细胞与分子免疫学杂志
Chinese Journal of Cellular and Molecular Immunology 세포여분자면역학잡지
- 主管单位： 中国免疫学会；第四军医大学
- 主办单位： 陕西省免疫学会,中国免疫学会
- 影响因子： 0.81
- 审稿时间： 1-3个月
- 国际刊号： 1007-8738
- 国内刊号： 61-1304/R
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
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小鼠IL-1β在H22细胞的表达及对NK细胞杀伤活性的影响
目的:重组表达小鼠IL-1β全长基因,转染H22肝癌细胞,分析对NK细胞杀伤活性的影响.方法:构建小鼠IL-1β重组表达载体pIRES2-EGFP-mIL-1β,利用jetPEI转染H22肝癌细胞,RT-PCR和激光扫描共聚焦显微镜分析IL-1β重组载体的表达,MTT方法分析转染前后,野生型小鼠脾脏NK细胞对H22细胞杀伤活性的变化.结果:RT-PCR扩增出小鼠IL-1β,长度约843 bp.纯化的PCR产物与pIRES2-EG-FP同时经Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切,在T4连接酶作用下连接,转化大肠杆菌,提取质粒经PCR、限制性酶谱分析(Xho Ⅰ+EcoR Ⅰ)和DNA序列测定后,确认获得重组表达载体pIRES2-EGFP-mIL-1β.将该质粒转染至H22小鼠肝癌细胞中,RT-PCR和荧光观察证实,H22细胞能表达高水平IL-1β重组表达载体,与转染空载体的对照组细胞相比,IL-1β转基因后H22细胞对NK92细胞杀伤抵抗性明显增强,同时野生型小鼠脾脏NK细胞对pIRES2-EGFP-mIL-1β转基因细胞的杀伤活性明显下降,效靶比40:1时下降了约10%.结论:IL-1β能够明显增强H22肝癌细胞对NK细胞杀伤的抵抗性,可能是肝癌细胞借以逃逸天然免疫应答的重要机制.
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人端粒酶逆转录酶核心启动子调控的人TRAIL蛋白在人卵巢癌细胞中的表达
目的:构建人端粒酶逆转录酶基因核心启动子(hTERT)调控的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体真核表达载体,并检测TRAIL在转染的卵巢癌细胞SKOV3中的表达情况.方法:利用基因重组方法将TRAIL基因克隆入带有hTERT基因核心启动子pIRES2-EGFP真核表达载体中.获得由hTERT基因核心启动子调控的绿色荧光蛋白和带有效应型TRAIL基因的真核表达载体hTERTpromoter-pIRES2-EGFP-TRAIL.采用脂质体介导的方法将hTERT调控的TRAIL基因真核表达载体转染人卵巢癌SKOV3细胞,采用G418筛选获得阳性克隆;应用免疫细胞化学法、蛋白质印迹分析、流式细胞术(FCM)结合间接免疫荧光、RT-PCR法检测转染前后卵巢癌细胞中外源基因的表达.结果:经酶切鉴定及测序结果证实所构建载体正确.转染细胞中的TRAIL表达明显高于对照组细胞.结论:成功地构建了hTRET基因核心启动子调控的TRAIL基因真核表达载体,并在人卵巢癌细胞系SKOV3中得到稳定表达,为进一步研究其对卵巢癌细胞生物学行为的影响奠定了实验基础.
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HCV NS5A基因在hepG2细胞中的表达以及对PI3K的影响
目的:探讨HCV-NS5A对PI3K表达的影响.方法:应用PCR技术从含有HCV全长开放阅读框的质粒中获得NS5A全长基因片段,利用基因重组技术将其克隆至真核表达载体pcDNA3.0(-)中.通过酶切、PCR及测序鉴定,NS5A基因已正确插入到pcDNA3.0(-)中,再利用脂质体转染HepG2细胞.结果:经RT-PCR及Western blot检测,HCV的NS5A基因在HepG2细胞中获得表达,而且在表达重组NS5A的转染HepG2细胞中,检测到PI3K蛋白的表达.结论:NS5A可在体外激活PI3K及其信号通路.
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树突状细胞胞外体(Exosome)的超滤离心法提取及形态观察
目的:利用树突状细胞(DC)胞外体(Ex)的物理特性,探讨基于DC-Ex的大小和密度,用超滤离心法制备DC-Ex的实验方法,以改进传统方法、提高收获效率.方法:选用小鼠树突状细胞株DC2.4为研究对象,收集细胞培养上清,中空纤维器去除细胞及细胞碎片,Amicon Ultra超滤离心管压缩体积,密度梯度超离心纯化获得DC-Ex提取物.对照组则采用传统的分级分离方法.应用透射电镜进行形态学鉴定,并采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blot进行检测.结果:DC-Ex提取物超微结构形态及SDS-PAGE带型和文献报道类似,包含有主要的特征性标志物分子MHC-Ⅰ,MHC-Ⅱ,CD80和CD86;与分级分离法相比,超滤离心法耗时少,产量和纯度较高.结论:超滤离心法是一种简便高效的提取Ex的方法.
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整合素在白细胞黏附和游走中的作用
在免疫监视和宿主防御反应中,白细胞需要从血液游走至外周组织发挥重要作用,在此过程中,白细胞和内皮细胞表面黏附分子调节白细胞与内此细胞的接触和滚动.
