细胞与分子免疫学杂志
Chinese Journal of Cellular and Molecular Immunology 세포여분자면역학잡지
- 主管单位： 中国免疫学会；第四军医大学
- 主办单位： 陕西省免疫学会,中国免疫学会
- 影响因子： 0.81
- 审稿时间： 1-3个月
- 国际刊号： 1007-8738
- 国内刊号： 61-1304/R
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
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大鼠不同部位的单核/巨噬细胞功能异质性的实验研究
目的:了解生理状态下不同部位单核/巨噬细胞功能的异质性.方法: 健康Wistar大鼠以灌洗法分离肺泡巨噬细胞(AM)和腹腔巨噬细胞(PM), 以密度梯度离心法分离外周血单核细胞(Mo).采用无色孔雀绿比色法、流式细胞仪及放免法, 分别测定不同部位单核/巨噬细胞的非特异性吞噬功能, I-A抗原的表达及IL-6、 IL-10的分泌水平.结果: AM的吞噬功能强, Mo弱.PM可高表达I-A, 而AM及Mo的表达量较低.PM分泌IL-10的水平高, Mo分泌IL-6的水平高.结论: 生理状态下单核/巨噬细胞的功能及表型存在异质性.AM在天然免疫中有重要作用.PM可能在获得性免疫及拮抗炎症反应中有重要作用.
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分泌型TAT蛋白转导结构域基因通用真核表达载体的构建及表达
目的:构建一个全新的分泌型TAT蛋白转导结构域基因哺乳动物细胞融合表达载体并对融合蛋白的表达进行分析.方法: 依照编码TAT-PTD11肽及所引入的BamH I酶识别序列和增强性绿色荧光蛋白N端7个氨基酸的碱基序列合成了3条引物, 以egfp基因为模板通过依次3轮PCR扩增得到tat-egfp融合基因, 该基因片段以Sfi I和Hind Ⅲ双酶切后插入哺乳动物细胞表达载体pSectagA, 构建成重组载体pSecTAT-m-egfp, BamH I单酶切后该载体自连, 即得到可通用的真核表达载体pSecTAT-m, 重组质粒pSecTAT-m-egfp转染HEK293细胞, 融合蛋白的表达用Western blot分析.结果: 酶切及测序证实表达载体pSecTAT-m构建成功, Western blot表明TAT-EGFP融合蛋白在HEK293细胞中获得表达并分泌到细胞培养液中.结论: 成功地构建了分泌型TAT蛋白转导结构域基因的哺乳动物细胞融合表达载体, 为更充分发挥TAT蛋白转导结构域在蛋白质功能及疾病治疗研究中的应用打下了基础.
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真核表达载体pIRES2-EGFP-Axin的构建及其在神经胶质瘤细胞内的表达
目的:构建真核表达载体pIRES2-EGFP-Axin, 并在神经胶质瘤细胞系C6中进行表达.方法: 用PCR的方法扩增Axin基因, 构建真核表达载体pIRES2-EGFP-Axin, 经Nhe I及Sal I双酶切鉴定并测序.通过脂质体法转染C6细胞, 用荧光显微镜检测细胞中增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达, 用免疫组化染色的方法检测细胞中Axin的表达.结果: 构建了真核表达载体pIRES2-EGFP-Axin, 用脂质体法转染神经胶质瘤细胞C6后, 经荧光显微镜和免疫组化染色法检测, 可见细胞内有EGFP及Axin的表达.结论: 成功地构建真核表达载体pIRES2-EGFP-Axin, 并在神经胶质瘤细胞C6中表达, 为研究Axin对肿瘤的生物学作用以及Axin在肿瘤基因治疗中的应用奠定了基础.
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小檗碱对DNFB诱导的小鼠迟发型超敏反应的影响
目的:研究小檗碱(Ber)对二硝基氟苯(DNFB)诱导的小鼠迟发型超敏反应(DTH)的影响, 探讨其免疫抑制作用的机制.方法: BALB/c小鼠分为对照组、 DTH组与Ber处理的DTH组.对照组以不含DNFB的溶剂处理, DTH组以5 g/L DNFB腹部致敏、耳廓激发的方法建立模型, Ber处理的DTH组每天腹腔注射(i.p)Ber, 连续7 d, 总剂量为30 mg/kg 体质量.激发后48 h, 取小鼠双耳称重了解Ber对炎症抑制率的影响.镜下观察耳廓局部组织的变化; 以结晶紫法检查Ber对脾脏T淋巴细胞与细胞外基质(ECM)黏附作用的影响; 以膜联蛋白V(Annexin-V)染色检查淋巴结细胞的凋亡率.结果: 双耳称重的结果显示, Ber处理的DTH组与DTH组具有显著的差异(P<0.05), 能明显抑制DNFB引起的炎症反应; 耳廓局部组织学检测也表明, Ber能够抑制DNFB诱导的DTH, 明显减少淋巴细胞的浸润.Ber处理的DTH组的T细胞与ECM的黏附能力明显降低(P<0.05).Ber处理的DTH组与DTH组和对照组的细胞凋亡率均无明显差异(P>0.05).结论: Ber对DNFB诱导的小鼠DTH具有明显的抑制作用, 降低小鼠T细胞与ECM的黏附能力可能是其抑制DTH的机制之一.
