细胞与分子免疫学杂志
Chinese Journal of Cellular and Molecular Immunology 세포여분자면역학잡지
- 主管单位： 中国免疫学会；第四军医大学
- 主办单位： 陕西省免疫学会,中国免疫学会
- 影响因子： 0.81
- 审稿时间： 1-3个月
- 国际刊号： 1007-8738
- 国内刊号： 61-1304/R
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
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HCV NS5A-B片段的表达及在酶活性研究中的应用
目的:利用原核表达载体pBVIL1,表达丙型肝炎病毒非结构蛋白3(NS3)丝氨酸蛋白酶催化底物NS5A-B小分子,为进一步研究蛋白酶活性提供方法学.方法:将PCR合成的NS5A-B(2 412-2 427aa)基因直接插入高效原核表达载体pBVIL1,融合表达NS5A-B片段,包涵体形式的表达产物用8 mol/L脲溶解后,采用离子交换和凝胶过滤两步纯化.利用SDS-PAGE、Western blot和ELISA方法,于37℃酶催化条件下,分析NS5A-B底物的降解活性.结果:(1)构建了pBVIL1/NS5A-B重组质粒,鉴定证明NS5A-B基因片段正确地插入表达载体上.融合蛋白在转化质粒的HB101菌中得到高效表达.分离纯化重组蛋白后浓度可达0.73 g/L.(2)在NS3蛋白酶作用不同时间后,用SDS-PAGE和Western blot证实,底物带可被明显降解,ELISA分析也证明,NS5A-B具有酶底物活性.结论:含有酶切位点的NS5A-B融合蛋白可被NS3丝氨酸蛋白酶有效地降解,可用作为NS3蛋白酶的底物,可替代全长NS5A-B和化学合成肽用于酶活性和酶阻断剂的研究.
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RDP1258对大鼠脾细胞增殖功能影响的体内研究
目的:探讨一种新型HLA衍生肽(RDP1258)对大鼠脾细胞增殖的体内免疫抑制作用及其机制.方法:人工固相合成 RDP1258,用 3H-TdR掺入法观察其对体内大鼠脾细胞增殖反应的影响.采用酶化学法及免疫组化染色方法,观察其对体内脾细胞血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)活性的影响.结果:3H-TdR掺入法检测表明,RDP1258可显著抑制脾淋巴细胞转化及MLR的增殖反应;但能够明显提高体内HO-1的活性,并增强其表达.结论:RDP1258体内应用能够显著抑制大鼠脾细胞由丝裂原或同种抗原引起的增殖反应,这种作用可能是通过影响HO-1的活性而实现.
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p42/44 MAPK介导结缔组织生长因子刺激系膜细胞合成分形素
目的:检测结缔组织生长因子(CTGF) 是否可诱导大鼠肾小球系膜细胞分泌趋化因子分形素(fractalkine,FLK)并探讨其作用机制.方法:应用CTGF刺激培养的静息系膜细胞,在刺激后不同时间点,应用RT-PCR方法测定FLK mRNA的表达,应用ELISA法测定系膜细胞培养上清液中FLK的水平.应用趋化试验测定系膜细胞的培养上清液对单核细胞THP-1的趋化作用.应用Western blot测定CTGF对系膜细胞中磷酸化的蛋白激酶(p42/44 MAPK)表达的作用.应用p42/44 MAPK抑制剂PD98059或UO126预处理,观察CTGF对该上清液中FLK分泌的影响.结果:应用CTGF刺激后,系膜细胞中FLK mRNA的表达上升,其培养上清液中FLK的含量增加.抗FLK抗体可部分地阻止系膜细胞的培养上清液对单核细胞的趋化作用.CTGF可诱导p42/p44 MAPK磷酸化,PD98059或UO126可抑制这一作用,并部分抑制CTGF诱导的系膜细胞培养上清液中FLK的分泌.结论:CTGF可刺激系膜细胞分泌FLK,其作用机制与p42/p44 MAPK的磷酸化有关.
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载体和基因片段的选择对戊型肝炎病毒基因免疫抗原表达的影响
目的:比较不同载体和不同大小的目的基因片段对戊型肝炎病毒(HEV)基因免疫抗原表达的影响,为基于HEV中和抗原表位的HEV基因免疫提供一定的依据.方法:将含Ⅳ型HEV中国株中和抗原表位的p166和p179片段编码基因分别克隆入pTR421和pCDNA3.1两种真核表达载体,用脂质体介导基因转染HepG2人肝癌细胞系,经间接免疫荧光和Western blot分析以及将质粒注射小鼠局部肌肉组织后经免疫组织化学染色检测,分析目的基因在体内外的表达水平.结果:成功构建了pTR421-166、pTR421-179、pCDNA3.1-166和pCDNA3.1-179四种重组质粒,经限制性内切酶双酶切和核苷酸测序鉴定,编码基因正确无误;pTR421-179转染的细胞以及注射小鼠的局部肌肉组织可以检测到p179的表达,而pCDNA3.1-179、pCDNA3.1-166以及pTR421-166均检测不到目的基因在体内、外的抗原表达.结论:载体和目的基因片段的选择显著影响HEV抗原在体内、外的表达,直接关系到基因免疫的成功与否.
