骨髓增生异常综合征患者ETV6基因重排分析及其临床意义

目的 用信号分离原位杂交(Split-signal FISH)技术分析骨髓增生异常综合征(MDS)患者ETV6基因重排情况,并初步探讨其与MDS分期和预后的关系.方法 用常规细胞遗传学和Splitsignal FISH技术分析58例MDS患者ETV6基因重排,对涉及9p24、12p13平衡易位的患者以ETV6F1、ETV6F2和JAK2R1、JAK2R2为引物进行RT-PCR.用χ2检验和时序检验对患者的ETV6重排与MDS分期、预后之间关系进行分析.结果 检出ETV6基因重排4例(6.9%),其中1例(1.7%)经RT-PCR证实形成了ETV6/JAK2融合基因.平均随访12个月,4例(100%)重排患者全部转为急性白血病,中位生存时间7个月,另外54例患者10例(17%)转为急性白血病,中位生存时间28个月.4例重排患者均为MDS难治性贫血伴原始细胞增多(RAEB)阶段,另外54例有17例(31.5%)为MDS晚期阶段.结论 ETV6基因重排在MDS中有较高表达率(6.9%),并与MDS的分期和预后密切相关.

脂多糖对间充质干细胞Toll样受体4基因的表达水平及活性的影响

目的 探讨脂多糖(LPS)对骨髓间充质干细胞(MSC)Toll样受体4(TLR-4)基因的表达及其功能的影响.方法 采用贴壁培养和密度梯度离心法从大鼠骨髓分离MSC,通过细胞形态、成骨分化潜能及流式细胞术检测表型以鉴定其纯度;半定量RT-PCR和流式细胞术分别检测MSC在不同浓度(1、10、100 μg/ml)LPS存在条件下培养24 h的TLR-4 mRNA相对表达量和共刺激分子(CD80、CD86、MHC-Ⅱ)的表达水平;ELISA法定量检测TNF-α的分泌水平.结果 骨髓MSC低表达TLR-4mRNA(相对表达量0.61±0.10),同时表达CD80[(9.56±0.69)%]、CD86[(22.03±2.03)%]、MHC-Ⅱ[(2.51±0.97)%],少量分泌TNF-α[(4.97±2.98)pg/ml].MSC经LPS处理后,其TLR-4mRNA、共刺激分子表达和TNF-oα分泌水平均升高,其中10 μg/ml LPS培养组升高显著,TLR-4 mRNA相对表达水平为1.55±0.02;CD80、CD86、MHC-Ⅱ阳性细胞率分别为(41.70±2.92)%、(59.72±2.00)%、(24.56±2.19)%;TNF-α分泌水平为(213.12±69.08)pg/ml,与对照组比较,P值均＜0.01.100μg/ml LPS处理组与10 μg/mlLPS处理组相比,各项检测指标均降低,但MHC-Ⅱ和TNF-α的降低水平无统计学意义(P＞0.05).结论 骨髓MSC低表达TLR-4,体外LPS可促进骨髓MSCTLR-4的表达,且与浓度相关.伴随TLR-4表达水平的升高,CD80、CD86、MHC-Ⅱ表达水平及TNF-α水平同时升高.