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人CGT52TGT MBL突变体在CHO细胞中的表达及其产物分析
目的:初步探索MBL基因CGT52TGT点突变引起调理吞噬缺损的机制.方法: 采用PCR技术, 从质粒pMBL m52中获取含CGT52TGT点突变的MBL基因, 将其插入真核表达载体pcDNA4/HisMax C中构建重组表达载体.经测序验证后, 电转染入CHO细胞.以800 mg/L Zeocin筛选转染后的CHO细胞30 d; 随后的30 d中, 维持Zeocin的浓度在200 mg/L, 以获取稳定转染的细胞.以RT-PCR分析其mRNA 的表达情况.表达产物经Ni-NTA agarose纯化后, 以非还原SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行初步鉴定.结果: 以PCR扩增的MBLm52基因片段长约750 bp, 将其插入表达载体构建重组真核表达载体pcDNA4/HisMax C-MBLm52, 测序验证序列正确后将其电转染入CHO细胞.从细胞培养上清中获得的纯化的表达产物, 主要为相对分子质量(Mr)约60 000 的分子, 寡聚化程度明显低于重组人野生型MBL和从人血浆中分离的MBL.结论: MBL基因CGT52TGT点突变可能并不影响其表达产物向胞外分泌的过程, 但突变后产生的Cys可能形成新的二硫键, 影响MBL结构单位和/或寡聚分子的形成, 推测该突变MBL蛋白不能发挥正常的功能.
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汉滩病毒G2重组腺病毒的表达及其基因免疫的研究
目的:在Vero E6细胞中表达汉滩病毒(HTNV)囊膜糖蛋白G2重组腺病毒(Adeno-G2), 并探讨其诱导免疫应答特性.方法: 以HTNV Adeno-G2病毒原种(滴度约1×1013pfu/L)感染Vero E6细胞, 用IFA法检测其表达产物.以表达产物免疫BALB/c小鼠后, 用ELISA、微量细胞培养中和试验及淋巴细胞增殖试验检测体液及细胞免疫应答.结果: 用HTNV Adeno-G2感染Vero E6细胞后, 可检测到HTNV糖蛋白G2的表达.用HTNV Adeno-G2免疫小鼠后, 可诱导产生抗HTNV糖蛋白G2的特异性抗体, 抗体效价为1: 40.微量细胞培养中和试验的结果表明, HTNV Adeno-G2还可刺激小鼠产生低水平的中和抗体; 但淋巴细胞的增殖反应不明显.结论: 在Vero E6细胞中成功地表达了HTNV糖蛋白G2.以HTNV Adeno-G2免疫小鼠后, 主要刺激小鼠产生特异性的抗HTNV体液免疫应答, 而特异性的细胞免疫应答不明显.本研究结果为HTNV基因工程疫苗的研制提供了实验依据.
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与接头蛋白Bam32相互作用的蛋白分子的鉴定
目的:研究接头蛋白(adaptor protein)Bam32在B细胞抗原受体(B cell antigen receptor, BCR)信号转导级联反应中的作用.方法: 以Bam32全序列为诱饵, 应用酵母双杂交技术筛选能与Bam32相互作用的蛋白分子, 并用293T细胞共转染和免疫共沉淀法加以证实.结果: 应用酵母双杂交技术筛选出能与Bam32相互作用的蛋白分子, 其中1个出现强阳性反应的克隆编码酪氨酸激酶Lyn.用293T细胞共转染和特异性免疫共沉淀法证实, Bam32可在哺乳动物细胞中与Lyn共沉淀.应用抗磷酸化酪氨酸抗体检测显示, Bam32与Lyn相互作用可导致Bam32磷酸化.结论: Bam32可同Lyn相互作用, 导致Bam32磷酸化, 这在激活下游产物的级联反应中可能起重要作用.
