)与HspA-UreB的融合表达形式,约占细菌总体蛋白含量的31%;该融合蛋白与Hp免疫小鼠血清和Hp阳性病人血清的Western blot分析结果显示,在119 kDa处出现特异杂交带.结论成功地在大肠杆菌中实现了Hp融合蛋白HspA-UreB的高效表达,并证实其具有良好的免疫反应性.
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幽门螺杆菌融合基因hspA-ureB重组质粒的构建及其编码蛋白抗原性预测
目的:构建幽门螺杆菌(H.pylori)郑州分离株MEL-HP27的hspA-ureB融合基因的克隆,并运用生物信息学软件预测融合蛋白HspA-UreB的空间结构和抗原性.方法:从重组质粒pNHA27和pNUB27分别纯化回收hspA和ureB基因片段,并以hspA-ureB的顺序插入温控表达载体pBV220中,用质粒酶切电泳和特异PCR方法鉴定重组质粒.利用生物信息学软件和Genbank数据库分析hspA-ureB表达蛋白的抗原性和空间结构.结果:质粒酶切电泳和特异PCR均可见2.06kb的融合基因片段.生物学软件分析显示:MEL-HP27融合蛋白HspA-UreB的长度为689个氨基酸,蛋白相对分子质量为76 500,等电点为5.79,具有5个抗原活性结构域.结论:成功构建了MEL-HP27融合蛋白HspA-UreB的重组表达质粒,编码融合蛋白具有典型抗原分子的结构特征,有望成为H.pylori疫苗候选抗原.