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硒酸精氨酸对D-gal衰老小鼠细胞免疫功能的影响
目的:探讨硒酸精氨酸对D-gal衰老小鼠免疫功能的影响.方法:将试验小鼠分为正常组、模型组、低剂量给硒组(L-SeArg)和高剂量给硒组(H-SeArg),通过后颈背部皮下注射D-gal建立亚急性衰老模型,以灌胃方式加入硒酸精氨酸,观察硒酸精氨酸对脾指数、胸腺指数的影响,MTT法检测脾细胞增殖能力和NK细胞的杀伤活性、免疫荧光法观察CD40、CD40L的阳性表达率.结果:硒酸精氨酸能明显提高小鼠胸腺指数和脾指数,促进淋巴细胞转化,提高NK细胞的杀伤活性,增加CD40、CD40L的阳性表达率.2个剂量给硒组中,低剂量硒酸精氨酸的影响大,与模型组相比有统计学意义(P＜0.01).结论:D-gal能导致小鼠细胞免疫功能下降,硒酸精氨酸能活化免疫细胞,提高小鼠机体的免疫力,延缓衰老.
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一种高效表达小干扰RNA载体的构建研究
目的:用mir30前体骨架来构建高效表达小干扰RNA载体.方法:通过基因合成的方法,将mir30前体骨架进行全长基因合成,并在合成的mir30前体骨架中引入合适的酶切位点用于外源发夹DNA的克隆,然后将之克隆到含U6启动子的表达载体中.将针对绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的小干扰RNA克隆到以上表达载体中,通过转染及Western blot来检测新的小干扰RNA表达载体的基因沉默效率.结果:同目前常用的含polⅢ的小干扰RNA表达载体相比较,用mir30前体骨架表达针对GFP的小干扰RNA的表达载体可以明显抑制GFP的表达.结论:用mir30前体骨架构建的小干扰RNA表达载体可高效表达外源小干扰RNA.
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人IL-1RⅡ基因腺病毒载体的构建及在子宫内膜异位症细胞中的表达
目的:利用AdEasy XL系统,构建并鉴定IL-1RⅡ基因重组腺病毒载体,并在子宫内膜异位症(EM)细胞中表达.方法:PCR扩增含有IL-1RⅡ全长cDNA的片段,亚克隆到pShuttle-CMV穿梭质粒,经酶切和测序验证无误后,再经电转化与pAdEasy-1质粒在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组产生腺病毒载体质粒.经过抗性筛选、酶切鉴定以及再次测序验证无误后得到阳性的重组质粒,经Pac Ⅰ酶切线性化再在293细胞中进行包装扩增,用ELISA检测IL-1RⅡ蛋白的表达.利用Adeasy XL系统的对照载体pShuttle-CMV-LacZ同上操作作为对照.收集的重组腺病毒感染原代培养的EM基质细胞,并以免疫组化法鉴定IL-1RⅡ表达.结果:测序证实连接后IL-1RⅡ序列完全正确;抗性筛选及酶切鉴定均表明重组腺病毒载体构建成功;pShuttle-CMV-LacZ转染293细胞3 d后X-gal染色阳性,回收病毒可以重复感染293细胞,ELISA鉴定表达IL-1RⅡ可溶性蛋白,证明病毒包装成功.重组的腺病毒感染EM基质细胞后,免疫组化法证实IL-1RⅡ表达.结论:成功地构建了IL-1RⅡ基因重组腺病毒载体,并且在EM基质细胞中表达,为进一步研究IL-1RⅡ基因在EM中的作用乃至生物治疗都奠定了基础.
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小鼠凋亡相关新基因PNAS-4真核表达载体的构建、表达及体外抗肿瘤作用
目的:对小鼠凋亡相关新基因PNAS-4(mPNAS-4)进行克隆,构建其真核表达载体,并在小鼠Lewis肺癌细胞系LL2中转染表达;探讨mPNAS-4基因转染LL2细胞过表达所诱导的体外肿瘤细胞凋亡情况.方法:用RT-PCR从小鼠肝脏组织中克隆mPNAS-4编码区cDNA,构建重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-mPNAS-4;用脂质体将pcDNA3.1(+)-mPNAS-4转染小鼠Lewis肺癌LL2细胞;用RT-PCR检测转染细胞中mPNAS-4的过表达情况;通过MTT、流式细胞术(FCM)及DNA Ladder分别检测转染细胞的增殖与凋亡情况.结果:从小鼠肝脏组织中克隆到mPNAS-4全长cDNA并成功构建其真核表达载体pcDNA3.1(+)-mPNAS-4,转染小鼠Lewis肺癌LL2细胞可使其mRNA表达明显上调.mPNAS-4过表达能抑制LL2细胞增殖并诱导其凋亡.结论:mPNAS-4过表达对小鼠Lewis肺癌LL2细胞的生长有明显的抑制和诱导凋亡作用.
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低能脉冲超声波对巨噬细胞生物学行为的影响
目的:探讨低能脉冲超声波(LIPUS)对巨噬细胞生物学行为的影响,为LIPUS的临床应用提供理论依据.方法:以Ficoll-paque密度梯度离心法分离人白细胞血(buffy coat),获得单个核细胞,培养后再通过黏附法获得巨噬细胞;蛋白芯片分析分泌蛋白的表达,酶谱学检测基质金属蛋白酶(MMP)的分泌;利用荧光标记的大肠杆菌分析细胞吞噬能力;荧光染色法检测基质金属蛋白酶诱导剂(CD147)的表达;Western blot检测信号蛋白的表达.结果:LIPUS加速巨噬细胞对大肠杆菌的吞噬,促进细胞分泌MMP和表达CD147,增加细胞的磷酸化程度和Src、ERK的活化.结论:LIPUS可能通过Src、ERK的活化调控巨噬细胞的吞噬及分泌功能.