p27kip1及其出核相关分子激活蛋白1辅因子在淋巴瘤细胞中的表达及相互关系

目的 探讨p27kip1及其出核相关分子激活蛋白1(AP-1)的辅助因子Jab1在淋巴瘤细胞中的表达变化及相互关系.方法 采用血清饥饿合并释放方法同步化处理淋巴瘤细胞系Jurkat和Raji细胞,分别采用Western blot及RT-PCR技术检测p27kip1、Jab1在淋巴瘤细胞中的蛋白表达水平和mRNA表达水平变化;采用来普霉素B(LMB)刺激增殖过程中的淋巴瘤细胞,检测p27kip1、Jab1的表达变化;构建人Jab1基因的pcDNA3.1-myc-Jab1的真核表达质粒,脂质体转染Jurkat细胞,配合免疫荧光技术检测p27kip1的亚细胞定位情况;免疫沉淀检测Jurkat和Raji细胞中p27kip1与Jab1的结合情况.结果 血清饥饿导致Jurkat和Raji细胞生长周期停滞,p27kip1蛋白总量增加,Jab1蛋白总量减少.血清释放后两者的蛋白水平呈现相反的表达变化,而p27kip1 mRNA水平无明显改变.LMB可以抑制由血清释放引起的细胞增殖,在此过程中p27kip1表达上调,Jab1表达下调.转染Jab1真核表达质粒的Jurkat细胞p27kip1定位有明显的改变.免疫沉淀结果显示在Jurkat和Raji细胞中p27kip1与Jab1相互结合.结论 Jab1可能通过与p27kip1结合来介导p27kip1的核内外分布并影响其表达,进而影响p27kip1的功能状态,从而参与调控淋巴瘤细胞的生长.

源于细菌DNA的寡核苷酸对K562/A02细胞来源的树突细胞促成熟作用

目的 研究源于细菌CpG基序的寡核苷酸和含细菌短磷酸二酯骨架的寡核苷酸对K562/A02细胞来源的树突细胞(DC)的促成熟作用.方法 联合应用细胞因子rhGM-CSF和rhIL-4诱导K562/A02细胞成为DC.7 d后以瑞特-姬姆萨染色观察细胞形态的变化,流式细胞术检测细胞免疫表型的变化,用同种混合淋巴细胞反应、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性检测、IL-12和IL-6的分泌实验评价DC的成熟程度.然后在DC中分别加入源于细菌CpG基序的寡核苷酸CpG2006以及含细菌短磷酸二酯骨架的寡核苷酸A-ODN和T-ODN,处理3 d后再次检测该DC成熟度.结果 K562/A02细胞可在细胞因子rhGM-CSF和rhIL-4联合作用下分化成为DC,免疫表型检测发现CD83、HLA-DR和CD86分子的表达分别为(65.5±8.4)%、(32.0±4.3)%和(18.6±3.2)%,经CpG2006作用后表达升高到(88.9±3.6)%、(53.9±3.2)%和(39.9±7.3)%;经A-ODN作用后升高到(97.0±5.3)%、(63.9±7.3)%和(40.2±7.4)%;经T-ODN作用后升高到(93.3±4.6)%、(58.3±5.6)%和(36.2±6.8)%,与作用前相比差异均有统计学意义.经CpG2006、A-ODN和T-ODN作用后具有典型DC形态的细胞增多.上述3种寡核苷酸处理的DC均可刺激T细胞产生较强的增殖效应、诱导产生的CTL对靶细胞K562/A02的杀伤率明显增强,IL-6和IL-12分泌明显增高.结论 源于细菌CpG基序的寡核苷酸以及含细菌短磷酸二酯骨架的寡核苷酸对白血病源性DC有促成熟作用.

shRNA介导的RNA干扰对小鼠T淋巴细胞CD28基因的沉默效应

目的 探讨短发夹状RNA(shRNA)对C57BL/6J小鼠T淋巴细胞CD28共刺激分子基因沉默效应,评价shRNA对目的 基因干扰效应的时效性和稳定性,筛选出高效的干扰序列用于后期的动物实验.方法 首先构建3个载有CD28特异性shRNA(shRNA1～3)的表达质粒和1个非特异性shRNA表达质粒,将其分别转染小鼠脾淋巴细胞,以非特异性的shRNA表达质粒组和未转染组分别作为阴性对照和空白对照,采用实时荧光定量PCR和Western blot方法分别从基因和蛋白质水平评价转染l～20 d内CD28 shRNA对CD28基因的干扰效应,并筛选出干扰效率高的序列.结果 ①成功构建了CD28 shRNA表达载体;②3种CD28 shRNA均可在mRNA和蛋白质水平有效沉默目的 基因,与实验对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01):CD28 mRNA拷贝数持续降低,3种CD28 shRNA转染C57BL/6J小鼠脾细胞20 d,小鼠脾细胞CD28 mRNA拷贝绝对数分别下降了99.62%、99.89%和99.80%;CD28蛋白表达水平分别降低了(84.90±0.65)%、(96.49±0.03)%和(91.76±0.32)%,以CD28 shRNA 2组的抑制效率高(P＜0.01).结论 ①特异性的CD28 shRNA可长期、稳定地介导CD28基因沉默;②针对CD28基因不同位点的不同shRNA也有干扰效率的差异.