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肿瘤组织中Tim-3表达的特征及其在肿瘤免疫耐受中的作用
目的:研究小鼠肿瘤发生早期两型含T细胞免疫球蛋白及黏蛋白结构域的分子3(Tim-3)的表达特点, 以及与免疫调节相关基因表达的时空关系, 并探讨其在诱导肿瘤免疫耐受中的作用.方法: 建立小鼠实体瘤模型, 采用RT-PCR法检测肿瘤组织中可溶型Tim-3 (sTim-3)和膜型Tim-3 (flTim-3), 以及叉头盒P3 (forkhead box P3, Foxp3)、细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体家族相关受体(GITR)、 TGF-β、 IL-10和IFN-γ等在不同时相的表达及相应时相肿瘤的生长情况.结果: 在早期的肿瘤组织中, sTim-3的表达先于flTim-3, 其后flTim-3大量表达, 而sTim-3的表达则下调直至消失.Foxp3和GITR随flTim-3 同时表达并逐步上调.CTLA-4的表达先于flTim-3, 并随着时间的推移表达上调.flTim-3同Foxp3的表达具有空间位置的一致性.flTim-3、 Foxp3和CTLA-4的表达水平同肿瘤的生长呈正相关.结论: 随着肿瘤不断的生长, 肿瘤局部的免疫应答逐渐趋向于负调节.flTim-3在诱导肿瘤免疫耐受的过程中发挥着重要作用, 而sTim-3可能起着不同的作用.
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鼠疫耶尔森氏菌F1抗原在酿酒酵母中的表达及鉴定
目的:构建含鼠疫杆菌F1抗原结构基因caf1的重组载体, 并在酿酒酵母中表达. 方法: 将鼠疫杆菌的F1抗原结构基因caf1插入到pHSS6-mTn-3xHA/lacZ质粒中, 构建重组载体pHSS6-mTn-3xHA/lacZ-caf1.将重组载体经Not I酶切后, 以醋酸锂法转化酿酒酵母, 将转化的酿酒酵母接种于SC-Ura平板上筛选阳性克隆, 表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定.结果: 经SDS-PAGE鉴定和Western blot分析表明, 转化的酿酒酵母可表达鼠疫杆菌F1表面抗原蛋白.结论: 成功地构建了重组载体pHSS6-mTn-3xHA/lacZ-caf1, 并在酿酒酵母中稳定表达鼠疫杆菌F1表面抗原, 为制备可经消化道途径免疫的鼠疫杆菌基因疫苗奠定了基础.
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cblN/Zap嵌合分子的构建及其对Jurkat细胞TCRζ的下调
目的:构建cblN/Zap嵌合分子, 稳定转染Jurkat细胞后观察对细胞TCRζ的影响.方法: 提取Jurkat细胞的总RNA并反转录为cDNA, 以其作为模板用PCR方法扩增Zap基因的SH2片段.以含有人全长cbl cDNA的质粒pEFHAcbl作为模板扩增cbl基因的N-端(cblN), 并在其N末端带上含24 bp的flag标签.用重叠延伸PCR法, 在cblN基因内部的SH2两端引入BamH I和EcoR V酶切位点并克隆入pcDNA3.1(+)中.再以Zap基因的SH2置换cblN基因的SH2, 即成为pcDNA3.1(+)-cblN/Zap.酶切鉴定及测序正确后, 采用脂质体法稳定转染Jurkat细胞, 用RT-PCR和Western blot鉴定flag-cblN/Zap的表达, 用Western blot检测其对细胞TCRζ表达的影响.结果: 重组质粒pcDNA3.1(+)-flag-cblN/Zap经酶切后可产生与理论预期长度相符的片段.且测序证实其序列正确.脂质体法稳定转染Jurkat细胞后, 检测到目的基因在RNA和蛋白水平的表达.表达的cblN/Zap可下调Jurkat细胞的TCRζ.结论: 重构嵌合分子cblN/Zap可下调Jurkat细胞的TCRζ.
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视黄酸对细胞因子诱导的人肺泡Ⅱ型上皮细胞分泌C3及B因子的影响
目的:探讨视黄酸(RA)对细胞因子诱导的人肺泡Ⅱ型上皮细胞A549分泌C3及B因子的影响.方法: 用ELISA检测TNF-α和IL-1β诱导的A549细胞培养上清中C3及B因子的水平.用RT-PCR分析C3及B因子mRNA的表达.结果: TNF-α和IL-1β诱导A549细胞分泌C3及B因子具有时间和剂量依赖性.IL-6诱导A549细胞分泌C3和B因子的水平是未处理组的4.7、 1.4倍, IFN-γ诱导A549细胞分泌C3和B因子的水平是未处理组的2.1、 1.7倍.RA本身对A549细胞分泌C3及B因子没有影响, 但可显著增强TNF-α和IL-1β诱导的A549细胞分泌C3和B因子及其mRNA的表达, 以及IL-6和IFN-γ诱导的B因子合成.结论: RA可上调TNF-α、 IL-1β、 IL-6和IFN-γ诱导的A549细胞分泌C3及B因子, 调节肺局部组织的免疫防御反应, 为临床上应用RA和细胞因子防治肺部疾病提供了理论依据.
