流感病毒型别及亚型的多重RT-PCR方法快速检测

目的为适应流感疫情监测中快速诊断的需要,建立敏感特异的流感病毒多重逆转录PCR(MRT-PCR)检测方法.方法对甲1型(H1N1)、甲3型(H3N2)、乙型流感病毒的血凝素(HA)基因保守区域分别设计引物进行MRT-PCR.另设计了两对引物对H1N1和H3N2亚型流感病毒的神经氨酸酶(NA)N1、N2作亚型判断.结果MRT-PCR可特异性检测出各型流感病毒的目的片段,相互间无交叉反应.二次PCR反应后对H1N1、H3N2流感病毒的检测灵敏度可达0.10 TCID50/50μl以下,对乙型流感病毒的检测灵敏度可达0.01 TCID50/50μl以下.应用此方法也可特异性地检测出H1N1和H3N2流感病毒的NA基因.结论用MRT-PCR从临床患者含漱液标本中检出相关流感病毒的灵敏度要高于用狗肾传代细胞(MDCK)或鸡胚分离的灵敏度,达到了快速、敏感、正确检测流感病毒及其亚型的目的.

乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白基因的筛选

目的筛选并克隆人肝细胞中与乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)相互作用的蛋白质基因.方法将重组诱饵质粒pGBKT7-eAg转化酵母细胞AH 109后与预转了人肝cDNA文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落,提取质粒后转化大肠埃希菌并进行序列测定,进行生物信息学分析.结果配合后筛选出既能在4缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基又能在铺有X-α-半乳糖(X-α-gal)的4缺培养基上生长并变成蓝色的真阳性菌落245株.完成了101株克隆的测定,经过序列分析排除了重复同源序列后,终确定其中有41株不同的基因,其中人类同源基因35条,其余6株为未知基因.结论成功克隆出肝细胞中的HBeAg结合蛋白基因,为进一步研究HBeAg的功能提供了新线索.

新型重组人IFN-λ2的高效表达、纯化与抗病毒活性研究

目的在大肠埃希菌中高效表达重组人干扰素-λ2(rhIFN-λ2),并对其抗病毒活性进行初步研究.方法根据大肠埃希菌的偏爱密码子人工设计合成人干扰素-λ2(hIFN-λ2)的高表达基因,将其克隆到原核表达载体pBV220,在大肠埃希菌中进行表达,表达产物经变性、复性、阳离子交换层析及分子筛层析纯化,测定其抗病毒活性、种属特异性及抗HBV活性.结果在大肠埃希菌表达的目的蛋白占细胞总蛋白量的15%左右,纯化后的纯度达到90%以上,在WISH细胞上抗VSV活性约为1.5×106 IU/mg.与rhIFN-α2b比较,表达产物在非灵长类细胞上的抗病毒活性较在灵长类细胞上弱,目的蛋白在HepG2.2.15细胞上表现有与rhIFN-α2b相似的抗HBV活性.结论hIFN-λ2可以在大肠埃希菌内实现高效表达,表达产物具有抗病毒活性,有与rhIFN-α2b相似的抗HBV活性,本型IFN有较严格的种属特异性.

重组人干扰素Epsilon的表达纯化及生物学性质研究

目的表达纯化一种新型重组人干扰素Epsilon(rhIFN-ε155ser),并对它的生物学特性进行初步研究.方法人工合成rhIFN-ε155ser的全基因序列,并按照大肠埃希菌密码子嗜性作适当改造,然后构建到原核表达载体pBV220,在大肠埃希菌DH5α中表达.将表达的包涵体蛋白纯化复性后,对终产物的抗病毒活性、细胞生长抑制活性和NK细胞刺激活性进行鉴定.同时,利用芯片技术,从基因的水平对rhIFN-ε155ser的生物机制进行初步的了解.结果rhIFN-ε155ser以包涵体的形式表达,经纯化蛋白纯度可达95%.复性后rhIFN-ε155ser在WISH抗VSV系统中的抗病毒活性可达6×105IU/mg.在100～1000 pg/ml下rhIFN-ε155ser具有剂量依赖性的抗增殖活性,而NK细胞刺激活性无剂量依赖性.基因芯片扫描发现,22 278个位点中,有283个基因显著上调,另外1894个显著下降.结论成功地表达了rhIFN-ε155ser,发现此IFN具有一定的抗病毒、抗增殖和NK细胞刺激活性.芯片技术可进一步拓展对IFN的功能研究.