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人脐血树突状细胞分泌外来体的特性及其增强CTL杀伤活性的研究
目的:探讨脐血树突状细胞(UBDC)及其分泌的亚细胞结构外来体(exosomes)的特性,以及他们对细胞毒性T细胞(CTL)杀伤活性的增强作用.方法:分离脐血单个核细胞(UBMC),用rhSCF、rhGM-CSF及rhIL-4诱导12 d,加入经反复冻融提取的肿瘤细胞膜抗原,继续培养2 d.收集DC并从其培养上清中通过离心(1×105 g)分离外来体.用流式细胞术、SDS-PAGE、透射电子显微镜(TEM)和MTT比色法,对DC和外来体的特性及其对CTL杀伤活性的增强作用进行分析.结果:用3种细胞因子体外诱导UBMC 12 d,可使其扩增10倍,并出现DC典型的形态特征.负载肿瘤抗原后,细胞表面可高表达MHC-I、MHC-II、CD40、CD80、CD86、CD11c和CD54.利用超速离心法能从DC培养上清中分离出外来体.混合淋巴细胞反应(MLR)和CTL杀伤活性的分析表明,脐血DC分泌的外来体能有效地刺激T细胞增殖并增强CTL的杀伤活性.结论:由UBMC可诱导出大量的DC并分泌外来体.后者可有效地向CTL细胞递呈肿瘤抗原使之活化并增强其杀伤活性.
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超抗原对NK细胞CD226分子表达与功能的调节
目的:研究超抗原对NK细胞CD226分子表达与功能的调节.方法:以超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A/B(SEA/B)活化PBMC为模型,应用双重免疫荧光染色和流式细胞术分析,观察CD226分子在NK细胞上的变化;采用 51Cr释放实验,观察NK细胞在超抗原作用下杀伤功能的改变;利用激光共聚焦显微镜,观察CD226分子在NK细胞杀伤相的分布.结果:在静止PBMC中,CD56+ NK细胞的百分率为12.3%,CD56+ CD226+细胞仅为1.4%.当效靶比为5:1 时,NK细胞对K562细胞的杀伤率为(3.2±0.2)%.当0.1 mg/L SEA或SEB刺激PBMC 1 d后,CD56+ NK细胞的百分率分别为13.5%和14.1%,CD226在NK细胞上的表达水平明显升高,且主要表达在CD56dim细胞上.在刺激第2天,SEA组CD56+ CD226+占CD56+细胞69.1%,SEB组CD56+ CD226+占CD56+细胞64.3%.刺激第3天,CD226在NK细胞上的表达水平均较第2天明显下降.在超抗原0.1 mg/L作用3 d中,SEA组和SEB组NK细胞杀伤率均明显高于同期未刺激组NK细胞的杀伤率及新鲜分离NK细胞的杀伤率(P<0.05),在作用的第2天,SEA组和SEB组杀伤率均达到峰值分别为(82.3±6.9)%和(80.6±7.5)%.激光共聚焦结果显示,CD226分子与LFA-1分子共定位于NK细胞与K562细胞的接触部位.结论:超抗原SEA和SEB可提高NK细胞杀伤活性,可能与其促进CD226分子在NK细胞上的表达相关,CD226分子可能参与NK细胞免疫突触的形成.
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人细胞增殖相关激酶plk3基因逆转录病毒载体的构建及对细胞增殖的影响
目的:构建人细胞增殖相关激酶基因plk3的逆转录病毒载体(RV),观察该基因对细胞增殖和细胞周期的影响.方法:将plk3基因亚克隆至pMSCV-puroR载体中,经酶切和测序鉴定,制备高滴度的RV,以流动感染法高效感染,半固体集落培养法测定基因导入率.用嘌呤霉素筛选后,获得K562-plk3-puroR和HL60-plk3-puroR细胞.以野生型细胞和导入空载体的K562-puroR和HL60-puroR细胞作为对照,用PCR鉴定基因的导入,并测定细胞周期及凋亡率等,研究plk3基因导入对细胞的影响.结果:获得pMSCV-plk3-puroR质粒并经酶切和测序证实.对K562和HL60细胞的基因导入率,分别达82.3%±3.70%和62.9%±4.94%(n=3).经嘌呤霉素筛选后,转基因细胞的阳性率>99%.K562-plk3-puroR和HL-60-plk3-puroR转基因细胞的增殖曲线比对照细胞降低(P<0.01);而导入空载体的K562-puroR和HL60-puroR细胞的增殖曲线与野生型细胞相比较无显著差异.与K562细胞相比较,常规培养时,处于G0～G1期的K562-plk3-puroR细胞增多[(49.7±3.38)% vs (43.9±2.34)%,P=0.03].以无血清培养基培养10 h后,进入S期的K562-plk3-puroR细胞减少[(43.6±3.74)% vs (54.5±1.52)%,P=0.02],凋亡率降低[(1.3±0.31)% vs (3.4±0.37)%,P=0.01].结论:构建了plk3基因的逆转录病毒载体,发现plk3基因的导入可延缓细胞增殖,并抑制细胞进入增殖周期.
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NF-κB哑铃形诱骗剂ODN对骨髓瘤细胞生长及IL-6表达的抑制作用
目的:设计合成靶向NF-κB的哑铃形诱骗剂ODN,分析靶向NF-κB 的哑铃形诱骗剂对NF-κB转录活性、多发性骨髓瘤细胞8266的生长及其分泌的IL-6的抑制效应.方法:采用电泳迁移率变动分析(EMSA)体外检测诱骗剂ODN对NF-κB转录活性的抑制效应.将8266细胞随机分为传代培养的8266细胞组;诱骗剂ODN处理组及脂质体处理组.通过阳离子脂质体以2 mg/L、4 mg/L、8 mg/L不同剂量诱骗剂ODN转染8266细胞.转染后8、12、18 h,ELISA法检测8266细胞培养上清中IL-6的表达.用MTT比色检查诱骗剂ODN 对IL-6刺激的8266细胞生长的影响.结果:硫代磷酸的诱骗剂ODN在体外能有效地抑制NF-κB与其顺式元件的结合;2 mg/L、4 mg/L、8 mg/L等不同浓度的脂质体-ODN复合物对8266细胞表达IL-6的抑制程度不同.脂质体-ODN复合物对8266细胞的生长及IL-6的活性均有抑制作用.结论:靶向NF-κB的诱骗剂ODN在体外可抑制NF-κB的转录活性,从而抑制8266细胞的生长,降低瘤细胞中IL-6的表达.