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乙肝表面抗原突变体的表达及其初步应用
目的:构建和表达乙肝表面抗原(HBsAg)突变体用于HBsAg抗原性的深入研究.方法:利用定点突变技术构建HBsAg突变体,然后转化毕赤酵母GS115,菌落PCR、高浓度Zeocin抗性筛选鉴定转化子,表达产物经SDS-PAGE分析和Western blot分析,利用AxSYM HBsAg V2(Abbott)酶免试剂盒检测重组表面抗原的活性.结果:通过序列分析确定突变体构建成功,SDS-PAGE显示突变体能在毕赤酵母中有效表达,在Western blot试验中HBsAg突变体被特异性多克隆抗体识别,相对分子质量(Mr)约为38 000,AxSYM试剂盒检测结果表明HBsAg突变体具有一定生物活性.结论:利用毕赤酵母表达系统高效表达出具有一定免疫反应性的HBsAg突变体,对于目前市售试剂盒的质量控制和临床应用有较高的实档用价值.
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脂质体介导pIDO-EGFP转染原代培养软骨细胞的初步研究
目的:检测脂质体介导pIDO-EGFP转染原代培养的C57小鼠关节软骨细胞的瞬时表达及转染效率,建立原代培养的小鼠关节软骨细胞转染方法.方法:大肠杆菌中扩增pIDO-EGFP质粒,在优化条件下通过lipofectamine2000TM转染试剂将pIDO-EGFP质粒转入原代培养的小鼠关节软骨细胞,应用荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察其转染过程及瞬时表达情况,流式细胞术检测其转染效率.结果:质粒携带的增强型绿色荧光蛋白在转染后24h得到了明显表达,48 h后流式细胞术检测其转染效率为36.43%,未影响软骨细胞贴壁过程.结论:经绿色荧光蛋白检测表明,脂质体成功地将IDO基因转染进入原代培养的软骨细胞.转染后的软骨细胞在体外仍能存活,在优化的条件下能达到良好的瞬时转染效率,为组织工程化软骨细胞基因导入和基因修饰提供了思路.
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IDO修饰的成纤维细胞培养上清对小鼠T淋巴细胞增殖的影响
目的:检测吲哚胺2-3双加氧酶(IDO)基因修饰的细胞对T淋巴细胞的免疫抑制作用.方法:将pEGFP-N1-mIDO真核表达载体转染至小鼠NIH 3T3成纤维细胞系.体外检测mIDO修饰的成纤维细胞培养液中色氨酸水平的变化;使用CFSE标记技术,检测mIDO修饰的成纤维细胞培养液对ConA刺激的小鼠T淋巴细胞增殖的影响.结果:将pEGFP-NI-mIDO转入NIH 3T3成纤维细胞,流式细胞术(FCM)检测到EGFP的表达;体外实验表明,成纤维细胞培养上清和转染pEGFP-N1的成纤维细胞培养上清可检测到一定量的色氨酸水平,而转染pEGFP-N1-mIDO的成纤维细胞培养上清未检测到色氨酸,提示pEGFP-N I-mIDO转染的成纤维细胞表达了具有活性的mIDO;使用CFSE标记技术,检测mIDO修饰的成纤维细胞培养上清对小鼠T淋巴细胞增殖的影响,发现ConA刺激的IDO组,72 h后亲代细胞占各代细胞的百分率明显高于对照组.结论:IDO基因修饰的成纤维细胞可抑制T淋巴细胞的增殖.
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细胞因子诱导的杀伤细胞对卵巢癌耐药细胞SKOV3/CDDP的作用机制
目的:探讨卵巢癌耐药细胞在癌变过程中免疫逃逸的分子机制以及细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)对其耐药性及免疫原性的影响.方法:采用电镜、流式细胞术(FCM)、MTT等检测方法,观察CIK细胞作用人卵巢癌耐药细胞系SKOV3/CDDP细胞超微结构、细胞周期、凋亡率、耐药相关基因MDR1和Topo-Ⅱβ以及hB7-1、hB7-2、MHC Ⅰ b、HLA-DR抗原表达的变化;应用放射免疫(RIA)ELISA等方法检测CIK细胞作用于和荷人卵巢癌SKOV3/CDDP耐药细胞SCID小鼠腹腔移植模型后血清IL-2、TNF-α、IFN-γ、GM-CSF等细胞因子含量的改变.结果:电镜显示:CIK组可见较多的凋亡细胞,表现为细胞体积萎缩,膜发泡,细胞密度增加,线粒体浓缩染色质固缩于核膜周边;与生理盐水组相比,CIK组的G0/G1期细胞比例下降,S+G2/M期细胞比例升高,细胞周期阻滞于S+G2/M期,有统计学意义(P＜0.05);在抑制细胞增殖的同时,尚诱导细胞凋亡,其细胞凋亡率为9.07%,二者比较,有统计学意义(P＜0.05);与NS组相比,CIK组细胞MDR-1和Topo-Ⅱβ表达明显下降(P＜0.05),提示CIK细胞可逆转人卵巢癌耐药细胞SKOV3/CDDP细胞耐药相关基因MDR1和Topo-Ⅱβ的表达;与NS组相比,CIK组细胞MHCⅠ b、HLA-DR、hB7-1和hB7-2抗原的表达均明显升高(P＜0.01).提示CIK细胞可提高人卵巢癌耐药细胞株SK-OV3/CDDP的免疫原性;与NS组相比,CIK组小鼠血清中IL-2、TNF-α、INF-γ、GM-CSF含量均明显增加(P＜0.01).结论:CIK细胞在将卵巢癌耐药细胞的细胞周期阻滞于S+G2/M期的同时,尚能诱导其凋亡,降低耐药基因的表达,提高耐药细胞的免疫原性,分泌IL-2、TNF-α、INF-γ、GM-CSF等具有抗肿瘤活性的细胞因子发挥抗肿瘤作用.