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类风湿关节炎大鼠滑膜细胞的类肿瘤样增生与相关基因表达的关系
目的:探讨佐剂性关节炎(AA)大鼠滑膜细胞的类肿瘤样增生和相关基因表达的机制.方法: 将Wistar大鼠随机分两组, 每组10只, 并应用弗氏完全佐剂诱发大鼠AA实验性模型, 定期观测踝关节肿胀度至第 40天.分别取AA模型组和正常对照组大鼠踝关节进行组织切片, 用HE染色后观察病理学变化.取大鼠膝关节滑膜组织体外进行原代细胞培养, 用MTT比色法检测大鼠滑膜细胞的增生.同时采用RT-PCR法, 检测模型组及正常对照组大鼠滑膜组织中相关基因C-myc和ODC mRNA的转录水平. 结果: ①体外培养的AA模型组大鼠关节滑膜细胞的增殖显著高于正常组大鼠(P<0.01), 并呈类肿瘤样增生.②AA模型组大鼠关节滑膜组织中, C-myc和ODC mRNA的转录水平明显高于正常对照大鼠(P<0.01).结论: AA模型组大鼠关节滑膜细胞的类肿瘤样增生, 可能与其相关基因C-myc和ODC mRNA的转录水平增高有关.
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HPV16 L1基因的原核表达及免疫反应性鉴定
目的:在大肠杆菌中表达人乳头瘤病毒16型(HPV 16)主要衣壳蛋白L1, 并鉴定其免疫反应性.方法: 将HPV-16 L1基因克隆入原核表达载体pThioHisC中, 构建重组表达载体.以重组载体分别转化大肠杆菌Top10和DH5α, 在IPTG诱导下表达外源基因, 用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定和分析.结果: 构建了HPV-16 L1基因的原核表达质粒pThioHisC/HPV-16 L1, 并在大肠杆菌中表达出相对分子质量(Mr)约为70 800的蛋白.表达的蛋白能与抗HPV-16 L1抗体发生特异性反应.结论: 在原核细胞中成功地表达HPV-16 L1基因, 为HPV-16 L1疫苗的研制提供了必要的基础.
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基因芯片技术检测子宫内膜异位症相关细胞因子及其受体基因的表达谱
目的:研究与子宫内膜异位症(EM)发生和发展相关的细胞因子(CK)基因的表达, 进一步阐明子宫内膜异位症的发病机制.方法: 应用含有1 200条基因的基因芯片, 用同位素探针标记, 探讨EM组织与正常子宫组织相关CK基因的表达谱.结果: 在3例EM组织与3例正常的子宫内膜组织中, 共筛选出差异表达基因119条, 其中CK及CKR基因表达上调15条, 包括IL-1、 IL-2、 IL-6、 IL-8、 VEGFR、 TGF、 EGF、 FGF和EPOR等.结论: 表达差异基因有助于揭示EM发生发展的分子机制, 基因表达谱芯片能有效地筛选EM相关的CK及CKR基因, 为了解疾病发生机制提供了高效、准确的研究工具.
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β2-微球蛋白的水平在HIV/AIDS病情评估中的意义
艾滋病(AIDS)是由人免疫缺陷病毒(HIV)感染引起的一种传染病.HIV感染的进展主要表现为病毒感染的CD4+ T细胞迅速破坏和高致病性HIV毒株的出现[1].病毒感染与宿主的免疫应答、免疫激活之间复杂、动态的相互作用, 在本病的发病机制中具有重要意义[2].由于HIV感染的临床过程是多变的, 因此, 艾滋病的临床诊断及预测病情的进展, 可依据病毒载量、 CD4+ T细胞计数及免疫激活标志物(β2-微球蛋白, β2-M)水平的变化综合评估[3].为了更深入地了解β2-M 在HIV感染患者中的临床意义, 设计前瞻性临床对照试验, 对我院56例HIV感染者及20例健康人进行了统计学分析.
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蜂毒肽-IL-2嵌合蛋白的生物学活性检测
蜂毒溶血肽(melittin)是蜂毒的主要组分,具有广泛的生物学效应及药理作用,对神经系统、血液系统、心血管系统及内分泌系统均有作用.蜂毒溶血肽可通过增强TH1细胞的功能,降低TH2细胞的功能,抗过敏、抗炎症及抗肿瘤,但大剂量的蜂毒素毒性较明显.