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香加皮羽扇豆烷乙酸酯(CPLA)对树突状细胞分化成熟的影响
目的:探讨香加皮羽扇豆烷乙酸酯(CPLA)对人外周血单个核细胞(PBMC)来源的树突状细胞(DC)在体外分化成熟及免疫活性的影响.方法:从人外周血分离单个核细胞,与细胞因子GM-CSF、IL-4共培养,于第5天加入DC的促成熟刺激剂TNF-α(阳性对照组)或CPLA.倒置显微镜和透射电镜下观察DC的形态;应用流式细胞术检测成熟DC的表面标志CD1a、CD83、CD80和CD86的表达情况;用ELISA检测DC培养上清中IL-12和IFN-γ的含量;用MTT法测定DC刺激T细胞增殖的能力.结果:培养10 d后,经CPLA刺激的PBMC呈现出典型DC的形态学特征;成熟DC的特征性表面分子CD1a、CD83、CD80和CD86表达水平均明显上调(P<0.05);细胞培养上清中IL-12和IFN-γ含量明显增高(P<0.05);刺激T细胞增殖的能力明显增强(P<0.05).结论:CPLA可诱导PBMC来源的DC分化成熟,并可促进其细胞因子的分泌,增强DC的免疫调节活性.
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CD80-IgG1 Fc段融合蛋白真核表达载体的构建及表达
目的:构建人CD80-IgG1 Fc段融合蛋白的真核表达载体CD80-IgG1 Fc/pcDNA3.1(+),并在CHO细胞中进行表达.方法:应用T-A克隆技术和亚克隆技术,构建人CD80膜外段-IgG1 Fc段融合蛋白的真核表达载体CD80-IgG1 Fc/pcDNA3.1(+),并将其转染入CHO细胞株并筛选,进行稳定表达.通过Western blot及ELISA法,检测融合蛋白的表达.结果:成功地构建了真核表达载体CD80-IgG1 Fc/pcDNA3.1(+),并建立CHO细胞稳定表达株.Western blot及ELISA法检测到细胞培养上清中有融合蛋白的表达.结论:成功地构建了人CD80膜外段-IgG1 Fc段融合蛋白的真核表达载体CD80-IgG1 Fc/pcDNA3.1(+),并在CHO细胞中稳定表达,为下一步抗肿瘤的研究奠定了基础.
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体外扩增过程中人骨髓间充质干细胞的增殖与分化规律
目的:系统考察体外扩增过程中人骨髓间充质干细胞(MSC)的增殖与分化规律,为MSC在组织修复以及细胞治疗中的应用提供参考.方法:以全骨髓贴壁法分离成人肋骨骨髓MSC,在相同条件下分别考察各代细胞形态、生长、表面标记、细胞周期、成骨、成软骨及成脂肪能力的变化情况.结果:随代次增加,MSC增殖能力、成骨、成脂肪能力均有所下降,而成软骨能力无明显降低;成骨、成软骨及成脂肪能力均保持到细胞衰老.在扩增过程中,MSC始终保持较高的纯度,CD29、CD44、CD105的阳性率均在90%以上,CD14、CD34和CD45的阳性率均在4%以下.结论:在体外培养过程中MSC干细胞特性逐渐丢失,其中向骨、脂肪方向的分化潜能较软骨方向更易失去;而多向分化能力的保持较之自我更新能力更为持久.MSC在7代以前可作为基础研究及临床应用的良好对象.
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人NRAGE基因重组腺病毒载体的构建及其对293细胞细胞周期的影响
目的:构建hNRAGE基因的重组腺病毒载体,并研究其对293细胞细胞周期的影响.方法:采用PCR方法扩增hNRAGE基因片段,并亚克隆至腺病毒穿梭质粒载体pAdTrack-CMV中,构建穿梭质粒pAdTrack-CMV/hNRAGE.经测序检测后,用Pme I酶切使pAdTrack-CMV/hNRAGE被线性化,然后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1用电穿孔法共转化大肠杆菌BJ5183,进行同源重组.经Pac I酶切鉴定后,用磷酸钙法转染QBI-293A细胞,包装成重组体腺病毒Ad-hNRAGE颗粒.利用穿梭质粒pAdTrack-CMV中GFP报告基因的表达,观察重组腺病毒的产生,测定病毒颗粒的浓度.用Western blot检测目的基因的表达.采用MTT法检测293细胞的活力,用流式细胞术分析hNRAGE基因对293细胞周期的影响.结果:成功地构建hNRAGE重组腺病毒载体.Western blot检测结果证实,hNRAGE基因可在293细胞中表达.收获病毒后,经测定病毒颗粒的浓度大约为6.5×109个/μL.转染了重组腺病毒Ad-hNRAGE的293细胞与正常细胞相比较,增殖率显著降低,G0-G1和G2-M期的细胞增多,S期的细胞明显减少.结论:hNRAGE基因可能有抑制293细胞生长的作用.
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人颗粒溶素在小鼠巨噬细胞中的表达及其致细胞损伤与诱导凋亡的作用
目的:构建编码活化的人细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表达的天然颗粒溶素(granulysin,GLS)基因的真核表达载体pBudCE4.1/GLS,并转染不同种系来源的小鼠腹腔巨噬细胞.观察GLS在其中的表达及其可能的致细胞损伤与诱导凋亡的作用.方法:将人GLS的编码序列从pEGFP-C1/GLS质粒亚克隆入pBudCE4.1真核表达载体中,鉴定正确后转染不同种系来源的小鼠腹腔巨噬细胞.采用RT-PCR及免疫细胞化学染色法检测GLS的表达.通过测定转染细胞培养上清中的乳酸脱氢酶反映细胞的损伤;通过胞核DNA荧光染色法检测细胞的凋亡.结果:成功地构建了读码框正确的pBudCE4.1/GLS重组子,并在靶细胞中得到高效表达.表达后48 h,观察表达产物对宿主细胞未见有明显的致细胞损伤和诱导凋亡的作用.结论:人GLS基因能够在小鼠巨噬细胞中有效表达.该表达产物对小鼠巨噬细胞无明显的致细胞损伤与诱导凋亡的作用,为进一步建立研究GLS免疫学活性的动物模型奠定了基础.