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STAT5、cyclinD1和c-myc蛋白在非小细胞肺癌中的表达及临床意义
目的:探讨信号转导和转录激活因子-5(STAT5)、细胞周期素D1(cyclinD1)和c-myc蛋白在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达及意义.方法:用免疫组化SP法检测38例手术切除的NSCLC和20例正常肺组织中STAT5、cyclinD1和c-myc的表达.结果:STAT5、cyclinD1和c-myc在NSCLC中的表达明显高于正常肺组织(P＜0.01),且它们的表达与患者的年龄、肿瘤大小、组织分化程度、淋巴结转移及TNM分期等病理因素无关(P＞0.05).在NSCLC中,STAT5和cyclinD1的表达呈正相关(P＜0.05),而STAT5与c-myc的表达、cyclinD1和c-myc的表达无相关性.结论:在NSCLC中存在STAT5、cyclinD1和c-myc的过度表达,但与临床病理因素无关.在肿瘤的发生中,STAT5可能是通过上调cyclinD1表达,促进细胞周期进展和细胞转化,诱导肿瘤的形成.
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急性心肌梗死患者的心理状态及护理措施
心理护理主要是通过护理人员的语言、行为、表情、姿势、态度及气质等诸多方面来改善和影响患者的情绪[1],解除其顾虑和烦恼,从而增强战胜疾病的信心和意志,减轻或消除引起患者痛苦的各种不良情绪和行为,以及由此产生的种种驱体症状,使患者能在佳心理状态下接受治疗和护理,达到早期康复的目的.
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PI3K信号途径在哮喘患者外周血单个核细胞中的表达及意义
目的:初步了解磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)在急性发作期哮喘患者外周血单个核细胞(PBMC)中的活化情况,并观察其特异性抑制剂(Wortmannin)对Th1、Th2型细胞因子IFN-γ和IL-4表达的影响,探讨PI3K信号途径在哮喘T细胞免疫紊乱中可能的作用机制.方法:以20例急性发作期哮喘患者作为实验组,15例健康人为对照组.PBMC提取采用Ficoll密度梯度离心法,半定量RT-PCR法测定PBMC中PI3KmRNA的表达,ELISA法测定不同浓度组Wortmannin处理的PBMC培养上清液中IFN-γ、IL-4水平.结果:与对照组相比,急性发作期哮喘患者PI3KmRNA表达增高(P＜0.05).哮喘患者PBMC培养上清液IFN-γ水平低下、IL-4水平升高,与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05和P＜0.01);同时加入不同浓度Wortmannin共培养后,实验发现均浓度依赖性地抑制了哮喘组及对照组IL-4的产生(P＜0.05或P＜0.01),而同组不同浓度梯度组间比较IFN-γ产生升高,但差异无统计学意义.结论:哮喘患者急性发作时可能存在PI3K信号途径的过度活化,其过度活化对Th1型细胞因子IFN-γ影响不明显,有可能主要通过介导Th2型细胞因子IL-4的产生而参与Th1/Th2的失衡.
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预防性重组HPV58-减毒志贺氏杆菌载体活疫苗的研制及免疫学特性
目的:构建预防性重组HPV58-减毒志贺氏杆菌载体活疫苗,并研究其免疫学特性.方法:克隆HPV58L1基因并重组入自杀载体pCVD442,减毒志贺氏杆菌Sf301:△virG、辅助质粒PRK2013、重组自杀载体pCVD442-HPV58L1进行筛选杂交,经氨苄抗性培养基、刚果红培养基双重选择,获得重组的含HPV58L1基因的减毒志贺氏杆菌菌株.Western blot检测HPV58L1蛋白表达.用豚鼠角结膜炎模型进行疫苗动物免疫试验,ELISA检测豚鼠血清中特异性抗体,ELISPOT检测豚鼠脾及淋巴结中抗原特异性IgG、IgA产生细胞频数.结果:Western blot法证实该菌株可表达HPV58L1蛋白.豚鼠免疫保护试验发现:HPV58L1-减毒志贺氏杆菌不引起角结膜炎,经用野生型sf301攻击后有80%豚鼠不发病.免疫后第20天,免疫豚鼠血中抗HPV58L1特异性IgG、IgA明显升高,而对志贺氏杆菌菌体抗原(LPS)仅产生低效价的IgG抗体.EHSPOT结果显示,脾和淋巴结的IgA-ASC及IgG-ASC明显升高.结论:成功构建了预防性重组HPV58-减毒志贺氏杆菌载体活疫苗,能诱发免疫动物较强的体液免疫反应,激发保护性抗体的产生.
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阳离子脂质体介导TIMP-3基因对兔血管平滑肌细胞增殖和凋亡的影响
目的:通过阳离子脂质体介导含有TIMP-3基因的质粒转染体外兔平滑肌细胞,观察瞬时表达的TIMP-3对细胞增殖及凋亡的影响.方法:构建兔TIMP-3基因质粒表达载体.按照正常对照组、空质粒组、重组质粒载体组将72孔兔血管平滑肌细胞分为3组,每组又分为24、48、72 h 3个亚组.阳离子脂质体介导质粒分别转染相应组细胞,正常对照组无质粒加入.转染后进行细胞计数,描绘生长曲线;将24孔细胞分为3组进行基因转染,转染后48 h检测细胞凋亡率.结果:正常对照组细胞数、细胞凋亡率与空质粒组相比均无明显差别;重组质粒组细胞数与前二者相比明显减少(P＜0.05),重组质粒组细胞凋亡率均明显高于前二者(P＜0.05).结论:TIMP-3对体外血管平滑肌细胞具有明显抑制增值及促进细胞凋亡的作用;阳离子脂质体作为新型、高效转染介质对细胞生长无明显不良反应,使用安全,应用于TIMP-3基因治疗支架后再狭窄前景广阔.
