结核性胸膜炎是一种常见的肺外病变．表现为淋巴细胞为主的渗出性炎症．由于该病在临床上缺乏特异性表现．早期诊断困难．用细菌学方法检测阳性率低．胸膜活检因其为创伤性操作限制了在临床上的广泛应用．分子生物学虽提供了快速诊断技术．但仍存在假阳性和技术方面的问题结核杆菌感染T细胞斑点（TSPOT．TB)技术是目前诊断结核性胸膜炎敏感性较高的细胞学检测技术(我们应用TSPOT．TB技术检测外周血单个核细胞(PBMCs)胸腔积液单个核细胞(PEMCs1中被结核分枝杆菌早期分泌靶向抗原6ESAT一61和培养滤液蛋白10(C（P一1o)致敏的T细胞数目．来探讨胸腔积液细胞学检查方法对结核性胸膜炎的诊断及与其它种类胸腔积液的鉴别诊断价值

　　1材料与方法

　　1．1 标本来源

　　1．1．1 结核性胸膜炎组（TBP组1收集2011年12月至2013年2月本院结核内科、胸外科住院病人32例，其中男性18例．女性l4例，年龄18～70岁，入选标准符合《结核病诊治指南》对结核性胸膜炎的诊断标准

　　1．1．2 非结核性胸膜炎组收集2011年12月至2013年2月本院肿瘤科、呼吸内科、胸外科非结核性胸腔积液病人26例，其中男性l7例，女性9例，年龄1973岁

　　1．2 仪器与试剂青岛海尔生物安全柜（HR40一IIA2) CO2培养箱：TSPOT．TB试剂盒（英国Ox（ordImmunotec Ltd)和BD单个核细胞分离器(BD Vacutainer CPT tube1由复星诊断公司提供。

　　1．3 检测方法

　　1.3．1外周血单个核细胞(PBMCs1的分离、收集对每位人选患者采集肝素锂抗凝的外周血5～10m1．加入等体积RPMI 1640细胞培养液混匀后．加在预先准备好的（icol）淋巴细胞分离液上层．3000 r／min水平离心2O min．用毛细滴管吸取中间层云雾状细胞．用RPMI 1640培养液洗涤PBMC 2次．进行显微镜下细胞计数．根据计数结果用无血清AIMV培养基调整细胞悬液浓度至2．5x106／ml

　　1．3．2 胸腔积液中的单个核细胞(PEMCs)的分离、收集采集新鲜胸腔积液5 lOm1．置肝素锂抗凝管即刻混匀．其它操作同PBMCs的分离。

　　1．3.3 检测过程在已包被小鼠抗人I（N一单克隆抗体的微孔培养板中分别加入作为阴性对照的AIMV培养基、阳性对照植物血凝素PHA、MTB特异性混合多肽早期分泌靶向抗原6 （ESAT一61与培养滤液蛋白1O(C（PlO)各501l．然后在各孔中加入调整好浓度的细胞悬液100l将微孔板放在37oC，5％C0培养箱中培养16～20h，用PBS缓冲液洗板，加人碱性磷酸酶标记的单克隆抗体501，在2 8℃下孵育1h后洗板．后在每孔中加入底物显色液．室温下静置反应7 min后用蒸馏水终止反应。

　　1．3．4 TSPOT．TB试验结果判读根据TSPOT．TB试剂使用说明书．如果阴性对照孔斑点数(SC（)<6时且(抗原A或抗原B孔的斑点数1一（阴性对照孔斑点数)≥6，可判断检测标本为阳性；如果阴性对照孔斑点数为6～10个时且（抗原A或抗原B孔的斑点数1≥2x(J性对照孔斑点数)可判断检测标本为阳性：如果上述标准不符合且阳性质控对照孔正常时检测结果为;阴性”

　　1．4 统计学方法采用卡方检验．P<0．05表示差异有统计学意义

　　2 结果

　　2．1 胸腔积液检测结果胸腔积液TSPOT．TB技术检测结果：TBP组32例患者中30例为阳性．非结核性胸膜炎组26例中1例为阳性．检测敏感性为93．75％ ．特异性为96．15％。假阳性率为3．84％（1／26)，假阴性率为6．25％（2／30)，阳性预测值96．77％，阴性预测值92．59％。