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夹心ELISA法快速检测肝病患者血清中金属蛋白酶组织抑制剂-1
目的:建立一种快速检测肝病患者血清基质金属蛋白酶组织抑制剂-1( TIMP-1)的双抗体夹心ELISA,了解血清TIMP-1的水平与肝纤维化病程进展程度的关系.方法:以不同浓度的抗人TIMP-1单克隆抗体(mAb)为包被抗体,加入待测抗原以及辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗TIMP-1 mAb作为标记抗体进行方阵滴定,建立双抗体夹心ELISA,并用于临床检测408例肝病患者血清TIMP-1的水平.结果:方阵滴定的结果表明包被抗体浓度为1 mg/L,血清稀释倍数1:100,HRP标记mAb的佳工作浓度为1:400.以此条件建立的夹心ELISA法具有良好的可重复性,中和抑制率在85%以上,稳定性良好,与国外检测TIMP-1的ELISA试剂盒进行对比试验,具有良好的相关性(r=0.988).用于临床快速检测肝硬化的检出阳性率为76.4%,明显高于慢性肝炎(40.2%)和急性肝炎(19.5%,P<0.005),并随着患者肝纤维化程度的加重而升高(P<0.001).结论:血清TIMP-1水平的变化可作为诊断肝纤维化良好指标.本法简便、快速,敏感性高、特异性强,用于肝纤维化的人血清学快速诊断.尤其适于医院及基层医疗单位应用.
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ZnPcS2P2介导的光动力疗法联合mGM-CSF、mB7.1基因修饰的瘤苗治疗小鼠淋巴瘤
目的:研究两亲性酞菁锌光敏剂ZnPcS2P2介导的光动力疗法(ZnPc-PDT)联合GM-CSF、B7.1基因修饰的EL-4细胞,对小鼠淋巴瘤的抑制作用.方法:应用反复多次转染的方法,分别将逆转录病毒pLXSN、pLXSNmGM-CSF、pLXSNmB7.1导入EL-4细胞,分别命名为EL-4/pLXSN、EL-4/GM和EL-4/B7.进行ZnPc-PDT时,经荷瘤小鼠的尾静脉注射ZnPcS2P2,4 h后局部用波长670 nm的激光照射瘤体;光源为670 nm的半导体激光仪.将40只荷瘤小鼠分为5组,每组8只,即对照组(不做任何处理)、EL-4/B7+EL-4/GM对照组、ZnPc-PDT对照组、ZnPc-PDT+EL-4/pLXSN对照组、ZnPc-PDT+ EL-4/B7+EL-4/GM实验组.隔天测量瘤块的大小,观察荷瘤小鼠淋巴瘤的生长情况,并计算瘤块的相对体积(RTV).观察荷瘤小鼠的生存期及瘤组织的病理学改变.结果:实验组的生存率高于各个对照组(P<0.01).ZnPc-PDT组小鼠的生存期略高于EL-4/B7+EL-4/GM组(P=0.01).结论:mB7.1、mGM-CSF基因修饰的瘤苗可显著增强ZnPc-PDT的抗肿瘤效应.
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23-羟基桦木酸体外抑制血管生成的实验研究
目的:探讨23-羟基桦木酸(23-HBA)对体外血管生成的抑制作用.方法:采用磺酰罗丹明B(SRB)法测定23-HBA对人毛细血管内皮细胞(HMEC)增殖、迁移和小管形成的影响;用免疫组化染色法检测HMEC中CD31表达的变化.结果:23-HBA体外可明显抑制HMEC增殖(IC50为40.44 mg/L)、迁移和小管的形成,且呈明显的剂量依赖性.23-HBA的浓度为10 mg/L时,HMEC中CD31的表达明显降低.结论:23-HBA体外具有明显抑制血管生成的作用,有可能成为有效的血管生成抑制剂.
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转染自体胃癌细胞总RNA的树突状细胞诱导个体化免疫治疗的体外实验
目的:探讨转染自体胃癌细胞总RNA的树突状细胞(DC)体外介导抗胃癌的免疫效应.方法:制备短期培养的原代胃癌细胞.用rhGM-CSF、rhIL-4和TNF-α体外诱导胃癌患者外周血单个核细胞(PBMC)中DC的发育和成熟,并转染自体肿瘤细胞总RNA,激活自体T细胞产生CTL,用CCK-8试剂盒检测CTL的杀伤活性.应用流式细胞术及混合淋巴细胞培养技术检测DC的免疫功能状态.用ELISA法测定IL-12和INF-γ的水平.结果:转染自体肿瘤细胞总RNA的成熟DC,不仅可高表达MHC-I、II类分子及CD80、CD83和CD86协同刺激分子,并可获得高效刺激自体或异体T细胞增殖的能力.转染RNA的成熟DC,分泌IL-12的水平及其刺激产生的CTL培养上清液中INF-γ的水平显著高于单纯成熟DC及未成熟DC;且CTL对自体胃癌细胞的杀伤率显著高于异体组.结论:转染自体胃癌细胞总RNA的成熟DC能够体外诱导产生对自体肿瘤细胞具有高度抗原特异性杀伤活性的CTL.