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来氟米特对紫癜性肾炎患者血清IL-6、IL-8及TNF-α水平的影响
目的:探讨来氟米特对过敏性紫癜性肾炎患者血清白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素8(IL-8)及肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平的影响及其临床意义.方法:应用双抗体夹心ELISA法对23例过敏性紫癜性肾炎患者治疗前后血清IL-6、IL-8和TNF-α水平进行检测,23例健康成人作为正常对照组.结果:过敏性紫癜性肾炎患者血清IL-6、IL-8和TNF-α水平明显高于正常对照组,来氟米特治疗后患者IL-6、IL-8和TNF-α水平明显降低(P＜0.05).结论:IL-6、IL-8和TNF-α参与过敏性紫癜性肾炎的发生发展,来氟米特治疗过敏性紫癜性肾炎可能与调节炎性细胞因子的产生,抑制炎症反应有关.
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AG490阻断肝癌细胞Stat3信号通路逆转免疫抑制的实验研究
目的:检测Stat3 mRNA在肿瘤细胞中的表达,研究JAK酶抑制剂AG490阻断Stat3信号通路对免疫抑制因子基因表达的影响,探讨应用AG490阻断肿瘤细胞Stat3信号通路逆转免疫抑制的可行性.方法:RT-PCR法检测Stat3mRNA表达;动态检测AG490作用前后肝癌细胞Stat3 mRNA表达以及VEGF、TGF-β和IL-10等免疫抑制因子基因的表达情况.结果:在所检测的人肿瘤细胞中5种有Stat3 mRNA的表达;AG490阻断肝癌细胞Stat3通路后,免疫抑制因子VEGF、TGF-β和IL-10等的mRNA表达减弱甚至消失.结论:AG490可通过阻断Stat3信号转导通路逆转免疫抑制,发挥抗肿瘤效应.
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抗土霉素单克隆抗体的制备及其特性分析
目的:制备抗土霉素(OTC)的单克隆抗体(mAb),对其特异性和竞争ELISA的实用性进行分析.方法:通过碳二亚胺法和羰基二咪唑法分别将OTC与载体蛋白(BSA、OVA)偶联制备免疫原和检测抗原,用杂交瘤技术制备mAb,鉴定mAb的特异性并用于竞争ELISA效果分析.结果:获得1株能稳定分泌抗OTC的mAb杂交瘤细胞株,mAb腹水的ELISA效价为3×104,土霉素竞争ELISA检测下限为1mg/L.结论:抗OTC的mAb具有抗原结合特异性,可用于OTC竞争ELISA免疫学检测.
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人DcR3融合蛋白的表达、纯化及多克隆抗体的制备
目的:制备DcR3融合蛋白及其多克隆抗体,并鉴定其特异性.方法:将亚克隆构建的pET28a(+)/DcR3重组表达质粒转化人大肠杆菌(E.coli)BL21菌株,IPTG诱导表达,镍柱亲和层析法纯化目的蛋白,SDS-PAGE及Western blot分析蛋白产物,将纯化的目的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,并对其进行纯化及鉴定.结果:pET28a(+)/DcR3重组表达质粒在E.coli中诱导表达相对分子质量(Mτ)为33 000的目的蛋白,表达量约占菌体蛋白总量的38%,纯化后的目的蛋白纯度达98%.Western blot显示纯化蛋白与抗DcR3单克隆抗体(mAb)具有良好的反应性.纯化后多克隆抗体效价达1.28×10-6.结论:DcR3蛋白在E.coli中得到高效表达,成功制备高纯度DcR3蛋白及高效价抗DcR3多克隆抗体,为研究DcR3在组织中的表达、分布,研制ELISA试剂盒以检测恶性肿瘤及自身免疫性疾病等患者血清DcR3表达水平提供实验基础.
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人源抗癌胚抗原单克隆抗体的获得与鉴定
目的:获得抗癌胚抗原(CEA)的单克隆抗体(mAb).方法:采用特殊的5轮筛选法(逐轮降低抗原包被量,严格洗脱条件),以固相化的人源CEA抗原淘筛本室构建的人源特异性噬菌体抗体库.获得有特异结合活性的CEA噬菌体抗体,酶切鉴定插入的抗体基因.切去噬菌粒上衣壳蛋白gⅢ基因,构建表达载体,在大肠杆菌中可溶性表达抗CEA抗体Fab段,ELISA、Westem blot检测抗体免疫学活性,测序分析抗体基因.结果:筛选出4株与CEA抗原特异结合而与BSA、HBsAg无交叉结合反应的噬菌体抗体.切去gⅢ基因,在大肠杆菌中表达可溶性抗体Fab段,表达量在细菌培养液上清和细菌裂解液中无统计学意义.可溶性抗体与人CEA抗原有特异结合活性,与BSA、HBsAg无交叉结合反应.Western blot显示在略大于相对分子质量(Mr)45 000处有一明显条带,与Mr48000的Fab大小一致.DNA测序分析表明Fab段VH属于IgG VH3基因家族,VL属于Vk1基因家族.结论:抗CEA噬菌体抗体库的构建和人源抗CEA mAb的制备,为CEA阳性表达肿瘤的靶向治疗奠定基础.
