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差速贴壁技术对大鼠脑皮质星形胶质细胞纯化率的影响
目的:观察差速贴壁技术对星形胶质细胞纯化率的影响,旨在建立一套可靠的大鼠脑皮质星形胶质细胞的取材分离、纯化培养技术.方法:实验于2006-06/08在泰山医学院生命科学研究所完成.实验材料:出生2～3 d的Wistar大鼠,雌雄不拘,由泰山医学院生命科学研究所实验动物中心提供.实验方法:选用出生二三天的Wistar大鼠进行脑皮质星形胶质细胞原代培养.实验分两组殚培养:常规培养组和差速贴壁培养组.差速贴壁培养组分别于15,30 min取出,轻轻翻转培养瓶,将上清液移至另一培养瓶中,放入培养箱中继续培养.7～10 d后传代,待细胞分层生长后,置于37 ℃摇床中250r/min振荡18 h,倒掉上清液,D-Hank's液洗3次后,加入0.25%胰酶消化,倒置显微镜下观察,待细胞突起回缩后加入含血清的培养基终止消化,用吸管反复吹打使细胞从瓶壁上脱落,细胞悬液1 000 r/min离心5 min后,弃上清液,加入含体积分数为0.2血清的DMEM培养基混悬沉淀,接种人预先涂有L-多聚赖氨酸的培养瓶中继续培养.采用双重免疫荧光法鉴定星形胶质细胞纯度,测定积分吸光度值判断星形胶质细胞的生长状况.结果:①应用差速贴壁技术培养星形胶质细胞可明显提高星形胶质细胞纯度[常规培养组:(82±3)%,差速贴壁培养组15 min:(94±2)%,差速贴壁培养组30 min:(95±2)%,P＜0.01].差速贴壁需要充分的时间,15 min组和30 min组在提高星形胶质细胞纯度方面无明显差别.②差速贴壁培养组星形胶质细胞积分吸光度值高于常规培养组(常规培养组:528±25,差速贴壁培养组15 min:972±17,差速贴壁培养组30 min:996±35,P＜0.05).结论:①差速贴壁技术可明显提高星形胶质细胞纯化度,并且星形胶质细胞生长状态明显优于常规培养方法.②佳差速贴壁时间为15 min,过长差速贴壁时间对提高星形胶质细胞纯度无明显影响.
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乳猪窦房结细胞原代培养及与Col Ⅰ纤维支架复合培养实验研究
目的 对乳猪窦房结所在部位进行准确定位,建立一套可靠的窦房结细胞取材、分离、纯化培养技术;观察窦房结细胞与Col Ⅰ纤维支架的相容性. 方法 24h内新生纯种长白山乳猪5只,雌雄不拘,体重0.45～0.55 kg.实验动物采用多导电生理记录仪标记房波早出现的部位,在该位置取材行原代窦房结细胞培养,分别采用常规方法 培养和差速贴壁分离技术、5-BrdU处理纯化培养;于左心房部位取材行心房肌细胞纯化培养作为对照.倒置显微镜观察细胞形态、细胞贴壁时间、单细胞出现搏动时间、搏动频率等.将纯化培养的窦房结细胞以5 × 105个/mL密度接种至经预湿处理的Col ×纤维支架复合培养5 d,行HE染色观察及扫描电镜观察. 结果 房波早出现的位置即为窦房结所在部位.纯化培养的窦房结细胞有3种形态,即梭形、三角形与不规则形,其中梭形细胞多;心房肌细胞主要为三角形及不规则形,而无梭形细胞.窦房结细胞纯化培养与常规培养比较,梭形细胞所占比例分别为73.0%±2.9%、44.7%±2.3%,二者差异有统计学意义(P<0.01);不规则形细胞分别为7.0%±1.7%、36.1%±2.6%,二者差异有统计学意义(P<0.01);三角形细胞分别为20.0%±2.1%、19.2%±2.5%,二者差异无统计学意义(P>0.05).窦房结细胞复合Col Ⅰ纤维支架培养5 d,HE染色观察示Col Ⅰ纤维支架材料中有大量细胞;扫描电镜见细胞成团吸附于支架表面及孔隙侧壁,并可见细胞间通过突起相互连接,或伸出伪足贴附于支架孔隙壁上. 结论 通过准确窦房结定位,采用差速贴壁结合5-BrdU处理的纯化培养可明显提高乳猪窦房结梭形细胞比例,是一种可靠的窦房结细胞纯化培养技术.窦房结细胞和Col Ⅰ纤维支架有较好的细胞相容性.