Fn、TPO基因修饰对人骨髓间充质干细胞的影响

目的 观察纤维连接蛋白(Fn)、血小板生成素(TPO)融合基因修饰对人骨髓间充质干细胞(MSC)的影响.方法 构建携带Fn-TPO融合基因的重组逆转录病毒载体,并以其对骨髓MSC进行基因修饰;观察Fn-TPO基因在骨髓MSC中的表达,以及基因修饰后骨髓MSC的体外增殖、黏附造血细胞和分泌TPO的能力;并将脐血CD34+细胞接种到基因修饰后骨髓MSC形成的滋养层,培养7d观察修饰后骨髓MSC对造血细胞体外扩增和集落形成能力的影响.结果 成功构建携带Fn-TPO基因的重组逆转录病毒载体且以该逆转录病毒载体对骨髓MSC进行体外基因修饰;Fn、TPO基因在骨髓MSC内能够正常转录;基因修饰后的骨髓MSC体外增殖能力[(6.92±0.77)×104/ml]与对照组[(7.18±0.89)×104/ml]比较差异无统计学意义(P＞0.05);基因修饰组和对照组黏附造血细胞能力分别为0.188±0.018和0.167±0.017(P＜0.01),分泌TPO能力分别为(7.46±0.59)ng/ml和(5.58±0.37)ng/ml(P＜0.01),细胞分泌TPO的能力不受培养时间的影响,但受细胞生长状态影响;2×104脐血CD34+造血干/祖细胞经基因修饰后骨髓MSC联合必要细胞因子体外扩增7 d,有核细胞数、CD34+细胞比例、BFU-E、CFU-GM及CFU-GEMM分别为(29.9±2.7)×104、(33.3±2.8)%、109.3±4.1/1×104CD34+细胞、163.7±7.1/1×104CD34+细胞、13.3±1.5/1×104CD34+细胞,较对照组明显增加(P＜0.01).结论 Fn-TPO基因修饰能够增强骨髓MSC黏附造血细胞、分泌TPO及支持脐血CD34+细胞扩增的能力.

苦参碱处理的K562细胞中IER3IP1基因表达及其对细胞增殖的影响

目的 研究苦参碱诱导K562细胞分化过程中IER3IP1基因的表达,以明确IER3IP1基因表达与苦参碱作用的量效及时效关系,并初步探讨该基因在K562细胞中的功能.方法 锥虫蓝染色分析苦参碱对K562细胞的生长抑制作用;用RT-PCR半定量方法观察K562细胞在不同时间、不同剂量苦参碱作用下IER3IP1基因的表达情况;对IER3IP1基因重组质粒转染的K562细胞(K562/eYFP-IER3IP1)作细胞形态学及细胞增殖变化的观察,同时进行细胞周期检测以及超微结构观察.结果 苦参碱对K562细胞有增殖抑制作用,在苦参碱作用3 h后IER3IP1基因表达可升高3～4倍,并呈剂量依赖性,其后6～48 h表达下降,低于非苦参碱处理组.K562/eYFP-IER3IP1细胞的增殖速度显著减缓,G0/G1期细胞数升高(P＜0.05);且苦参碱作用24h后在光镜和电镜下均可见红系分化细胞增多.结论 苦参碱抑制K562细胞生长,同时使IER3IP1基因表达以剂量依赖的方式瞬时升高,转染了IER3IP1基因的K562细胞对苦参碱敏感性增高,提示该基因可能参与了苦参碱作用于K562细胞的早期反应,并在后续的红系分化中发挥作用.