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B肝细胞结合蛋白基因的筛选与克隆

目的筛选并克隆人肝细胞cDNA文库中与丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白4B(NS4B)相互作用蛋白的基因,明确其具体作用机制.方法应用酵母双杂交系统3,将多聚酶链反应(PCR)法扩增的HCV NS4B基因连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖(X-α-gal)上进行双重筛选阳性菌落,提取阳性酵母菌落的质粒转化大肠埃希菌,接种在氨苄西林-LB平板上,选择生长菌落,提取质粒酶切鉴定,测序并在GenBank中进行生物信息学分析.结果成功克隆出HCV NS4B基因并在酵母细胞中表达,与肝文库配合后选出既能在4缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基又能在铺有X-α-gal的4缺培养基上生长,并变成蓝色的真阳性菌落5个,序列分析显示,筛选到的肝细胞蛋白编码基因参与细胞代谢、生物氧化、生长调节等多种生物学过程.结论成功克隆出HCV NS4B蛋白与肝细胞相互作用蛋白,为进一步研究NS4B蛋白的功能,阐明HCV致病的分子生物学机制提供了新线索.

慢性乙型肝炎血清及肝组织病毒学标志与病理损伤的关系

目的探讨慢性乙型肝炎(CHB)患者血清及肝组织病毒学标志与肝组织病理损伤的关系.方法对647例CHB患者血清病毒学标志HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb、HBV DNA及其中418例肝细胞病毒学标志HBsAg、HBcAg的表达与肝组织病理损伤进行对比分析.结果CHB患者血清及肝组织病毒学标志与肝组织病理损伤密切相关.结论血清HBsAg、HBeAb、HBcAb阳性,HBV DNA阴性的患者肝组织炎症及纤维化程度较轻;HBV DNA与肝组织炎症分级及纤维化分期无明显相关;肝细胞HBsAg、HBcAg均阴性表达的肝组织炎症及纤维化程度较重.

重组人干扰素α-2b鼻腔喷雾剂预防治疗恒河猴感染SARS-CoV的试验研究

目的评价重组人干扰素α-2b鼻腔喷雾剂对恒河猴感染SARS-CoV的预防治疗作用.方法采用鼻腔喷雾法(剂量为60万单位/鼻孔)研究了重组人干扰素α-2b鼻腔喷雾剂对感染SARS-CoV的恒河猴预防治疗效果.结果试验组(5只)和对照组(5只)相同时间检测的咽拭子等标本中,Real-time PCR检测和病毒分离均未检出病毒.攻毒后病毒导致机体产生的中和抗体和IgG抗体的反应也较对照组弱.血液学指标检测结果表明试验组动物攻毒后各项指标较试验前比较没有显著性改变;病理结果显示试验组2只恒河猴肺组织形态基本正常,其余3只猴有肺间质性炎,表现肺间隔增厚、单核样细胞为主的炎细胞浸润,其中1只增厚的肺间隔有局灶相互融合,这3只猴肺部病变与对照组的病变表现相似,且病变累及范围较对照组小;其他各受检脏器均未见明显异常.结论重组人干扰素α-2b鼻腔喷雾剂可以有效阻断或减弱SARS-CoV对恒河猴的感染.