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抗人CD33单链抗体的基因构建、表达及其生物活性检测
目的:构建及表达抗人CD33单链抗体(抗CD33-scFv)基因,并检测其生物活性.方法:采用RT-PCR方法从分泌抗人类白细胞表面分化抗原CD33单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞中克隆出VL和VH可变区基因,再通过重叠延伸拼接(splice-overlap extension)PCR方法在VH和VL可变区基因之间引入柔性连接肽(Gly4Ser)3,体外构建抗人CD33-scFv基因.将其克隆至原核表达载体PET-28a(+)并在大肠杆菌Rosetta(DE3)中表达.结果:SDS-PAGE和Westem blot分析结果表明,抗CD33-scFv在Rosetta(DE3)菌中获得高效表达,重组蛋白的相对分子质量(Mr)为30000,表达产物以不溶性包涵体形式存在,经过溶解包涵体,镍柱亲和层析纯化和体外复性过程,获得了高纯度的scFv片段.流式细胞术(FCM)分析结果证实抗CD33-scFv可与人类白细胞表面的分化抗原CD33结合,保留了鼠源性mAb的与CD33结合的活性.结论:重组抗人CD33-scFv基因构建与表达成功,并且通过复性得到有生物活性的scFv,为下一步针对髓系恶性肿瘤的靶向治疗奠定了基础.
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抗HIV-1外膜蛋白单链抗体基因的酵母表达和生物活性分析
目的:构建含抗HIV-1外膜蛋白gp120单链抗体(scFv)基因的酵母表达载体,实现目的蛋白的分泌性表达,并检测其生物活性.方法:采用基因工程和重组DNA技术,从质粒pET28-scFv中切下目的基因片段,定向克隆入毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9的相应位点,构建重组酵母表达质粒pPIC9-scFv.Bgl Ⅱ线性化后,电转化入受体酵母菌GS115中,筛选阳性重组子,进行甲醇诱导表达,并用RT-PCR、SDS-PAGE、双抗体夹心Dot-ELISA法分析目的蛋白表达情况.结果:通过表型筛选、PCR鉴定获得阳性重组酵母工程菌,RT-PCR、SDS-PAGE分析表明目的蛋白得到很好表达,表达量可占培养液上清总蛋白量的18%,双抗体夹心Dot-ELISA法检测,表达产物能够特异识别重组HIV-1 gp120抗原蛋白并与之发生特异性免疫反应,证明表达的重组scFv具有良好的抗体活性.结论:成功地实现了scFv基因的分泌性表达,为抗AIDS靶向治疗及进一步研究其抗HIV活性提供了依据.
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抗重组人bFGF单克隆抗体可变区基因克隆及单链抗体的构建和表达
目的:从分泌抗重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)单克隆抗体(mAb)杂交瘤细胞株B2F3中克隆抗体可变区(V)基因,构建bFGF单链抗体(scFv),并进行可溶性表达.方法:从分泌bFGF mAb杂交瘤细胞株B2F3提取总RNA,用RT-PCR方法扩增抗体重链可变区基因(VH)和轻链的可变区基因(VL);再通过重叠延伸拼接(SOE)PCR方法,在VH和VL基因之间引入linker(Gly4Ser)3,构建bFGF scFv.将测序正确的scFv基因克隆到表达载体pCANTAB 5E中,选择非抑制型菌株E.coli HB2151进行可溶性表达;经SDS-PAGE检测抗体表达水平,ELISA鉴定其抗原结合活性.结果:测序分析结果显示,VH基因序列全长375碱基对,编码125个氨基酸,VL基因序列全长399碱基对,编码133个氨基酸,二者均符合小鼠免疫球蛋白可变区基因特征,含有4个框架区(FR)、3个抗原互补决定区(CDR)及抗体特征性的2个半胱氨酸残基;构建的scFv全长789碱基对,编码263个氨基酸,连接结构为VH-linker-VL.SDS-PAGE分析表明scFv基因在大肠杆菌为可溶性表达,表达产物主要位于周质腔中,表达产物的Mr为27 000,与理论预期值相符;间接ELISA检测结果显示原核表达的scFv具有与bFGF特异性结合的活性.结论:成功地克隆bFGF mAb可变区基因,并构建表达bFGF scFv,为下一步研究bFGF抗体人源化改造奠定实验基础.
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IFN-γ诱导人单核细胞MICs分子表达
目的:研究IFN-γ对MHC-I类链相关分子(MICs)表达的调节作用.方法:采用密度梯离离心法分离人外周血单个核细胞(PBMC),以免疫磁珠法从PBMC中特异性分选单核细胞,以细胞因子IFN-γ、TNF-α或IFN-α刺激PBMC、纯化单核细胞或单核细胞系U937、THP-1后,以流式细胞术检测单核细胞表面MICs分子表达.结果:IFN-γ选择性上调人PBMC中单核细胞表面MICs表达;IFN-γ对人原代单核细胞及单核细胞系U937、THP-1细胞表面MICs分子表达均有诱导或上调作用,细胞因子TNF-α、IFN-α对单核细胞MICs分子表达无影响.IFN-γ诱导或上调表达的MICs分子不能被MICA或MICB特异性单克隆抗体(mAb)所识别,可能是一种新的MIC分子或MIC等位基因.结论:IFN-γ能诱导或上调人单核细胞表面MICs分子表达.