抗CD40L单抗4F1体外诱导再生障碍性贫血患者T细胞免疫沉默和促进造血恢复的研究

目前认为,原发性再生障碍性贫血(再障)的主要发病机制为T细胞介导的骨髓特异性自身免疫反应[1].根据免疫学基本原理,共刺激信号是抗原特异性T细胞活化过程中的必要条件.虽然对再障共刺激信号系统的改变认识仍非常有限,但已有证据表明,患者的共刺激信号系统存在异常[2,3].CD40/CD40L是共刺激信号系统中一个重要的调节分子对.我们通过观察抗CD40L单抗4F1对再障患者骨髓T淋巴细胞表型及集落形成的影响,研究其对再障T淋巴细胞异常免疫反应的抑制和造血恢复的促进作用.

白血病细胞内SHIP基因表达及其对AKT磷酸化的影响

SHIP(SH2 domain containinginositol 5'-phosphatase)基因位于人类染色体2q36-37.1,广泛表达于造血细胞[1].SHIP基因敲除小鼠可表现出骨髓细胞的高度增生[2].SHIP可特异地清除磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)代谢产物PIP3,从而抑制其下游信号分子AKT的磷酸化[3].这些研究表明,SHIP可能作为潜在的肿瘤抑制基因对造血细胞的发生、发展及功能起着关键的负调控作用.我们应用实时定量PCR的方法检测T、B及髓系白血病细胞中SHIP基因的表达,初步证实SHIP基因表达和AKT磷酸化水平呈现负相关关系,同时证实bcr-abl融合基因产物对SHIP基因表达有抑制作用.

克氏综合征合并急性淋巴细胞白血病一例

患者,男,24岁.因发热、咳嗽、咳白色黏痰1周来院就诊,体温高达38.2℃,伴头晕、乏力,齿龈出血,四肢酸软.血常规检查:WBC 15.2×109/L,RBC 4.21×1012/L,Hb 118g/L,BPC 54×109/L.骨髓象:有核细胞增生极度活跃,粒系占0.06,红系未见,巨核细胞全片见1个.片中幼稚淋巴细胞占0.79,胞体偏大,胞质少,色蓝,核圆,染色质较致密,可见1～2个核仁.

遗传性联合凝血因子缺乏症一例

患儿,女,6岁.5年前出现磕碰处皮下血肿,未进行诊治;3年前无明显诱因出现皮肤出血点伴腹痛,当地医院诊断为过敏性紫癜,给予激素及中药治疗后症状消失,出院时查出凝血结果异常(具体不详);2年前因大便带血就诊,查出凝血示PT 19.5 s、APTT 86.2 s、TT15.1 s、Fg 2.9 g/L;患儿查过敏原300余种,均无异常.后就诊于大连某医院,查凝血示PT 20.0 s、APTT 70.5 s、TT17.6 s、Fg 1.99 g/L,凝血因子活性检查:FⅧ活性18.7%、FⅨ活性60.1%、F Ⅺ活性74.7%,诊断未明,为进一步诊治入我院.

CD3+CD56+T细胞大颗粒淋巴细胞白血病一例

患者,男,72岁,因反复发热、乏力3个月于2007年2月28日收住我院.患者2006年12月初开始出现无诱因间断性发热,体温波动于38.5℃左右,伴乏力、纳差.2007年1月当地医院查血常规:WBC 10.0×109/L,Hb 128 g/L,BPC79×109/L;血细胞分类:中性粒细胞0.11、淋巴细胞0.72、异形淋巴细胞0.17;骨髓象:增生活跃,异形淋巴细胞0.165.诊断为传染性单核细胞增多症,予地塞米松10 mg/d静脉注射、阿昔洛韦及保肝治疗后,体温降至正常,乏力症状有所改善,但停药后再次出现持续发热,体温高40℃.起病以来体重下降10 kg.