共表达HIV-1 gag-gp120与白细胞介素6重组鸡痘病毒的筛选

目的构建共表达中国株HIV-1 gag-gp120与白细胞介素6(IL-6)的重组鸡痘病毒(FPV).方法分别将HIV-1 gag-gp120基因和IL-6基因插入到FPV表达质粒pUTAL复合启动子和单一启动子下游,构建重组FPV表达质粒pUTA-GE-IL6.利用脂质体法将重组质粒和FPV 282E4株共转染鸡胚成纤维细胞,经BUdR加压筛选,重组病毒分别用SDS-PAGE和Western Bolt进行鉴定,观察病毒样粒子的形成和重组病毒在哺乳动物细胞中的表达,并分析其免疫原性.结果阳性重组病毒基因组点膜处有显色斑点,Western Bolt结果显示重组病毒表达了gag-gp120嵌合蛋白和IL-6,在病毒感染细胞中有反转录病毒样粒子形成,且重组病毒可在哺乳动物细胞中表达目的蛋白.小鼠免疫指标检测表明该重组病毒具有很好的免疫原性.结论成功构建了共表达中国株HIV-1 gag-gp120与IL-6的重组FPV,为HIV-1基因工程活载体疫苗和巨分子颗粒化疫苗的制备奠定了基础.

SARS-CoV受体ACE-2基因的克隆及在真核细胞中的表达

目的克隆、真核表达严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)受体ACE-2基因,建立安全、可靠的SARS-CoV保护性体液免疫评价体系.方法采用Trizol一步法提取人右心衰心房组织总RNA,逆转录巢式聚合酶链反应(RT-nested-PCR)扩增ACE-2全长基因,克隆人pcDNA4/HisMax-TOPO表达载体,重组质粒转染293 T细胞进行瞬时表达,Western Blot检测其真核表达;建立细胞融合抑制实验以检测SARS-CoV中和抗体,并与SARS-CoV假病毒中和试验进行平行比较.结果重组质粒可在真核细胞中表达ACE-2蛋白,其蛋白表达细胞可与S蛋白表达细胞产生细胞融合现象,并可用于中和抗体的检测;其结果与SARS-CoV假病毒中和试验较为一致.结论克隆和真核表达了SARS-CoV受体ACE-2基因;基于其蛋白真核表达的细胞融合抑制实验可用于SARS-CoV中和抗体的检测.

重组人干扰素α-2b喷雾剂预防SARS等呼吸道病毒感染的人群试验研究

目的评估重组人干扰素α-2b喷雾剂(远策素喷雾剂)预防SARS等常见呼吸道病毒感染的效果.方法研究对象共14 391人,用药剂量为90万IU/次,每日2次,连用5 d,未次用药后15 d取血,或用药前和用药3周后采取双份血清.采用随机、对照方法检测血清抗SARS-CoV-IgG抗体;采用双盲、随机、安慰剂对照方法测定血清抗常见呼吸道病毒(B型流感病毒、副流感病毒1～3型,呼吸道合胞病毒及腺病毒3、7型)的血清IgM抗体.结果两次实验中,干扰素组血清SARS病毒IgG抗体阳性率均较试验组高,但差异无统计学意义(P＞0.05).但用药组应用于扰素后副流感病毒1～3型,B型流感病毒,腺病毒3、7型和呼吸道合胞病毒IgM抗体阳性率(依次为6.45%、4.52%、4.30%和17.20%)均低于对照组(依次为19.40%、13.60%、7.12%和25.62%).其中副流感病毒、B型流感病毒、腺病毒3种病毒IgM抗体阳性率差异均有统计学意义(P＜0.01).结论应用远策素喷雾剂鼻和咽部喷雾能不同程度地降低用药人群常见呼吸道病毒的感染率.

