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转CpTI基因大米在五指山小型猪体内消化稳定性的初步研究
目的 建立五指山小型猪在体消化稳定性模型,评价转CpTI大米的胃肠消化稳定性.方法 在五指山成年猪体内同时安置胃、肠瘘管,通过经口喂饲途径,以大豆作为阳性对照,测定不同时间点消化液的pH,采用蛋白凝胶电泳法分析测定不同时间点消化产物中的蛋白片段,比较转CpTI大米和亲本大米消化产物的区别.结果 给样后胃液pH迅速中和至6.0左右,以后逐步降低,在4～6h后又开始回升,大豆引起胃液pH下降和回升时间均较米粉晚;13×103、17×103、34×103和50×103是大豆中几种相对消化稳定的蛋白片段,在5～6h的胃肠液中仍然能检测出高表达,其中50×103、34×103、17×103三个蛋白片段呈现胃液、肠液消化稳定性,而13kD呈现胃液消化稳定性;米粉给样0.25h后胃液中未检出任何耐受蛋白酶消化的片段或亚基,而亲本明恢86米粉和转CpTI基因米粉比较,无论是胃液或肠液中蛋白消化情况均无明显区别.结论 利用五指山小型猪建立的在体消化稳定性模型是可行的,转CpTI基因米粉与亲本米粉在五指山小型猪胃液、肠液中的消化稳定性具有等同性.
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赖氨酸转基因大米与亲本大米在五指山小型猪回肠中的消化代谢比较
目的 对赖氨酸转基因大米与其亲本大米中蛋白质和氨基酸在猪回肠的消化代谢情况进行比较研究.方法 选择近交系五指山小型猪为实验动物,通过外科手术将T型瘘管安置于小型猪回肠末端,给其饲哏赖氨酸转基因大米和亲本大米,收集小型猪回肠末端的消化产物进行分析,采用酪蛋白饲料法测定内源性氨基酸的排出量.从而比较两种大米蛋白质和氨基酸的表观消化率和真消化率.结果 赖氨酸转基因大米与亲本大米的蛋白质表现消化率和真消化率都没有显著差异;各种氨基酸的消化率结果显示,除半胱氨酸的表观消化率外,其他氨基酸的表观消化率和真消化率都没有显著差异.结论 赖氨酸转基因大米与亲本大米在五指山小型猪体内的蛋白质和氨基酸消化代谢基本没有差异,均能很好地被消化吸收.
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大豆β-伴球蛋白经口诱发五指山小型猪食物致敏模型的研究
致敏模型属IgE介导的Ⅰ型过敏反应类型,该模型可用于转基因食品潜在致敏性的评价.
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高龄五指山小型猪近交系血液生化指标测定
目的 了解猪龄和性别对五指山小型猪(WZSP)近交系血液生化指标的影响.方法 WZSP近交系F17、F186月龄青年猪34头(7 ♂,27♀),5-6高龄猪21头(8 ♂,13♀),禁食12 h后经由前腔静脉采血,用全自动生化分析仪检测血液生化指标.结果 青年猪和高龄猪有部分血液生化指标具有性别差异(P＜0.05),其中青年猪有3项高龄猪有7项;青年猪和高龄猪有16项血清生化指标具有差异(P＜0.05).结论 WZSP近交系血液生化指标有着明显的年龄差异,这对选用高龄猪作为人类老年化动物模型提供了基础参考数据.
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三个品系小型猪Ⅱ型糖尿病模型的比较研究
目的 比较三个品系小型猪对高糖高脂饲料诱发Ⅱ型糖尿病模型的敏感性,为我国小型猪在Ⅱ型糖尿病研究中的应用提供基础资料.方法 4～5月龄巴马小型猪、五指山小型猪和中国农大小型猪各6头,以4头中国农大小型猪为对照,同步开展高糖高脂饲料喂养试验,试验周期8个月.每月称1次体重,测定血糖、血清胰岛素含量,每2个月进行1次静脉葡萄糖耐量试验(IVGTT),测定脂质代谢相关指标.结果 巴马小型猪和五指山小型猪对高糖、高脂饲料比较敏感,在饲喂5～6个月后,开始出现糖代谢异常,表现为显著肥胖、血清胰岛素升高和胰岛素敏感性下降.至实验后8个月,巴马小型猪和五指山小型猪各有1头发展为糖尿病,分别有3头和2头出现糖尿病前期症状.中国农大小型猪对高糖高脂饲料诱发糖尿病相对不敏感,实验期间空腹血糖水平、血清胰岛素含量、胰岛素敏感指数和IVGTT一直无显著变化,仅在实验后7个月开始表现肥胖,8个月出现胰岛素敏感性减低.三个品系小型猪在高糖高脂饲喂后,血脂相关指标(TG,CHO,HDL-C,LDL-C)普遍升高,以巴马小型猪升高幅度大.结论 巴马小型猪和五指山小型猪对高糖、高脂饲料诱发Ⅱ型糖尿病比较敏感,品系内个体差异较大.中国农大小型猪相对不敏感.这一结果为进一步的Ⅱ型糖尿病相关基因分析和高敏感家系培育研究提供了基础资料.