Ph染色体阳性慢性粒细胞白血病发生Ph染色体阴性急性淋巴细胞白血病变一例

患者,女,17岁.2000年10月因疲乏、反复鼻出血就诊,查体:肝肋缘下3 cm,脾肿大:AB线4 cm,AC线5 cm,DE线5.5 cm.血常规检查:WBC 179×109/L,Hb 102 g/L,BPC 917×109/L.骨髓检查结果为慢性粒细胞白血病(CML)慢性期.

核磷蛋白与恶性血液病

核磷蛋白(nucleophosmin,NPM)又名B23、NO38、Numatrin,是一种多功能的核仁磷酸化蛋白,广泛表达于各组织细胞,穿梭于胞核与胞质参与核糖体的装配、前rRNA的加工剪切、DNA复制、中心体复制、细胞分裂等生命活动.近年来,对于其生物学功能的研究颇受关注.自从Stein首先报道了NPM-ALK基因是CD30+(ki-1)间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)的典型特征后,NPM作为分子遗传标志物与疾病诊断、预后的关系越来越引起研究者的关注.1994年,Morris和Shiota克隆出NPM-ALK融合基因后,人们发现NPM变异对于肿瘤尤其是恶性血液病的发生、发展和预后起着重要的作用.

关于急性白血病异基因造血干细胞移植后复发的防治

随着异基因造血干细胞移植(allo-HCT)技术的不断成熟与提高,allo-HCT已成为治愈急性白血病(AL)的主要乃至唯一选择.然而移植后约25%～30%的患者仍然复发,特别是高危型AL患者移植后复发率可高达40%或以上,占移植后死亡原因的首位.因此针对移植后复发的防治策略的研究是提高allo-HCT疗效的迫切需要.

同时检测WT1和mdr1基因多重荧光实时定量PCR标准品的构建

绝大多数急性白血病患者存在WT1基因异常高表达,其异常表达程度也与难治复发白血病有关,并可作为"泛白血病"标志检测指标监测微量残留病(MRD)[1-3].近有研究发现急性白血病mdr1和WT1基因表达水平有明显的相关性[4],但目前国内外研究一般是分别对WT1和mdr1基因进行单独检测,操作繁琐且不能准确了解同一标本两者的关系.多重荧光实时定量PCR是指在PCR体系中加入多个荧光基团,设计不同的引物在同一反应体系中同时对多个靶基因分子进行扩增,通过连续监测不同荧光信号强度的变化来实时监测不同待测基因的表达量,后通过标准曲线对不同未知起始模板进行定量分析的方法.

线性扩增介导的PCR方法用于检测慢病毒载体在白血病细胞基因组中插入位点的可行性

目前,病毒载体基因转导技术是基因治疗中为成熟的生物学方法,其中逆转录病毒载体,因其具有可直接整合于宿主细胞基因组并能够长期稳定表达的特点而成为临床基因治疗的核心技术,分析病毒载体在宿主染色体中插入位点的常用方法包括Southern blot、RT-PCR等,这些方法均需要足量含高拷贝数已整合有病毒载体的样本DNA以获取有用的序列信息,且受到靶序列的大小、位置及构象的限制,故其灵敏度较差.目前可用于同时检测低拷贝数、多处未知DNA插入位点旁序列的精确灵敏的方法是线性扩增介导的PCR(linear amplification-mediated PCR,LAM-PCR)法[1,2],我们探讨了该技术用于分析检测慢病毒载体(lentiviral vector)在人白血病细胞基因组中插入位点旁序列的可行性.

第十一届全国血栓与止血会议纪要