重组人干扰素α-2b喷雾剂人群试验的安全性评价

目的评价重组人干扰素α-2b喷雾剂(远策素喷雾剂)人群应用预防SARS等呼吸道病毒感染的安全性.方法采用随机、同期平行对照的现场流行病学实验方法进行评价,用药5 d,随访10 d.结果用药期间,与对照组比较,用药组体温未见异常;用药期间用药组出现的不良反应有头痛(4.83%～7.09%)、头晕(7.17%～11.63%)、乏力(8.55%～15.06%)、肌肉酸痛(4.43%～7.09%)、咽干(12.10%～17.85%)、咽痛(6.25%～8.72%)、腹痛(2.30%～5.50%)、腹泻(2.45%～5.66%)等,不良反应的发生率均高于对照组(P＜0.05);不良反应主要出现在用药的前3天;除咽干和乏力外,其他症状在停药后显著下降,其发生率甚至显著低于对照组;用药期间鼻塞、咳嗽和咯痰发生率两组差异无统计学意义;对照组的皮疹发生率显著高于用药组.在整个用药过程中未发现国外志愿者试验发生的血涕现象.结论应用远策素喷雾剂可引起一些较轻的流感样不良反应,但所有症状均为可逆性反应,停药后可消失;未见有其他严重不良反应的发生,在人群中应用是安全的.

卟啉锰修饰的TFO结合并切割HBV-DNA片段体外的实验研究

目的观察卟啉锰修饰的螺旋寡核苷酸(TFO)在体外结合并切割HBV-DNA片段的能力.方法以卟啉锰、吖啶修饰TFO末端;在37℃pH7.4体外环境中,使卟啉锰、吖啶修饰的TFO与32P标记的HBV-DNA片段结合,以凝胶滞留试验、酶足迹和切割试验观察其结合的亲和性、特异性以及切割HBV-DNA片段的能力.结果卟啉锰、吖啶修饰的TFO可与HBV靶序列结合成三链DNA,解离常数(Kd)为3.5×10-7mol/L,相对亲和力为0.008,并具有序列特异性.在KHSO5存在的情况下,卟啉锰、吖啶修饰的TFO可切割靶DNA,切割部位为三链DNA形成区.结论在有KHSO5存在的情况下,卟啉锰-TFO-吖啶化合物可定点切割靶HBV-DNA.

重组人干扰素α-2b喷雾剂在人群中对风疹、麻疹病毒减毒活疫苗鼻腔接种后干预免疫效果的初步研究

目的初步观察重组人干扰素α-2b(rhIFN-α2b)鼻腔喷雾剂对风疹、麻疹减毒活疫苗鼻腔接种后免疫效果的干预作用.方法选择合适人群进行对比试验,一组为干扰素(IFN)试验组,一组为对照组.IFN试验组提前2天使用rhIFN-α2b喷雾剂,然后IFN试验组和对照组分别使用风疹、麻疹减毒活疫苗进行鼻腔接种.在疫苗接种前以及接种后第21和28天分别采集试验对象血清测定其对应的IgG特异性抗体,以抗体滴度的差异观察IFN-α2b对病毒感染的干预效果.结果麻疹试验组和对照组的抗体差异分别为1.26(21 d)和2.96(28 d),差异有统计学意义;风疹试验组和对照组的抗体差异为0.95(21 d)和0.37(28 d),差异不明显.结论(1)单价麻疹和风疹疫苗鼻腔喷雾接种可以加强基础免疫;(2)rhIFN-α2b鼻腔喷雾剂对风疹和麻疹减毒活疫苗鼻腔接种的免疫效果有一定的干预作用.

潜在抗病毒药物葛根粗提物及其主要成分葛根素改善乙醇导致海马细胞毒性作用的机理

目的研究葛根粗提物(CP)和葛根素标准品(SP)对乙醇(EtOH)引起的胎鼠海马细胞氧化损伤是否具有相同的保护作用.方法海马细胞的培养取材于妊娠18天的ICR胎鼠.用MTT法检测细胞活力,并采用RT-PCR方法观察SOD mRNA表达的变化.结果MTF实验结果显示,15 mg/L CP和10 mg/L SP均可部分拮抗50～350 mol/L EtOH对胎鼠海马细胞所产生的毒性作用.检测SOD mRNA表达的变化,数据表明,CP和SP均可部分降低EtOH所引起的海马细胞SODmRNA表达量的升高.结论CP和SP均可降低EtOH所致SOD mRNA表达量的升高,显著降低EtOH所诱发的海马细胞毒作用,提高海马细胞的增殖活力,进一步从分子机制方面证实和阐述了CP和SP具有相同的抗氧化作用.