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男性不育精液中NO的含量与生殖细胞凋亡的关系
目的:探讨人精液中一氧化氮(nitric oxide, NO)与生殖细胞凋亡的关系.方法: 采用镀铜镉还原荧光法检测NO代谢产物硝酸盐(NO- 3).用脱氧核苷酸末端转移酶(TdT)介导的缺口末端标记(TUNEL)法和透射电镜, 分别检测和观察生殖细胞的凋亡及凋亡细胞的超微结构.结果: 生育组精液中NO的含量为(56.83±11.65) μmol/L, 生殖细胞的凋亡率(4.60±1.25)%, 与不育组(128.86±23.76) μmol/L和(17.36±3.05)%相比较有非常显著性差异(P<0.01).不育组NO的含量和生殖细胞的凋亡率呈显著的正相关(r＝0.96).凋亡的生殖细胞核染色质浓缩在核周形成新月形, 电子密度增高, 核膜折叠, 核裂解形成凋亡小体.结论: 不育者精液中NO的含量与生殖细胞的凋亡率有密切关系.高浓度的NO可能是导致睾丸生殖细胞凋亡率增加而致使男性生育力下降的原因.
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哮喘特异性免疫治疗诱导的卵蛋白致敏小鼠模型T细胞无能机制的探讨
目的:建立哮喘特异性免疫治疗小鼠模型, 探讨特异性免疫治疗诱导T细胞无能的机制.方法: 通过卵蛋白(OVA)皮下注射致敏, 雾化吸入激发的方法, 建立哮喘特异性免疫治疗的小鼠模型, 并通过对肺组织病理切片及支气管肺泡灌洗液(BALF)中的细胞计数及分类, 用ELISA法检测血清OVA特异性IgE(sIgE)及脾脏T细胞IL-2和IL-4的分泌等证实.分离培养脾脏T细胞, 用 3H-TdR掺入法检测其增殖反应; 用流式细胞仪(FACS)检测其表面CTLA-4分子的表达.结果: 与对照组小鼠相比较, 哮喘特异性免疫治疗后, 小鼠肺组织的炎症病理变化减轻; BALF中嗜酸性粒细胞(EOS)数、血清sIgE的水平、 T细胞分泌IL-2和IL-4的水平以及小鼠对OVA刺激的反应性均显著降低(P<0.01); 但T细胞表面CTLA-4分子的表达明显上调.结论: 建立了哮喘特异性免疫治疗的小鼠模型.T细胞表面CTLA-4分子表达的上调可能是哮喘特异性免疫治疗诱导T细胞无能的机制之一.
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残胃黏膜幽门螺旋杆菌感染与IL-8 mRNA表达的关系
目的:探讨不同部位残胃黏膜幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori, Hp)感染与IL-8 mRNA表达的关系.方法: 对58例残胃患者进行胃镜检查, 于吻合口和胃体大弯处, 采用两点取材法取材进行胃镜活检.活检标本Hp的感染采用HE和Giemsa染色法检查.活检标本中IL-8 mRNA表达水平采用实时半定量PCR法检测.结果: 58例残胃患者中, 38例感染Hp (65.5%).34例以BI式吻合者中, 残胃体部Hp感染阳性者IL-8 mRNA表达的水平, 明显高于Hp感染阴性者的表达水平, 分别为0.11±0.07和0.02±0.01(P<0.05); 24例BII式吻合者, 无论是残胃体部还是吻合口处, Hp感染阳性者IL-8 mRNA表达的水平, 均明显高于Hp感染阴性者的表达水平(吻合口处IL-8 mRNA表达为: 0.32±0.24和0.02±0.01; 残胃体部为: 0.18±0.08和 0.01±0.01)(P<0.05).结论: 残胃黏膜Hp的感染可诱导IL-8 mRNA表达.残胃体部IL-8 mRNA的表达主要与Hp感染有关; 吻合口处IL-8 mRNA表达, 除与Hp感染有关外, 也受胆汁反流影响.
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酵母多糖所致大鼠多器官功能衰竭中肾小球损伤与NF-κB p65活性的关系
目的:观察在酵母多糖所致大鼠多器官功能衰竭(MOF)中, NF-κB p65的活性与肾小球损伤的关系.方法: 将20只Wistar雌性大鼠随机分为MOF模型组和对照组, 每组各10只, 通过腹腔注射酵母多糖石蜡油悬液建立模型.24 h后, 取血检查肝、肾功能及进行血气分析, 并处死大鼠, 取肾组织进行HE染色、 PAS染色、 PASM染色及Masson染色, 并用免疫组化染色和ELISA法检测肾小球中NF-κB p65的活性.结果: MOF模型组血PO2、 pH值显著低于对照组; 而ALT和sCr的水平明显高于对照组(P<0.01).病理观察显示, MOF模型组大鼠的肾小球呈明显的增生性改变, 部分肾小球硬化, 肾小球及其周围可见大量的炎症细胞浸润; 肾小球内NF-κB p65的活性明显增强, 且与肾小球内的细胞数、基底膜系膜区的面密度呈正相关; 而与毛细血管袢的面密度呈负相关.结论: 酵母多糖所致大鼠MOF中肾小球的损伤可能与NF-κB p65的活性增强有关.