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IgA肾病患者外周血γδT细胞分泌TGF-β1的功能
目的:研究IgA肾病患者外周血γδT细胞分泌TGF-β1的功能.方法:用流式细胞仪分析外周血γδT细胞比率并检测血清IgA的水平,以抗TCRγδ单克隆抗体(mAb)固相法,体外选择性地扩增γδT细胞.在体外培养的条件下,以抗CD3抗体刺激48 h后,用ELISA法测定培养体系中TGF-β1的水平.结果:IgA肾病患者外周血γδT细胞的比例升高,并与血清IgA的水平呈正相关.用抗TCRγδ mAb固相法能获得高纯度的γδT细胞.经抗CD3抗体刺激的IgA肾病患者的γδT分泌TGF-β1的量比正常对照组明显升高.结论:IgA肾病患者的γδT细胞可通过大量分泌TGF-β1参与该病的发生、发展.
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大骨节病患者血清促炎症细胞因子水平的检测
目的:探讨前炎症细胞因子TNF、IL-1β和IL-6在大骨节病(KBD)发病机制中的作用.方法:采集62例KBD患者和60例健康对照的血清标本,采用双抗体夹心ELISA法测定血清前炎症细胞因子TNF、IL-1β和IL-6的水平.结果:KBD患者血清IL-1β和IL-6的水平分别为(238.4±698.5) ng/L和(164.4±661.4) ng/L,健康人分别为(74.5±130.0) ng/L和(52.2±154.6) ng/L,但它们之间差异均不显著(P>0.05).然而,KBD患者血清TNF的水平[(109.2±145.3) ng/L]高于健康对照[(40.9±89.7) ng/L],差异非常显著(P<0.01).患者血清TNF与IL-1β的水平及血清TNF与IL-6水平的相关性均不显著( r值分别为0.0387和0.2135,P>0.05).血清 IL-1β与IL-6的水平呈显著的正相关(r=0.3460,P<0.01).结论:血清前炎症细胞因子水平的升高,可能与大骨节病的发病有关.
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人端粒酶逆转录酶基因核心启动子调控的肿瘤细胞特异性表达载体的构建
目的:构建了人端粒酶逆转录酶(human telomerase reserse transcription,hTERT)基因核心启动子调控的肿瘤细胞特异表达载体.方法:提取人SKOV3细胞的基因组,利用PCR技术克隆hTERT基因核心启动子.并将其插入带有绿色荧光蛋白(GFP)基因的表达载体中.用脂质体转染法,将其分别转染肿瘤细胞和正常细胞,检测肿瘤细胞和正常细胞中GFP差异表达.结果:HTERT基因核心启动子调控的表达载体,在所检测的3种肿瘤细胞中均具有明显的转录活性;而在正常细胞中则无明显的转录活性.结论:hTRET基因核心启动子具有肿瘤特异性,构建hTERT基因核心启动子的载体可能是一种新型和有希望肿瘤治疗的途径.
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VEGF和PCNA在慢性低氧性肺动脉及高压大鼠主动脉、肺动脉平滑肌细胞中表达
目的:研究慢性低氧性肺动脉高压(PAH)发生过程中,血管内皮生长因子(VEGF)及细胞核增殖抗原(PCNA)在体循环血管、肺循环血管平滑肌细胞中的表达.方法:利用低压缺氧舱建立大鼠缺氧性肺动脉高压模型.实验分为3组:即正常氧组、缺氧2 wk组和缺氧3 wk组.用免疫组化染色和图像分析,检测主动脉、肺动脉主干及肺内小动脉平滑肌细胞中VEGF及PCNA的表达量.结果:VEGF在正常氧组大鼠的主动脉、肺动脉主干及肺内小动脉平滑肌内均有表达;缺氧组大鼠肺动脉主干及肺内小动脉平滑肌细胞内VEGF的表达明显增强并随着缺氧时间的延长而增加;主动脉平滑肌内VEGF的表达量无明显变化.PCNA在正常氧组大鼠的主动脉、肺动脉主干及肺内小动脉平滑肌内均有微弱表达;但缺氧时只有肺小动脉平滑肌内其表达量增加;主动脉、肺动脉主干平滑肌内PCNA的表达量无明显差别.结论:在缺氧性肺动脉高压的发生过程中,VEGF在体循环血管、肺循环血管平滑肌细胞中的表达量具有差异性,提示其可能在肺动脉高压形成过程中起重要作用.
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四聚体技术检测原发性胆汁性肝硬化患者血循环中抗原特异性T细胞
目的:定量检测原发性胆汁性肝硬化(PBC)患者体内抗原特异性T淋巴细胞含量,探讨其在PBC发病机制中的作用.方法:采用四聚体技术检测15例HLA-A*0201阳性(A2+)PBC患者外周血单个核细胞(PBMC)经抗原肽诱导生长的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)中PDC-E2 159～167aa与PDC-E2 165～174aa特异性CD8+ T细胞频率,以A*0201阴性(A2-)PBC患者与A2+的其他慢性肝病和健康自愿者为对照组.结果:在A2+ PBC患者PDC-E2 159～167aa与PDC-E2 165～174aa诱导的CTL中可检测到其相应的四聚体/CD8+细胞,平均频率分别为0.42%±0.24%(0.17%～1.08%)、0.27%±0.17% (0.05%～0.56%),各对照组的四聚体阳性细胞频率均低于0.1%,差异非常显著(P＜0.001);A2+ PBC组中PDC-E2 159～167aa特异性的CTL频率与PDC-E2 165～174aa特异性的CTL无显著性差异(P＞0.05).处于临床Ⅰ、Ⅱ期的A2+ PBC患者中CD8+特异性CTL频率均较Ⅲ期的要高(P＜0.05).PDC-E2 159～167aa特异性CTL与PDC-E2 165～174aa特异性CTL频率在抗-PDC阳性PBC组和抗-PDC阴性组之间均无显著性差异(P＞0.05).结论:HLA-A*0201限制性的PDC-E2 159～167aa和PDC-E2 165～174aa特异性CD8+ CTL在PBC疾病进展中起重要作用,抗线粒体抗体阴性或抗-PDC阴性PBC患者与阳性患者可能有着相似的T细胞介导的免疫发病机制.