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实验用五指山小型猪正常生理值测定
目的 建立中国实验用五指山小型猪正常生理参考值.方法 选用24头中国实验用五指山小型猪,雌雄各半,对其体重、体温、20项血液学指标、21项血清生化指标、4项心电图指标、尿常规、主要脏器重量和脏器系数进行了测定,并选用同一批动物对其血液学、血清生化、心电图等生理指标进行了为期4个月的连续测定.结果 五指山小型猪部分指标如血液学的WBC、LYM%、GRAN%、PCT,血清生化指标如ALP、P、Na、Cl雌雄动物相差显著,其他指标较一致.心电图指标、体重、主要脏器系数雌雄较一致,部分生化指标如GGT等与临床人正常值较接近.动态测定结果提示各项主要指标测定结果较稳定,随着饲养时间的延长,少数血液生化指标如WBC、GOT有一定的改变,但幅度较小.结论 初步建立了中国实验用五指山小型猪正常生理参考值,这些生理数据的采集为其进一步开发和应用提供了有益的参考.
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实验用五指山小型猪胚胎生殖细胞的分离培养
目的 对从猪的原始生殖细胞分离获得胚胎干细胞的方法进行初步研究.方法 胎儿取自怀孕26～28 d的实验用五指山母猪.分离胎儿生殖嵴获得PGCs,接种于STO饲养层上,以DMEM+2 mmol/L谷氨酰胺+0.1 mmol/L非必需氨基酸+0.1 mmol/L β-巯基乙醇+100 IU/mL青霉素+100 pg/mL链霉素+15%FCS作为培养基,对细胞进行培养传代.结果 培养的细胞传至4～5代,形态多样,经AKP染色、SSEA-1免疫荧光染色、Oct-4免疫荧光标记等方法鉴定为阳性,具有胚胎干细胞的特征.
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自然分娩人工饲养获得净化小型猪尝试
目的 探讨自然分娩人工饲养能否获得净化的五指山小型猪.方法 母猪自然分娩后2 h内,将仔猪处理后转到隔离器,用奶粉、米粉、饲料分别过渡人工饲养.其间分别接种7次益生菌、补充铁硒制剂两次.饲养至42 d.测定其携带病原抗体.结果 仔猪成活率为75%,原猪场所具有的病原均被隔离,达到净化试验目的 .结论 自然分娩人工饲养能获得无多种人畜共患疾病的净化五指山小型猪.
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五指山小型猪心脏起搏器的放置
将体重为24-26kg的成年五指山小型猪,用于颈外静脉放置心脏起搏器的实验研究,结果表明此方法操作简单,起搏效果好,为建立理想的心衰模型提供了可靠的技术方法和措施,为小型猪的心衰模型系列开发利用奠定了良好基础.
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五指山小型猪高脂血症模型的建立
目的 本研究通过给与五指山小型猪高脂饲料,旨在诱发小型猪的高脂血症.方法 将30头小型猪随机分成3组:①对照组(n=6),喂正常猪饲料;②1.5%胆固醇组(n=12),饲喂含1.5%胆固醇、10.0%的牛油、6.0%花生油和0.5%胆盐的饲料;③3%胆固醇组(n=12),饲喂含3.0%胆固醇、10.0%的牛油、6.0%花生油和0.5%胆盐饲料.高脂饮食6个月.每月测定体重和血脂(TG、TC、HDL-C、LDL-C).结果 和结论 五指山小型猪对高脂饮食反应敏感,高脂饮食一个月内,高脂饮食组TC、HDL-C和LDL-C从极低水平迅速升高,随后逐月缓慢升高.至高脂饮食4个月时,TC达到15.5～17.7 mmol/L,LDL-C达到12～13 mmol/L,HDL-C达到4.45～5.76 mmol/L,与基线相比,TC升高约10倍,LDL-C升高约15倍,HDL-C升高约7倍,4个月后变化趋于稳定,而对照组没有变化,TG没有明显变化趋势,形成了典型的高胆固醇血症.1.5%胆固醇组和3%胆固醇组血脂指标差异不明显(P＞0.05),提示1.5%的胆固醇含量就足以获得高脂血症模型.