重组SARS冠状病毒棘突蛋白S1区基因片段的克隆、表达及免疫原性研究

目的构建SARS冠状病毒(SARS-CoV)棘突(spike)蛋白(S蛋白)S1区基因(40～2001 bp)分段表达载体,并研究其免疫原性.方法利用PCR技术扩增S1区基因,将其定向插入pQE-30质粒,在pQE-30质粒上将S1切成3段(40～751、746～1344、746～2001 bp),均插入pQE-30质粒,构建质粒在大肠埃希菌M15中表达,表达产物经亲和层析纯化及Western Blot和ELISA鉴定.结果构建的3种重组质粒(pQE-30/S1a、pQE-30/S1b、pQE-30/S1c)均高效表达,重组蛋白相对分子质量分别为26 700、22 500和46 000,表达量分别占菌体总蛋白质的35%、35%和30%.3种重组蛋白经Ni亲和层析树脂得到成功纯化.经Western Blot及ELISA证实,重组蛋白片段S1c(746～2001bp)可以被SARS患者血清所识别.结论成功构建了SARS-CoV S蛋白S1区基因分段表达载体,重组蛋白S1c具有较强的免疫原性,它的获得为下一步疫苗的研制奠定了基础.

双环醇片治疗慢性乙型肝炎在肝组织学方面的研究

目的研究双环醇片治疗慢性乙型肝炎(CHB)在肝组织学方面的变化.方法随机选择31例CHB患者分两组接受治疗,每日口服双环醇片,剂量分别为150和75 mg,连续用药36周,观察治疗前后肝组织学的变化.结果治疗36周后,治疗组与对照组肝组织病变活动性积分均有下降,分别为P＜0.01和P＜0.05,且组间相比差异有统计学意义(P＜0.05);肝组织炎症分级下降(P＜0.05).结论双环醇片150与75 mg/d治疗CHB均可在明显降低ALT的同时使肝组织学得到明显改善,150 mg/d疗效好于75 mg/d疗效.

羧甲基茯苓多糖对HBV转染细胞表达功能影响的实验研究

目的研究羧甲基茯苓多糖在2.2.15细胞株培养中抗乙型肝炎病毒(HBV)的作用.方法分别采用20.0、12.0、6.0、3.0、1.5g/L的药液,在2.2.15细胞株培养中观察其对细胞的毒性和对HBsAg和HBeAg分泌的抑制效果.结果羧甲基茯苓多糖对2.2.15细胞株的50%毒性浓度(TC50)为13.6g/L,对2.2.15细胞株HBsAg、HBeAg分泌的半数有效浓度(IC50)为4.45、5.61g/L,治疗指数(TI)值为3.06和2.42,高于已用于临床抗病毒的阿昔洛韦.结论羧甲基茯苓多糖在2.2.15细胞株培养中对HBsAg和HBeAg分泌有较好的抑制作用.

RNA干扰在抗HBV感染中作用的研究进展

乙型肝炎病毒(HBV)可引起慢性肝炎,慢性乙型肝炎(慢性乙肝)终可能发展为肝硬化、肝癌[1,2],所以慢性肝炎是严重危害人类健康的一种疾病.目前用干扰素或核苷类似物如拉米夫定、阿德福韦等治疗慢性乙肝,但疗效不理想,特异性差,易出现耐药性[3,4].RNA干扰(RNAi)是一种普遍存在的自然过程,双链RNA直接作用于同源基因特别序列使其沉默.这一过程非常保守,在真核生物中广泛存在[5,6].哺乳动物细胞mRNA可被RNAi特异地降解,如23、21个核苷酸的双链RNA [7,8],从而特异地阻断相应基因的表达[9].近几年来RNAi的研究取得了重大进展,因此被评为2001年十大科学成就之一.

