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转铁蛋白增强靶向性非病毒载体K16GRGDSPC介导外源基因对骨髓基质干细胞的转染和表达
目的:检测转铁蛋白能否增强新型靶向性非病毒载体K16GRGDSPC寡肽介导外源基因对骨髓基质干细胞的转染和表达,优化寡肽载体的转染条件,为下一步利用寡肽载体构建载基因基质材料进行骨缺损修复提供实验依据.方法:实验于2004-10/2005-01在协和医院骨科实验室完成.①用固相合成法合成K16GRGDSPC寡肽并用质谱仪和高压液相色谱仪进行检测.②新西兰大白兔麻醉后无菌条件下自股骨大转子处抽取骨髓2mL,1500g离心收集细胞,加入含体积分数0.2新生牛血清的DMEM混悬细胞于培养瓶中常规培养.48 h后更换培养基,除去未贴壁细胞,细胞生长至85%融合后传代.③应用转化生长因子真核表达载体pcDNA3-TGFβ1和增强型绿色荧光蛋白真核表达载体pcDNA3-EGFP,观察转铁蛋白对K16GRGDSPC寡肽介导上述两种质粒转染骨髓基质干细胞的转染及表达效率的影响.结果:①寡肽的分子量和纯度检测:质谱图显示肽平均分子质量为2 741.330 7 m/z,与理论上计算设计合成肽的平均分子质量一致,高压液相色谱仪示合成肽的纯度为94%～95%.②转铁蛋白、寡肽载体、质粒DNA三者形成复合物的电泳鉴定结果:将1μfg寡肽载体分别与10μg或20μg转铁蛋白及2 μg pcDNA3-TGFβ1混合后电泳,结果显示三者混合物的电泳迁移率均低于不加转铁蛋白的空白对照,且加20 μg转铁蛋白较加10μg转铁蛋白的电泳迁移率更低.说明带正电荷的转铁蛋白与寡肽载体和质粒DNA形成了复合物.③转铁蛋白增加K16GRGDSPC寡肽转染效率:2 μg pEGFP质粒与6 μg K16-GRGDSPC寡肽加5～45μg转铁蛋白转染骨髓基质干细胞,转染效率随转铁蛋白浓度的增加而逐步提高,在25 μg时转染效率达到大,进一步增高转铁蛋白浓度,转染效率并不增加.④转化生长因子β1活性检测结果:体外以6μg K16GRGDSPC寡肽加25 μg转铁蛋白介导2μgpcDNA3-TGFβ1转染骨髓基质干细胞,转染72 h后测得明显高于未加转铁蛋白的转化生长因子β1的表达量[(64.4±4.3),(48.6±3.5)μg/L,P＜0.01].结论:转铁蛋白能与载体K16GRGDSPC和质粒DNA形成复合物,且显著增强K16GRGDSPC寡肽介导外源基因在骨髓基质干细胞中的转染和表达.
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新生鼠缺氧缺血性脑损伤早期肾上腺髓质素mRNA的表达变化
目的:探讨新生鼠缺氧缺血性脑损伤后早期不同时间点肾上腺髓质素基因表达的改变.方法:实验于2004-03/12在天津医科大学毒理实验室和天津市肿瘤医院中心实验室进行.①分组:取80只新生7 d Wistar大鼠,随机分为10组,对照组、缺氧缺血0,2,4,6,8,10,12,24,48 h组,每组8只.②造模:对照组不结扎也不缺氧,其他各组大鼠结扎左颈总动脉2 h后置于2 500 mL密闭玻璃容器中,以2.0L/min的速度输入体积分数为0.08的氧气2 h制备大鼠缺氧缺血性脑损伤模型.③观察指标:应用反转录-聚合酶链反应方法测定各组大鼠脑皮质肾上腺髓质素mRNA的表达,以肾上腺髓质素mRNA/β-actin比值来表示.结果:经补充后80只大鼠进入结果分析.对照组肾上腺髓质素mRNA少量表达,缺氧缺血4 h组明显高于对照组,缺氧缺血后8 h表达达到高峰(0.406±0.092,0.680±0.165,1.180±0.218,P＜0.01),其后下降,缺氧缺血48 h组与对照组无差异(0.518±0.153).结论:新生大鼠发生缺氧缺血性脑损伤后肾上腺髓质素系统可能参与其后的病理生理过程,且肾上腺髓质素能作为早期判断缺氧缺血性脑损伤的一种诊断标志物.
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乳源抗菌-免疫调节融合蛋白原核表达和纯化
目的 构建乳铁蛋白抗菌肽(Lfcin B)与免疫调节肽(PGPIPN)融合肽表达质粒,并在大肠杆菌BL21中表达及纯化.方法 采用重叠延伸PCR技术获得融合肽基因片段,并构建到原核表达载体pGEX-KG中,挑选阳性重组子,经限制性内切酶鉴定后转化到大肠杆菌BL21,然后用IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE及Western-blot方法鉴定表达的融合蛋白.用Glutathione Sepharose 4B亲和层析方法纯化融合蛋白.结果 成功构建原核表达质粒pGEX-KG-FP,并在大肠杆菌BL21中诱导其高表达.SDS-PAGE及Western-blot分析显示,特异性的抗GST单克隆抗体所识别的融合蛋白分子量与理论值相近.经Glutathione Sepharose 4B纯化后,得到较纯的GST-FP融合蛋白.结论 构建了原核表达的融合蛋白质粒,并高效表达和纯化了该融合蛋白.