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识别HCMV早期抗原单克隆抗体的鉴定及应用
目的:建立人巨细胞病毒(HCMV)感染的实验室早期快速诊断方法.方法:从6株HCMV单克隆抗体(mAb)中,选择1株识别HCMV早期抗原(EA)的mAb进行了进一步鉴定,并用于临床标本中EA的快速诊断.用间接免疫荧光试验筛选出识别EA的mAb8B8,并用Western blot检测EA的相对分子质量(Mr),mAb8B8在免疫组化染色(IHC)方法中用于检测临床标本中的EA.结果:HCMV感染细胞4 h时,用mAb8B8染色,见到核内荧光.该EA的Mr为72000.在73份HCMV阳性标本中测出EA 59份(81%),而用常规细胞培养方法观测到细胞病变效应(CPE)的标本58份(79%),2种方法测定均阳性的44份(60%),仅EA测定阳性的15份(21%),仅检测到CPE的14份(19%),考虑到所有种类的样本,2种方法在检测HCMV方面无统计学意义.结论:mAb8B8可用于HCMV感染的实验室早期快速诊断.
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重组杆状病毒Bacmid-HER2胞外段基因的构建及鉴定
目的:克隆人表皮生长因子受体2胞外段基因(HER2-ECD)的cDNA,构建重组杆状病毒Bacmid-HER2-ECD.方法:从Her2高表达的人乳腺癌细胞系SK-BR-3中提取总RNA,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增HER2ECD基因cDNA.利用T/A克隆连接法,首先构建pMD18-T-HER2-ECD重组质粒,并对基因进行测序.然后通过酶切连接构建供体质粒pFastBac-HER2-ECD.将供体质粒转化入DH10Bac菌与空Bacmid发生转座,得到重组Bacmid-HER2ECD.对重组Bacmid进行PCR法和点杂交鉴定.结果:pMD18-T-HER2ECD内插入片段序列与实际序列一致;pFastBac-HER2ECD经酶切鉴定与预期结果一致.重组Bacmid-HER2ECD通过PCR法能得到目的大小片段,并且能够与特异性探针发生结合.结论:成功地完成了HER2ECD基因的克隆和重组Bacmid-HER2ECD的构建.
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大肠埃希氏菌和肺炎克雷伯氏菌产AmpC酶的检测方法比较
目的:探讨适用于临床微生物常规检测产AmpC酶菌株的方法,为指导临床合理选用抗生素及监控产酶株的流行提供依据.方法:用Tris-EDTA纸片法和聚合酶连反应(PCR)2种试验检测AmpC酶并进行比较.结果:大肠埃希氏菌42株及肺炎克雷伯氏菌18株共60株中,Tris-EDTA纸片法检测出产AmpC酶30%(18株),PCR法为28%(17株).Tris-EDTA纸片法与PCR法符合率(98.3%),敏感率为100%,特异性为97.8%.结论:Tris-EDTA纸片法简便实用.可作为产AmpC酶菌株的检测方法在基层临床微生物室应用.
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大鼠肝硬化模型中小肝细胞分离培养方法的建立及其表型分析
目的:探讨体外分离培养大鼠小肝细胞(SHC)的方法,并对其进行表型鉴定.方法:利用二乙基亚硝胺饲喂法,建立SD大鼠肝硬化模型.采用改进后两步胶原酶灌注消化法分离细胞.光镜下观察细胞形态.电镜下观察细胞形态及超微结构.采用计数法测定细胞生长曲线,流式细胞术(FCM)测定细胞周期.通过免疫细胞化学染色法进行表型鉴定.结果:原代培养的大鼠SHC,24h内即可见贴壁伸展,48h左右克隆形成.光镜下可观察SHC核仁小而清晰,胞质少,细胞体积较小;电镜下可见SHC表面少量短而小的微绒毛突起,细胞体积小,核浆比例高,呈现未分化细胞的形态.免疫细胞化学染色显示SHC胞质AFP、CK-7、CK-8及CK-19呈棕黄色阳性信号.结论:改进后的两步胶原酶灌注消化方法能较容易地获得大量纯度较高的SHC.
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鸡痘病毒ORF214原核表达蛋白单克隆抗体的制备及其初步鉴定
目的:经发表的鸡痘病毒美国致病株(FPVUS)ORF214基因序列,利用PCR方法扩增出目的片段,测序后并克隆至原核表达载体pET-28a,用表达产物制备抗FPVORF214蛋白单克隆抗体(mAb).方法:以鸡痘病毒ORF214原核表达蛋白作为免疫原,免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与Sp2/0细胞融合,用间接ELISA方法检测筛选.结果:阳性细胞株经3代克隆纯化后,获得3株能稳定分泌抗FPV ORF214蛋白mAb的杂交瘤细胞株,分别命名为2F10C9、3C3 B10、2G8G7.3株杂交瘤细胞分泌的抗体均能够特异地与FPV ORF214蛋白反应,细胞上清ELISA效价均在1×102以上,mAb腹水效价达1×104以上.结论:该特异性mAb的研制成功为进一步研究ORF214的生物学特性奠定基础.