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树突状细胞体外诱导抗肿瘤血管内皮细胞特异性免疫的研究
目的:探讨肿瘤内皮细胞抗原负载的树突状细胞(DC)诱导的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的特异性杀伤效应.方法: 采用肿瘤细胞的培养上清诱导人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)增殖, 制备肿瘤血管衍生的内皮细胞(Td-EC).用RT-PCR检测肿瘤内皮标志物(TEM)的表达.制备Td-EC的冻融抗原, 负载从外周血中扩增的DC, 用MTS比色法检测DC刺激自体淋巴细胞增殖的效应; 用LDH法检测DC诱导的CTL的特异性杀伤效应.结果: Td-EC可表达TEM1和TEM8.负载Td-EC抗原的DC, 可显著刺激自体淋巴细胞增殖.由其诱导的CTL对Td-EC具有特异性的杀伤作用.在效靶比为20: 1和10: 1时, 杀伤率分别为33%和27%, 高于对照组的14%和10%.结论: Td-EC抗原负载的DC, 在体外可有效地诱导CTL产生, 并特异性地杀伤Td-EC.
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缺氧对子痫前期胎盘白细胞介素-1β表达的影响
目的:探讨白细胞介素-1β(IL-1β)在子痫前期患者胎盘中的表达及缺氧对胎盘绒毛产生IL-1β的影响.方法: 采用半定量PCR方法分别检测子痫前期患者及正常孕妇2组各6例胎盘IL-1β mRNA水平; 并在缺氧(20 mL/L)及常氧(210 mL/L)环境下培养8例正常足月胎盘绒毛, 通过ELISA检测胎盘绒毛培养液中IL-1β的含量.结果: 半定量PCR结果显示IL-1β在子痫前期患者胎盘中mRNA水平明显高于正常足月妊娠组(P<0.05); 在缺氧条件下胎盘绒毛培养上清中IL-1β的含量非常显著高于常氧条件下(P<0.01).结论: IL-1β mRNA在子痫前期患者胎盘中高表达, 提示IL-1β可能参与了妊娠期高血压疾病的病理生理过程; 胎盘缺氧可能是妊娠期高血压疾病患者胎盘IL-1β水平增高的一个重要因素.
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非小细胞肺癌患者血清、支气管肺泡灌洗液中IL-6水平的测定及意义
目的:探讨支气管肺泡灌洗液(BALF)及血清中IL-6 水平与非小细胞肺癌(NSCLC)的关系.方法: 应用ELISA检测62例NSCLC患者、 36例肺部炎性病患者及正常对照组BALF和血清中IL-6的水平.结果: (1)NSCLC患者BALF中IL-6的水平显著高于肺部炎性病患者及高于正常对照组(P<0.01).而NSCLC患者血清中IL-6的水平显著高于正常人血清IL-6含量水平(P<0.01), 略高于肺部炎性病患者, 但无统计学意义. (2)NSCLC患者BALF中IL-6的水平稍高于血清IL-6的水平, 但无显著性差异(P>0.05).(3)Ⅲa、Ⅲb及Ⅳ期NSCLC患者血清IL-6的水平显著高于Ⅰa-Ⅱb期; 而BALF中IL-6的水平则无显著增加. (4) NSCLC患者血清IL-6的水平与急性炎症反应呈正相关(r=0.74); 而BALF中IL-6的水平与急性炎症反应无关.结论: BALF中IL-6水平的测定可作为NSCLC早期辅助诊断的指标之一; 血清IL-6的水平可作为判断NSCLC分期的指标.血清IL-6水平的增加可反映急性炎症反应的程度.
