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LR重组文献资料
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小鼠E1A激活基因阻遏子RNA干扰表达载体的构建
背景:血管平滑肌的增殖是动脉粥样硬化及支架内再狭窄发生的重要机制,小鼠E1A激活基因阻遏子(Cellular repressor of E1A-stimulated genes,CREG)可以抑制血管平滑肌的增殖,成为心血管领域新的治疗靶点.目的:构建小鼠CREG小分子RNA干扰真核表达载体,下调小鼠细胞中CREG基因的表达.设计、时间及地点:观察性实验,于2007-04/10在解放军沈阳军区总医院心血管研究所完成.材料:小鼠成纤维母细胞系(NIH3T3)由美国新泽西州Robert Wood Johnson医学院病理实验科李少华教授馈赠.方法:应用RNA干扰在线设计工具设计4对可与小鼠CREG基因cDNA结合的短发夹RNA.通过化学合成法合成并克隆至pEN_mH1c载体中,与目的载体pDS_hpEY进行LR重组得到4种表达不同shCREG片段的表达载体pDS_shCREGs.应用LipofectamineTM 2000将pDS_shCREGs转染至小鼠NIH3T3细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞克隆.主要观察指标:应用反转录-聚合酶链反应和蛋白免疫印迹分别检测CREG的沉默效率.结果:经酶切和DNA测序证实,4种重组pDS_shCREG载体中插入片段的序列正确.反转录-聚合酶链反应和蛋白免疫印迹证实,4种稳定转染细胞中的CREG表达水平均有不同程度的下降,稳定转染pDS_shCREG1的细胞克隆中CREG基因mRNA和蛋白表达分别降低了87%和70%.结论:成功构建小鼠CREG基因真核干扰表达载体,使体外培养NIH3T3细胞中CREG蛋白表达明显降低.
关键词： mCREG(小鼠CREG) RNA干扰 LR重组 组织构建