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五指山小型猪冠状动脉球囊损伤术
目的 通过实施冠状动脉内皮损伤术,加速小型猪在高胆固醇饮食条件下的动脉粥样硬化进程,建立小型猪定位冠状动脉硬化技术,为心血管疾病研究提供理想的动物模型.方法 采用8头五指山小型猪进行冠状动脉内皮损伤术,术前饲喂3.0%高胆固醇饲料20～25 d,在冠状动脉前降支中段进行球囊扩张.压力为6～10 atm,扩张次数3次.结果 除1头小型猪,在经过扩张压力10个大气压,扩张3次手术后存活外,其余小型猪在术后6～24 h内死亡.结论 五指山小型猪冠状动脉扩张后,极易出现室颤,推测该品种小型猪对这种手术的耐受力较差.
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两个品系普通级和SPF级小型猪部分血液学指标的比较
目的 了解不同微生物控制程度(屏障环境和普通环境)对小型猪部分血液学和生化指标的影响. 方法分别对10只SPF(无特定病原体)级五指山小型猪、10只普通级五指山小型猪和10只SPF级广西巴马小型猪、10只普通级广西巴马小型猪测定13项血液学指标和21项血清生化指标.结果 普通级小型猪红细胞数(RBC)、血球比积(HCT)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、高密度脂蛋白(H DL-C)低于SPF级小型猪,白细胞数(WBC)、天门冬氨酸转移酶(AST)高于SPF级小型猪 (P<0.05);且部分指标在不同品种间有差别.结论 普通级小型猪和SPF级小型猪部分血液学和血清生化指标等生物学特性存在显著差异.
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SPF级与普通级小型猪主要脏器形态与脏器系数比较
目的 比较两种不同微生物学控制等级的五指山小型猪主要脏器重量和相对重量差异.方法 选取4月龄近交培育的五指山猪20头,其中普通级和SPF级各10头,雌雄各半,分别测定体重和7种主要脏器重量,分析两种不同微生物控制程度的小型猪主要脏器形态及脏器相对重量.结果 SPF级小型猪体重显著低于普通级对照(P＜0.01),前者肺和脾的形态发生改变,肝、心、脑和肾上腺的相对重量显著高于普通级对照( P＜0.01),而SPF级的脾和肺的相对重量显著低于普通级对照(P＜0.01).结论 小型猪在不同微生物控制程度下体重和脏器系数存在显著差异,主要脏器形态与脏器系数差异可作为实验动物质量鉴定的参考依据.
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五指山小型猪PPARγ2基因启动子多态性分析
目的 对五指山小型猪PPARγ2基因启动子调控区域多态性进行分析.方法 根据猪PPARγ2启动子调控区域2200 bp设计5对引物,对57头封闭群五指山小型猪的多态性进行检测,并用多种生物信息学软件对调控区域的启动子、转录因子结合位点、RNA二级结构、CpG岛进行预测分析.结果 筛选到9个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)位点,分别是:-1595T/C、-1534G/A、-1262C/A、-1220C/A、-1017A/G、-963A/G、-955G/A、-866A/G、-333G/A.SNPs都没有处在软件识别的启动子区域中,但-333G/A突变位于核心启动子(-656～-23 bp)区域.突变的SNP位点附近转录因子结合位点会发生改变,突变前后RNA二级结构小自由能发生变化,其结构也发生显著变化.目标序列未找到CpG岛.结论 筛选到的五指山小型猪PPARγ2启动子调控区域SNPs可能对该基因的表达调控产生影响,为进一步研究其功能奠定基础.
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发挥特色优势,发展实验动物产业
海南省有发展实验动物的良好条件,热带、亚热带独特的气候条件特别适合于动植物的生长发育,保存完整的生态多样性环境使得海南具有丰富的动植物品种资源,有许多野生动物具有开发成实验动物的潜在优势,例如五指山小型猪、海南猕猴等.
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转bar基因耐草胺膦油菜对五指山小型猪的亚急性毒性研究
目的 探讨转bar基因耐草胺膦油菜对五指山小型猪的亚急性经口毒性效应,为确定人类食用安全剂量提供参考依据.方法 分别用含10％转bar基因耐草胺膦油菜籽饲料、含10％亲本对照油菜籽饲料、常规基础饲料连续喂饲五指山小型猪30 d,观察动物一般行为表现、毒性表现和死亡情况,记录生长发育指标,检测实验前、后血常规7项、血生化12项指标,测定各主要脏器湿重及其脏器系数,并进行病理组织学检查.结果 实验期间各组动物进食正常,活动自如,鼻、眼、口腔无异常分泌物,未出现生病或死亡.与对照组相比,转基因组和亲本组动物的体重、体长、体高、胸围均未见异常改变；血液学指标、血生化指标以及各主要脏器湿重及其脏器系数均未见有生物学意义的改变；大体解剖观察未见异常,各主要组织病理学检查未见明显改变.结论 用含转bar基因耐草胺膦油菜及亲本对照油菜的饲料喂饲小型猪,未见其对动物产生亚急性毒性反应.