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SLE患者外周血DC的表面标志及其分泌IL-12 和IFN-α的研究
目的:分析SLE患者外周血中树突状细胞(DC)的表面标志, 探讨DC和SLE发病之间的关系.方法: 采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC), 在培养瓶中贴壁培养3 h, 吸去悬浮的细胞, 联合应用GM-CSF、 IL- 4和TNF-α刺激正常人及SLE患者外周血DC的增殖及分化成熟.用流式细胞仪分析DC的表面标志, 用ELISA法检测培养9 d的培养上清中IL-12和IFN-α的水平.结果: SLE患者DC表面CD1a、 CD11c、 CD40、 CD83和CD123表达的阳性率, 分别为: (58.88±7.64)%、 (54.4±10.88)%、 (37.29±8.08)%、 (57.76±11.54)%和(13.14±4.44)%; 健康志愿者(对照组)分别为: (47.71±4.01)%、 (43.12±8.82)%、 (28.59±7.07)%、 (48.31±8.79)%和(9.85±3.97)%, 两者相差明显(P<0.05).SLE患者DC上CD80表达的阳性率为(55.16±10.12)%与对照组[(47.95±12.21)%]相差不明显(P>0.05).培养上清中IL-12的水平[(9.78±0.76)ng/L], 较正常对照组[(7.49±0.74)ng/L]明显升高(P<0.05); SLE患者组IFN-α的水平为[(2.95±0.61)ng/L]与对照组[(2.70±0.29)ng/L]相比升高不明显(P>0.05).SLE患者非活动期与活动期培养上清中IL-12和IFN-α的水平无明显差异.结论: SLE患者的DC可能是通过其抗原递呈功能的增强及分泌IL-12而参与本病的发病过程.
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CRF单克隆抗体和多克隆抗体制备及其在睡眠剥夺模型大鼠脑内的变化
目的:制备并鉴定促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)的单克隆抗体(mAb)和多克隆抗体(pAb), 并研究其在睡眠剥夺模型大鼠脑内的变化.方法: 用CRF分别与牛血清白蛋白(BSA)和牛甲状腺球蛋白(BTG)交联, 制成免疫原和检测用的包被抗原.将BSA-CRF分别免疫新西兰大白兔和雌性BALB/c小鼠, 制备其mAb和pAb, 经 ELISA和免疫细胞化学染色等方法进行鉴定, 并用所获抗体观察CRF在正常成年大鼠睡眠剥夺48 h后脑内的变化.结果: 所获得的CRF pAb和9株mAb具有较高的效价、特异性及亲和力.其中, pAb和2株mAb(1D10, 2F4)可用于免疫组织化学染色.睡眠剥夺48 h后下丘脑室旁核、杏仁核中央亚核、终纹状核卵圆亚核等核团高表达CRF样阳性产物, 而对照组相关核团内则极少或未出现.结论: ①成功地获得可用于免疫组化染色的CRF mAb和pAb.②提示CRF在中枢神经系统对睡眠剥夺造成的应激反应的调节过程中具有重要的意义.下丘脑室旁核、杏仁中央核和终纹床核是脑内相关调节环路的一部分.
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天然抗角蛋白单克隆抗体3B4的噬菌体呈现的scFv的构建及表达
目的:构建并表达噬菌体呈现的天然抗角蛋白单克隆抗体(mAb) 3B4的单链抗体(scFv), 并测定其活性.方法: 分别以pMD-18T-mAb 3B4 VH和pMD-18T-mAb 3B4 VL为模板进行PCR, 扩增mAb 3B4的VH和VL基因, 然后将其依次插入噬菌体表达载体pscMH中.经DNA序列测定正确后, 转化大肠杆菌, 用辅助噬菌体VCSM13超感染诱导表达scFv; 用ELISA检测其与亲本mAb 3B4的抗原结合活性的改变.结果: 对扩增的mAb 3B4的VH和VL基因进行测序, 结果表明VH基因与原序列完全一致, VL基因在骨架区FR1有1个碱基发生突变.用VCSM13超感染后能检测到scFv的表达, 其与亲本一样具有多反应性, 但抗原结合模式不完全相同.结论: 成功地构建并表达了天然抗角蛋白mAb3B4噬菌体呈现的单链抗体, 表达的scFv与mAb 3B4的抗原结合活性有一定的差异, 为探讨天然自身抗体的抗原结合模式奠定了基础.
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DnaJ类分子伴侣PBP基因的原核表达及兔抗PBP抗体的制备
目的:在原核系统中表达DnaJ类分子伴侣感光受体外周蛋白结合蛋白(PBP)基因, 并制备兔抗PBP的抗体鉴定其特性.方法: 应用RT-PCR从人胎脑组织总RNA中扩增PBP cDNA.测序后将其克隆到表达载体pET-28a中, 并在大肠杆菌中以IPTG诱导表达.表达产物经Ni-NTA亲和层析柱纯化后, 用SDS-PAGE进行鉴定.以所获纯化的PBP免疫新西兰白兔, 制备兔抗PBP抗体.抗体的效价及特异性用Western blot进行测定和分析.结果: 扩增和克隆出了720 bp的PBP基因.构建的重组质粒pET28a-PBP在大肠杆菌中得到高表达, 诱导表达的蛋白存在于包涵体和细菌裂解上清中, 纯化的PBP经SDS-PAGE鉴定呈单一条带.以纯化的PBP免疫兔, 制备了兔抗PBP抗体.Western blot鉴定证实, 该抗体可与原核表达的PBP特异性结合, 抗体效价为1: 1 600.结论: 在原核细胞中表达了具有生物学活性的PBP, 并以其为免疫原制备了兔抗PBP的抗体, 为进一步研究PBP的结构与生物学活性奠定了基础.