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抗百日咳毒素单克隆抗体的制备及其特性鉴定
目的:制备抗百日咳毒素(PT)的单克隆抗体(mAb).方法:按常规细胞融合技术制备抗PT的mAb,并对其特异性、相对亲和力及中和活性等进行了鉴定.结果:获得7株分泌抗PT的mAb的杂交瘤细胞.7株mAb 的Ig亚类(型)均为IgG1 (κ),并能特异性识别PT,与百日咳丝状血凝素及C型肠毒素无交叉反应.其中2株mAb 1D4和3E4有中和抑制PT聚集CHO细胞的活性.Western blot的结果表明,2D7、5F9、5F8、1D4和2C2 5株mAb,均能识别PT抗原的S1亚单位蛋白,mAb 1B8可识别S2亚单位蛋白,mAb 3E4可识别S3亚单位蛋白.结论:成功地制备抗PT的mAb,经鉴定具有良好的特异性,为研制定量检测PT的ELISA试剂盒提供了制剂.
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抗人分泌性白细胞蛋白酶抑制剂单克隆抗体的制备与鉴定
目的:制备抗人分泌性白细胞蛋白酶抑制剂(hSLPI)单克隆抗体(mAb).方法:以hSLPI为免疫BALB/c小鼠,运用杂交瘤技术制备抗hSLPI mAb.采用Ig类与亚类鉴定试剂盒鉴定mAb的Ig亚类;通过ELISA、Western blot、免疫组化染色法、流式细胞术、激光共聚焦显微镜技术鉴定mAb的特异性.结果:获得4株可稳定分泌抗hSLPI mAb的杂交瘤细胞,其分泌的mAb均为IgM.Western blot分析表明,此株mAb所识别的靶分子的相对分子质量(Mr)约为12 000.免疫组化染色表明,mAb与肺和结肠组织的上皮细胞、疑似肥大细胞、扁桃体和包皮组织的疑似肥大细胞的反应性均呈阳性.流式细胞术分析显示,4株mAb与人肺腺癌细胞系A549细胞中的SLPI均呈阳性反应.激光共聚焦扫描显微镜观察,荧光标记的阳性反应物主要位于A549细胞的胞质内.结论:成功地制备抗hSLPI mAb,为变态反应性疾病和炎症性疾病的研究工作提供了有用的试剂.
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BAC5-scFv的表达、复性及活性检测
目的:探讨以包涵体形式表达的抗鼻咽癌单克隆抗体(mAb)BAC5的单链抗体(BAC5-scFv)的纯化、复性方法,并对其活性进行检测.方法:扩增pET-22b-scFv质粒转化的大肠杆菌BL21(DE3)菌株,培养、破菌后,分离和变性包涵体,用Ni-NTA His Bind层析柱纯化变性的scFv.经稀释、透析及尿素梯度凝胶层析柱3种方法进行复性.用细胞免疫组化染色和蛋白印迹法(Western blot),鉴定复性后的BAC5-scFv的免疫活性.结果:Ni-NTA His Bind亲和层析柱能有效纯化变性的scFv.以尿素梯度凝胶层析柱复性的蛋白回收率高.免疫细胞化学染色法检测及Western blot分析证实,复性后的BAC5-scFv可与CNE2细胞上的抗原特异性结合.结论:以包涵体形式表达的BAC5-scFv经变性、纯化及复性后,获得良好的免疫活性,为大量制备具有活性的BAC5-scFv,并用于鼻咽癌的放射免疫显像和治疗研究奠定了基础.
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胃癌抗原相关基因MPS-1的融合表达及兔抗GST-MPS-1抗体的制备
目的:在大肠杆菌中表达GST-MPS-1融合蛋白并制备兔抗GST-MPS-1抗体.方法:将MPS-1全长cDNA克隆至pGEX-5X载体内,转化大肠杆菌BL21,用IPTG诱导GST-MPS-1融合蛋白的表达.以分离纯化表达的蛋白免疫新西兰兔,制备抗GST-MPS-1抗体.用Western blot和细胞免疫荧光染色法,检测兔抗GST-MPS-1抗体的特异性.结果:经测序和酶切鉴定确认,MPS-1基因以正确的方式插入到载体中.此重组表达载体经IPTG诱导后,可高效表达相对分子质量(Mr)为36 000的GST-MPS-1融合蛋白.以融合蛋白免疫兔获得的抗血清,经ELISA检测效价达到1×105.Western blot和细胞免疫荧光染色证实,该多克隆抗体能与MPS-1蛋白特异性结合.结论:兔抗MPS-1特异性抗体的获得,为进一步检测MPS-1蛋白的表达和功能分析奠定了基础.
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人源性抗HBsAg单链Fab基因在Pichia pastoris中的表达
目的:研究重组Fab的结构与亲和活性的关系.方法:通过重叠PCR,将人源性抗HBsAg Fab的H和L链基因融合构建单链Fab基因,并将其转入毕赤酵母表达载体pPICZαA中.以单链Fab基因表达载体通过氯化锂转化法转化毕赤酵母GS115.将获得的重组酵母在摇瓶中培养进行重组单链Fab的可溶性表达.表达上清经硫酸铵沉淀及亲和层析纯化后,用直接ELISA检测表达产物和纯化Fab的活性.结果:SDS-PAGE和Western blot分析显示,单链Fab在毕赤酵母中获得分泌型表达.薄层扫描显示,在摇瓶中培养毕赤酵母表达的单链Fab约为5～10 mg/L.经亲和层析纯化获得纯度达97.8%的重组单链Fab.经直接ELISA测定的结果显示,重组单链Fab具有较好的结合HBsAg的活性.结论:通过重叠PCR构建的融合单链Fab基因,可成功地在毕赤酵母中获得分泌型表达,表达产物具有较好的结合HBsAg的活性.