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转bar基因耐草胺膦油菜对五指山小型猪免疫指标的影响
目的 探讨转bar基因耐草胺膦油菜对五指山小型猪免疫指标的影响,观察其是否具有免疫毒性和潜在致敏性.方法 分别用含10％转bar基因耐草胺膦油菜籽的饲料、含10％亲本对照油菜的饲料、常规基础饲料,连续喂饲五指山小型猪30 d,观察动物一般行为表现、毒性表现和死亡情况,记录体重,计算免疫器官脏器系数,以ELISA试剂盒测定实验前后血清免疫指标及肠组织组胺含量.结果 实验期间各组动物活动自如,未见腹泻等症状,未出现不适或死亡,除亲本对照组雄性胸腺系数高于对照组外(P＜0.05),其余组体重和免疫器官脏器系数无异常改变.与饲养对照组相比,转基因组和亲本对照组实验前后血清IgG、IgE抗体、组胺及细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10均无显著变化(P＞0.05).与对照组相比,转基因组和亲本组肠组织组胺含量均未见显著变化(P＞0.05).结论 bar基因耐草胺膦油菜及其亲本对照油菜分别掺入饲料喂饲小型猪30 d,未见其对小型猪免疫指标产生不良影响.
关键词： 转bar基因耐草胺膦油菜 五指山小型猪 免疫指标 -
转入乳铁蛋白基因大米主要营养素的体内消化率及蛋白质营养价值评价
目的 对转人乳铁蛋白基因大米(hLF大米)与亲本大米(PR大米)主要营养素在体内的消化代谢及蛋白质的营养价值进行初步比较评价.方法 以6头近交系五指山小型去势公猪为实验动物,进行回肠末端造瘘手术安置T型瘘管,采用交叉法分别饲喂hLF大米、PR大米,收集回肠末端消化产物分析比较两种大米主要营养素的体内消化率,采用经消化率校正的氨基酸评分法( PD CAAS)对两种大米蛋白质的营养价值进行初步评价.结果 hLF大米与PR大米在蛋白质/氨基酸、碳水化合物、脂肪、纤维素的消化率上均无显著差异.人乳铁蛋白基因的插入使hLF大米中各氨基酸的含量配比得到了一定的优化,且其PDCAAS比亲本大米提高了2.66％.结论 hLF大米与PR大米在五指山小型猪体内主要营养素的消化代谢上满足“实质等同性”的要求,PDCAAS的结果显示hLF大米中蛋白质的质量略有提高.
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五指山小型猪在心血管系统疾病建模中的应用
五指山小型猪是中国特有的、具有自主知识产权的高度近交猪种,具有遗传性稳定、体型小、体重轻、抗逆性强等特点,因组织器官结构及生理生化指标与人类相似,已越来越广泛地应用于医学研究领域.在我国,五指山小型猪被用来构建高脂血症模型、动脉粥样硬化模型、急慢性心肌缺血致急性心肌梗死模型和心力衰竭模型、心脏骤停模型、心肺复苏后心肌代谢评估等心血管疾病模型.五指山小型猪在心血管系统解剖及生物学行为与人高度相似,将会在未来心血管疾病研究中发挥日益重要的作用.
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关附甲素对急性心肌缺血五指山小型猪血流动力学的影响
目的:研究分析关附甲素(Ace)对结扎冠脉造成急性心肌缺血的五指山小型猪血流动力学指标的影响.方法:选用五指山小型猪,在冠脉前降支中上1/3至1/2处予以结扎建立缺血模型,随机分为冠脉结扎关附甲素(A组,10只)、非冠脉结扎关附甲素(B组,9只)、结扎生理盐水(C组,9只)3组,分别经Swan-Ganze导管测定急性缺血(或对照)动物用药前后血流动力学指标.采用配对t检验比较各组内用药前后指标变化,采用调整基线资料的协方差比较指标的变化是否存在组间差异.结果:共收集五指山小型猪有效实验资料28只,其中A组10只,B、C组各9只,性别、月龄、身长、体重等基线资料无组间差异.在急性缺血模型中,与生理盐水比较,Ace仅使心率有所下降,肺动脉收缩压略升高,对心排量、肺动脉楔压等其他血流动力学指标无明显影响.Ace在急性缺血(A、C组)或非缺血模型(B组)中对各项血流动力学指标的影响无组间差异.实验过程中,应用Ace可适当减慢心率,未见到不利的血流动力学作用.结论:初步动物实验结果证实,在急性缺血模型中,应用Ace在血流动力学方面安全性较好.