医用三氧治疗慢性乙型肝炎临床报道

医用三氧治疗经过一个多世纪的发展和完善后,目前已经成为某些代谢性、感染性和自身免疫性疾病的首选或是辅助治疗方法.我们应用医用三氧成功地治疗了许多患者,现将两例慢性乙型肝炎病例总结如下.

成人麻疹急性期外周血T淋巴细胞亚群测定的临床意义

1对象和方法1.1 对象 2002年3～5月我院住院成人麻疹患者24例,男性16例,女性8例,平均年龄33.5岁,其麻疹抗体IgM均阳性.

乙型肝炎表面抗体的时间分辨荧光免疫分析

目前,乙型肝炎表面抗体(HBsAb)酶联免疫方法(ELISA)检测中存在着标记的酶易变化等缺点.而时间分辨荧光免疫分析(time-resolved fluroimmunoassay,TRFIA)具有灵敏度高、操作方便、示踪物稳定、自然本底荧光低、无放射性污染等特点.本工作拟建立一种高灵敏度、高稳定性、高抗干扰的HBsAb-TRFIA.

肿瘤坏死因子-α与病毒性心肌炎心肌病变的相关性研究

近年来的研究发现病毒性心肌炎(viral myocarditis,VMC)中肿瘤坏死因子-α(tumour necrosis factor-α,TNF-α)表达明显升高,它在VMC的心脏损伤中可能起作用.本实验探讨了TNF-α与VMC心肌病变的关系.

抗SARS冠状病毒单克隆抗体的制备及其体外中和活性鉴定

2002年11月在我国广东省的南部出现了严重急性呼吸综合征(sever acute respiratory syndrome,SARS)病例,并迅速传播到其他地方.在世界卫生组织(WHO)的统一组织和协调下,通过各国科学家的共同努力,在较短的时间内完成了确定其病原体和控制流行的工作,但许多问题仍有待回答,此次疫情的病原体来自何处,会不会再次暴发流行仍不能确定.本研究的目的是获得该病毒的单克隆抗体,为SARS的早期诊断治疗和病原追踪提供技术支持.

干扰素研究的意义

本刊干扰素专栏刊登了有关干扰素研究的八篇文章,反映了我国当前干扰素研究的动向,包括重组干扰素α-2b防治SARS冠状病毒感染及其他呼吸道病毒感染人群和猴体的试验,三种新型干扰素生物学性质的研究及采用微阵列生物芯片来研究干扰素的生物学活性等.

非法医学期刊曝光台

酶免疫试验检测牛肉中污染的牛中枢神经组织的研究

目的研究应用酶免疫试验(EIA)检测牛肉中污染的牛中枢神经(CNS)组织的影响因素,并将该方法应用到进口牛肉和国产牛产品的检测中.方法对含有不同浓度中枢神经组织的牛肉匀浆分别进行加热处理和不加热处理,放置不同时间后用RIDASCREEN(r)Risk Material 10/5和RIDASCREEN(r)Probennahme-zubehor Sampling tools试剂盒进行检测;对与标准相同浓度脑组织的PBS悬液和样品稀释缓冲液(SDB)悬液用试剂盒进行检测;对美国进口牛肉及国产市售牛产品中是否含有中枢神经组织进行检测.结果该试剂盒可检出生肉产品和加热处理的肉产品中的中枢神经组织.样品的吸光度值随着中枢神经组织含量的增加而增加;加热和放置时间的延长可使样品的吸光度值下降;脑组织的PBS悬液比相应浓度的样品稀释缓冲液(SDB)悬液的吸光度值高,二者的吸光度值都比相应浓度的标准高.进口牛肉的检测结果均为阴性;国产牛产品除牛尾为阳性外其余样品均为阴性.结论酶免疫法用于检测牛肉中污染的中枢神经组织具有很高的灵敏性;加热和放置时间延长可使样品的吸光度值下降.如果屠宰过程不当,会造成牛产品被中枢神经组织成分污染.