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鸡B淋巴细胞cDNA T7噬菌体表达文库的构建与鉴定
目的:构建鸡B淋巴细胞cDNA T7噬菌体表达文库并对文库质量进行鉴定.方法:利用oligo(dT)-纤维素亲和层析从SPF雏鸡法氏囊细胞制备mRNA,合成的双链cDNA定向克隆到T7 EcoR Ⅰ/Hind Ⅲ载体臂,包装并构建cDNA表达文库.对文库进行滴度测定和重组子测定.扩增文库并进行PCR鉴定插入序列的长度及分布.结果:文库初始滴度为5×107pfu/mL,扩增后滴度达到1.88×10 10 pfu/mL.插入片段平均长度1 440 bp,主要分布在750～2000 bp之间.结论:构建的鸡B淋巴细胞cDNA T7噬菌体表达文库具有很高的质量,为进一步研究鸡B细胞发育以及传染性法氏囊病毒(IBDV)的分子致病机制奠定了实验基础.
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小鼠PGRP-L编码区基因的克隆及序列分析
目的:获得小鼠长型肽聚糖识别蛋白(mPGRP-L)全长编码区基因.方法:采用RT-PCR技术,从BALB/c鼠肝组织总RNA中扩增PGRP-L编码区基因片段,将其插入pUCm-T载体,以PCR和测序进行鉴定.结果:从BALB/c小鼠肝脏cDNA中,分别以Primer-F和Primer-R1、Primer-F1和Primer-R为引物对进行PCR,扩增得到约1 050 bp的上游基因片段和约540 bp的下游基因片段.以纯化的上、下游片段为模板,Primer-F和Primer-R为引物进行PCR,扩增获得约1 600 bp的DNA片段,并将其克隆至pMD18-T载体获得重组质粒pMD18-mPGRP-L.鉴定结果表明,mPGRP-L编码区基因全长1 593 bp,与GenBank中mPGRP-L cDNA比较仅2个位置的核苷酸不同,两者的同源性为99.87%.结论:成功地克隆了mPGRP-L的cDNA,为mPGRP-L分子的研究奠定了一定基础.
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保护性基因A20在血管内皮细胞中的诱导表达
目的:研究人Th2细胞因子对牛主动脉内皮细胞(BAEC)诱导表达保护性基因A20的影响,探讨人Th2细胞因子对异种VEC具有保护效应的机制.方法:建立BAEC的体外培养体系,用浓度为20 μg/L的各Th2细胞因子(hIL-4、hIL-10、hIL-13)分别孵育BAEC 2 h后,再与肿瘤坏死因子α(TNF-α、4 μg/L)共孵育24 h后收集细胞;应用RT-PCR方法检测各组BAEC中A20 mRNA的表达.结果:用Th2细胞因子在一定浓度内预处理BAEC后,能明显诱导BAEC表达保护性基因A20.结论:Th2细胞因子对BAEC的保护作用与Th2细胞因子诱导保护性基因A20在BAEC中的表达有关.
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幽门螺杆菌基因工程疫苗的研究进展
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)感染是慢性活动性胃炎和消化性溃疡的主要病因,与胃腺癌、B细胞淋巴瘤的发生亦密切相关.世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)已将Hp列为Ⅰ类致癌因子[1].流行病学调查显示,全世界成年人口约50%携带该菌[2].
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CD226/CD112(DNAM-1/NECTIN-2)对肥大细胞的协同刺激
肥大细胞在各种各样的免疫反应中发挥着重要的功能效应.在过敏性炎症中,肥大细胞和组织浸润的嗜酸性粒细胞相互作用,从而在迟发性和慢性过敏反应中形成一个调节单位,然而,其过程中所涉及的通路和通路中的分子还不十分清楚.
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DNAM-1介导静止NK细胞对新分离的卵巢癌细胞的识别杀伤
NK细胞杀伤肿瘤的功能是众所周知的,但是对于静止NK细胞和新分离的人类肿瘤细胞间的相互作用几乎未见报道.近,有研究针对来自健康供体的静息状态NK细胞和晚期卵巢癌患者低表达HLA Ⅰ类分子的卵巢癌细胞进行了相关实验.
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肥大细胞新角色
众所周知,同种异体移植物的长久维持是依赖于CD45+CD25+Foxp3+Treg所介导的免疫抑制作用,而肥大细胞一直以来仅被人们认为是过敏反应的初级应答产物.
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TLR2通过直接结合识别一种细菌的脂肽
Toll样受体(TLRs)是一类跨膜蛋白分子,胞外区包括富含亮氨酸的重复序列(LRRs)和1-2个富含半胱氨酸的重复序列(CRR),胞内部分包含一个Toll/IL-1R(TIR)同源结构域,为信号转导所必需.TLRs是单核-巨噬细胞表面重要的模式识别受体,能够识别病原体表面某些物质并引起免疫细胞活化,并在诱发针对多种细菌产物(包括脂多糖、脂蛋白)的固有免疫应答过程中起到非常重要的作用.
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特定序列的siRNA可通过TLR7引起Ⅰ型干扰素反应
RNA干扰(RNA interference,RNAi)是双链RNA介导的转录后基因沉默现象.在无脊椎动物中,直接给予长的双链RNA(double-strand RNA,dsRNA)就可以引起RNAi现象,但是在哺乳动物中,长链dsRNA可以引起机体的防御性免疫反应,导致Ⅰ型干扰素的大量产生.
| 年 | 期数 |
| 2018 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2017 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2016 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2015 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2014 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2013 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2012 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2011 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2010 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2009 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2008 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2007 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2006 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2005 | 01 02 03 04 05 06 z1 |
| 2004 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2003 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2002 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2001 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2000 | 01 02 03 04 05 06 |
| 1999 | 01 02 |
| 1995 | 01 02 03 |
| 1994 | 01 02 |
| 1993 | 01 02 03 04 |
| 1992 | 01 02 03 04 |
| 1991 | 01 02 03 04 |
| 1990 | 01 02 |
| 1989 | 01 02 03 04 |