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人IgE Cε3-Cε4蛋白的表达、复性、纯化及初步鉴定
目的:获得IgE Fc段的Cε3-Cε4重组蛋白(E34).方法:以RT-PCR技术扩增IgE Cε3-Cε4(E34) cDNA片段,构建原核表达载体.以其转化大肠杆菌BL-21,诱导表达主要以包涵体形式存在的目的蛋白.经复性、纯化后,用Wes-tern blot和ELISA法初步鉴定所获E34蛋白与抗人IgE mAb的结合能力.结果:对克隆的E34基因片段测序表明,与已报道的序列相一致.获得的可溶性E34蛋白经SDS-PAGE鉴定显示,其相对分子质量(Mr)同预期的结果相一致.Western blot和ELISA法进一步证实,E34蛋白能够被鼠抗IgE mAb特异性识别.结论:成功地构建了pET28a(+)-E34表达载体,并获得能被抗IgE mAb特异性识别的可溶性蛋白E34,为下一步的工作打下了基础.
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抗HER-2嵌合抗体chA21对SKOV3细胞增殖的抑制及诱导其凋亡的作用
目的:探讨抗HER-2嵌合抗体chA21在体外抑制高表达HER-2的人卵巢癌SKOV3细胞增殖并诱导其凋亡的作用.方法:采用MTT比色法、HE染色、透射电镜、流式细胞术及TUNEL染色法等观察和检测chA21对人卵巢癌细胞SKOV3增殖抑制和凋亡的诱导作用.结果:chA21 (0.2 mg/L～5.4 mg/L)可显著抑制SKOV3细胞增殖并诱导其凋亡,其作用呈剂量和时间依赖性.结论:chA21在体外可显著抑制SKOV3 细胞的增殖,诱导凋亡可能是其主要的作用途径.
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二硫键稳定单链抗体融合PE38免疫毒素的构建及活性分析
目的:构建二硫键稳定单链抗体(B3dsscFv)融合PE38原核表达载体,实现其高效表达,并对初步纯化后的复性产物的稳定性、对肿瘤细胞的结合和杀伤活性进行测定.方法:重叠PCR连接B3抗体的VH和VL片段,并将PCR产物克隆至pET22b表达载体(B3dsscFv-pET22b).测序正确的PE38基因片段经酶切连接至B3dsscFv-pET22b,构建B3dsscFv-PE38-pET22b表达载体.IPTG诱导转化菌,将表达的包涵体进行变性、复性后用阳离子柱Q-Sepharose进行了初步纯化,ELISA测定此融合蛋白中单链抗体的结合活性及其在37℃的稳定性,并采用MTT法检测其对B3抗原表面阳性细胞HT-29的杀伤作用.结果:双酶切鉴定表明成功地构建了B3dsscFv-PE38-pET表达载体,表达产物以包涵体形式存在,占总蛋白量的45%左右.复性后的B3dsscFv-PE38保持单链抗体的结合活性,并且对结肠癌HT-29细胞具有一定的杀伤作用,大杀伤率可达96%.该蛋白在37℃孵育16 h后,仍能保持大部分活性.结论:所获B3dsscFv-PE38免疫毒素具备导向和杀伤肿瘤细胞的双重功能和良好的稳定性,为其研制有效的肿瘤免疫治疗靶向药物提供一定的基础.
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NKR-P1家族及其配体的研究进展
NK细胞是固有免疫中非常重要的大颗粒淋巴细胞亚群,其具有细胞毒作用,无需抗原预先致敏,就能杀伤炎症细胞、肿瘤细胞和异基因细胞,这些功能均是由NK细胞受体(NK cell receptor,NKR)所控制,并且NKR与其配体作用还可产生多种细胞因子,调节各种免疫应答.
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生物信息学在免疫学上的应用
生物信息学的快速发展为免疫学的研究提供了新的手段,如果运用得当,能够大大加快研究进程,降低研究费用,缩短研究周期.兹从免疫学的常用数据库、免疫基因组以及MHC和多肽结合预测等3个方面,对生物信息学在免疫学中的应用进行了综述.
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EIAV减毒疫苗诱导的特异性细胞免疫应答
目的:研究马传染性贫血病毒(EIAV)减毒疫苗株接种动物体内诱导的细胞免疫学反应.方法:选用健康没有EIAV感染的马,接种EIAV减毒疫苗株DLV,运用流式细胞术检测疫苗株诱导的马外周血单核细胞(PBMC)中CD4和CD8阳性淋巴细胞数量的变化,以及 3H测定特异性淋巴细胞增殖反应和 51Cr释放实验测定淋巴细胞杀伤反应.结果:EIAV减毒疫苗株DLV免疫动物后,能够引起CD8+细胞明显增加,免疫马PBMC在EIAV刺激下,引起EIAV特异性淋巴细胞增殖反应(SI ≥3),并能检测出EIAV特异性CTL活性,靶细胞杀伤百分率高于30%.结论:EIAV减毒疫苗株DLV免疫动物能够引起特异性EIAV细胞免疫反应,极有可能参与宿主的保护免疫作用.