　　2．2 外周血检测结果外周血TSPOT．TB技术检测结果：TBP组32例患者中26例为阳性，非结核性胸膜炎组26例中2例为阳性．检测敏感性为81．25％：特异性为92．30％．假阳性率为7．69％(2／26)，假阴性率为18．75％ （6／32)，阳性预测值92．86％ ，阴性预测值8O％。经统计学分析，xz=4．43，0．025<P<0．05，差异有统计学意义。胸腔积液单个核细胞TSPOT技术检测敏感性（93．75％）优于外周血单个核细胞（81．25％)（见表13讨论结核分枝杆菌感染的免疫反应主要是细胞介导。作为细胞介导免疫反应的一部分，T细胞被结核分枝杆菌抗原致敏．当这些抗原再次刺激时，活化的效应T细胞，主要CD4、部分CD8细胞产生抗结核感染免疫中的关键性细胞因子干扰素（N一^y）。

　　TSPOT．TB技术以ESAT一6和C（P一10作为刺激抗原．刺激外周血单个核细胞(PBMCs)胸腔积液单个核细胞(PEMCs1．如果机体存在结核感染效应T淋巴细胞．经ESAT一6和C（P一10刺激后。通过体外的细胞培养．刺激底物和效应T淋巴细胞产生大量细胞因（N一）再通过酶联免疫斑点技术(ELISPOT)检测（N一分泌T细胞数目来证实机体存在结核感染由于ESAT一6和C（P一1）这两种蛋白由结核杆菌的RD1基因序列合成．而该基因序列仅存在于致病性结核杆菌之中．环境中的非典型分枝杆菌和卡介苗中均不含该基因序列。故将上述两种结核感染的特异性抗原作为刺激物来进行TSPOT．TB检测．从理论上保证了TSPOT．TB 的高度特异性 另一方面ESAT一6和C（P一10）两种抗原联合检测综合了单一抗原优势．可针对外周血或胸腔积液单个核细胞上的不同表位进行刺激，产生（N一），具有更强的活化能力，比单一抗原更为灵敏 因此．ESAT一6和C（P一10两种抗原作为特异性刺激抗原具备更高的检测敏感性和特异性，从而为临床症状不典型、抗酸染色、结核杆菌培养均呈阴性的疑似结核杆菌感染和隐性结核杆菌感染患者提供有效的诊断方法，目前国内的研究多采用结核感染患者的外周血进行TSPOT．TB检测．可是国外有学者认为．结核抗原特异性T细胞具有向病变部位集中的特点．T一-SPOT．TB技术的检测物已不仅局限于外周血，同时也可用于支气管肺泡灌洗液、痰液、胸腹水、脑脊液等对肺内及肺外结核的诊断 Losi等认为胸腔积液中的单个核细胞比外周血更有诊断价值 本试验选择来自病变部位的胸腔积液作为检测对象．通过T-一SPOT．TB技术检测受感染组织中的T细胞反应因子．能够提高活动性结核诊断的敏感性和特异性。试验结果显示．胸腔积液单个核细胞T-一SPOT．TB技术检测结核性胸膜炎的敏感性为93．75％、特异性96．15％，而外周血单个核细胞敏感性则为81．25％、特异性92．30％。表明受感染组织的T一-SPOT．TB技术较单纯外周血检测对诊断活动性结核病敏感性和特异性更高 Lee等对4O例胸腔积液患者，其中19例结核性胸膜炎1的胸腔积液和外周血单个核细胞进行TS（OT．I13检测。胸腔积液的敏感性和特异性分别为94．7％ 、85．7％。外周血的敏感性和特异性分别为77．8％、90．5％

　　本试验胸腔积液的结果与Lee等的基本一致．外周血的敏感性比Lee等的研究结果要高．但是比国内张瑛等嘲、肖倩等研究结果要低。本试验TBM组有2例胸腔积液检测呈阴性反应。分析原因可能是患者经治疗后体内的特异性T细胞数目迅速减少而造成的假阴性．对照组出现一例阳性．该患者为肺癌病人．分析其原因可能是患者曾经有过结核分枝杆菌的潜伏性感染．当然也不能排除肿瘤合并结核感染的可能综上所述．外周血和胸腔积液单个核细胞TS（OT,．TB技术都可以作为当前诊断结核性胸膜炎的辅助方法．但是胸腔积液单个核细胞TSPOT．TB技术较外周血具有更好的敏感性和特异性。