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同种异体大鼠的主动脉移植后影响移植物钙化的因素分析
目的:探讨同种异体大鼠的主动脉移植后影响移植物钙化的因素.方法:研究分为2组,即异基因组和同基因组.异基因组中SD大鼠为供体,Wistar大鼠为受体;同基因组中受体和供体均为Wistar大鼠.两组再随机分为5个小组,每组8只,进行大鼠同种异体带瓣主动脉腹主动脉的异位移植.分别于术后2、4、8、12、16 wk,以流式细胞术测定大鼠血液中CD25、CD71的表达.取出移植物,用原子火焰吸收法测定钙的含量,用光镜和电镜观察移植物的形态学变化,用免疫组化染色法测动脉壁CD40的表达.结果:(1)异基因组移植后各个时间点,CD40、CD25和CD71的表达均较同基因组高(P<0.01).异基因组 CD25、CD71和CD40表达的高峰主要在移植后的早期(2～4 wk),此后表达的水平逐渐下降,12 wk后维持在低水平.(2)异基因组移植物的钙含量从移植后第4周开始升高,随着时间的推移逐渐升高,在12 wk达到高峰,此后进入平台期.同基因组各个时间点的钙含量无差别(P>0.05).(3)移植后异基因组的移植物出现内皮细胞脱落和平滑肌细胞坏死.结论:同种瓣移植后移植物中的钙含量与免疫排斥反应关系密切;钙含量并不与时间完全呈正相关,在移植后4 wk才开始钙化.随着时间的推移,钙含量逐渐升高,在12 wk达到高峰,此后进入平台期.移植后不同时间点移植物中的钙含量并不与当时的免疫排斥反应的程度成正相关,二者互相影响.
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信号转导与转录激活因子3蛋白的提取及纯化
信号转导与转录激活因子家族(signal transdusers and activator of transcription,STATS)是一族由细胞因子、生长因子等多肽类配体激活的转录因子,初是作为IFN-γ调控下的DNA结合蛋白被克隆的,迄今已发现有7个家族成员[1].
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PHA-M体外诱导脐血单个核细胞分化为内皮细胞的实验研究
目的:探讨植物血球凝集素(PHA)在体外定向诱导人脐血单个核细胞(UBMNC)分化为内皮细胞的可行性.方法:分离人UBMNC加入PHA体外诱导培养1～8 d,在倒置显微镜下动态观察细胞的生长分化,并以流式细胞术(FCM)检测培养的细胞中Von Willebrand 因子(vWF)的表达,在电镜下观察内皮细胞特异性的Weibel-Palade(W-P)小体.结果:在PHA的诱导下,UBMNC可分化为典型的梭形内皮细胞.FCM检测诱导分化效率达60%以上;电镜观察发现,在胞质中含有内皮细胞特异性的W-P小体.结论:UBMNC在PHA的诱导下,可定向分化为内皮细胞,为用脐血治疗缺血性疾病的可能性提供了实验依据.
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同种异体神经干细胞脑内移植免疫排斥反应的实验研究
目的:观察帕金森病(PD)模型大鼠同种异体神经干细胞(NSC)脑内移植是否存在免疫排斥反应.方法:取E14.5 d SD胚鼠腹侧中脑组织进行分离、培养、扩增,经Brdu、Nestin免疫组化染色鉴定确认为NSC后,借助脑立体定位仪移植到SD大鼠PD模型的纹状体内,分别于10、21、35、60 d时检测其旋转行为后分批处死,再行HE、CD4、CD8、酪氨酸羟化酶(TH)和MHC-Ⅱ抗原免疫组化染色.结果:移植组10 d 时,CD4、CD8、MHC-Ⅱ少量表达,以 21 d 时较为明显,35 d时明显减少,60 d消失;10 d、21 d时移植区未见明显TH阳性神经元,35 d后数量显著增加.阳性对照组在10 d、21 d时见少量CD4、CD8、和MHC-Ⅱ阳性细胞,35 d时消失,各时间点都未见TH阳性神经元.阴性对照组在各时间点都未见TH阳性神经元和CD4、CD8、MHC-Ⅱ阳性细胞.PD模型移植组旋转行为35 d时出现改善.结论:神经干细胞脑内移植未见明显免疫排斥反应.
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癌胚抗原的时间分辨免疫荧光分析及其诊断试剂的研制
目的:利用时间分辨免疫荧光分析(TRFIA)技术,建立一种人血清癌胚抗原(CEA)的快速全自动检测方法并研制其诊断试剂.方法:采用双抗体夹心法(用1株抗CEA的mAb M86160M用于包被微孔板,另1株抗CEA的mAb M86110M用于标记铕)建立CEA-TRFIA,增强液采用β-二酮体为主的发光增强系统.结果:CEA-TRFIA的线性测量范围为(1～560) μg /L,分析的灵敏度为0.28 μg /L,批内和批间的变异系数(CV)分别为7.2%～8.6%和8.9%～13.2%.与AFP、CA12-5、CA19-9和白蛋白均无交叉反应,与CA15-3的交叉反应值为1.62 μg/L.将1 000份血清标本用本法与国外罗氏化学发光试剂盒同时检测,其相关系数(r)为0.946.结论:CEA-TRFIA的各项指标均达到临床检测的要求,可替代国外同类检测试剂盒,用于临床血清CEA水平的测定.
关键词： 癌胚抗原 时间分辨免疫荧光分析 -
固有免疫中模式识别受体及其信号转导--当代免疫学中伟大的发现之一
从Mechnikov 1883年发现吞噬细胞的吞噬现象至今,固有免疫(innate immunity)研究已经历120多年.作为机体免疫系统中执行固有免疫的吞噬细胞和补体分别是1908年和1919年生理学及医学诺贝尔奖的两个奖项.
| 年 | 期数 |
| 2018 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2017 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2016 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2015 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2014 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2013 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2012 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2011 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2010 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2009 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2008 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2007 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2006 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2005 | 01 02 03 04 05 06 z1 |
| 2004 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2003 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2002 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2001 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2000 | 01 02 03 04 05 06 |
| 1999 | 01 02 |
| 1995 | 01 02 03 |
| 1994 | 01 02 |
| 1993 | 01 02 03 04 |
| 1992 | 01 02 03 04 |
| 1991 | 01 02 03 04 |
| 1990 | 01 02 |
| 1989 | 01 02 03 04 |