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候选hEra结合蛋白A19/GST的融合表达及其抗体的制备
目的:在大肠杆菌中表达候选人Era结合蛋白A19/GST融合蛋白, 并制备兔抗A19抗体.方法: 利用人Era蛋白全长作为诱饵, 进行胎肝cDNA文库的酵母双杂交筛选.将得到的候选人Era结合蛋白A19的编码基因序列克隆入pACT2载体中, 构建pACT2-A19.用PCR扩增A19蛋白的编码基因序列, 克隆入融合表达载体pGEX-4T3中, 构建A19的表达菌, 并经IPTG诱导表达A19蛋白.用SDS-PAGE分析及薄层扫描检测目的蛋白的含量.用A19蛋白免疫家兔制备抗血清, 以Western blot鉴定抗体的特异性并检测抗体的效价.结果: 大肠杆菌中表达的A19蛋白占菌体总蛋白的30.2%.Western blot分析显示, 抗血清具有较高的特异性, 其效价约为1: 4 000.结论: 成功地获得了候选的人Era结合蛋白A19, 制备了兔抗A19抗血清, 为后续Era功能的研究奠定了基础.
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抗SARS冠状病毒N蛋白单克隆抗体的制备和初步应用
目的:研制抗SARS-CoV N蛋白的单克隆抗体(mAb).方法: 以纯化的GST-N免疫BALB/c小鼠, 采用杂交瘤技术制备抗SARS-CoV N蛋白mAb; 用免疫双扩散鉴定Ig亚类; Western blot和免疫组化鉴定mAb的特异性; 间接ELISA检测mAb的腹水效价、相对亲和常数.结果: 获得1株可分泌特异性mAb的抗SARS-CoV N蛋白的杂交瘤细胞系3E10H, Ig亚类为IgG2b; 其腹水效价为8×10-5; 其相对亲和力1.725×10-10 mol/L, Western blot和免疫组化阳性.结论: 获得特异性抗SARS-CoV N蛋白的mAb, 为进一步用于临床诊断和实验研究创造了条件.
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抗人红细胞膜抗原非凝集型单克隆抗体的研制及特性鉴定
目的:制备抗人红细胞膜抗原的非凝集型单克隆抗体(mAb)并鉴定其特性.方法: 应用杂交瘤技术, 以人O型红细胞膜抗原免疫BALB/c小鼠.取免疫小鼠的脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合, 用聚凝胺试管法筛选识别红细胞表面共同抗原的抗体, 玻片凝集实验剔除凝集型抗体(完全抗体), 再将分泌非凝集型mAb(不完全抗体)的杂交瘤细胞株用有限稀释法克隆化3次.对杂交瘤细胞的稳定性和mAb的特性进行鉴定.结果: 获得1株可稳定分泌mAb的杂交瘤细胞2E8.mAb 2E8为IgG1类, 可特异性地识别红细胞膜上的H抗原, 没有种属交叉血凝反应.杂交瘤细胞的培养上清与人的A、 B、 AB和O型红细胞均能产生强凝集, 凝集效价为1: 1 024, 腹水mAb的凝集效价达到1: 64×106.mAb的亲和力用凝集试验检测, 出现血凝的时间为7 s, 3 min以内凝块>1 mm.结论: 成功地制备了针对红细胞膜H抗原的非凝集性mAb, 此mAb的凝集效价、相对亲和力及特异性均较良好, 为构建双特异性抗体奠定了基础.
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通过随机突变提高抗TNF-α单链抗体的亲和力
目的:提高抗TNFα单链抗体(scFv)的亲和力.方法: 应用错配PCR技术在抗TNF-α scFv基因中引入随机突变, 再通过DNA交换( shuffling)使引入的点突变进一步重排组合, 构建突变噬菌体抗体库.采用硫氰酸盐洗脱法对抗体库进行淘筛.挑选活性得到改良的克隆, 用斑点ELISA法及硫氰酸盐洗脱ELISA法评估其亲和力的改善.结果: 对PCR错配的突变库筛选未得到亲和力明显改善的抗体变种, 经DNA交换进一步构建变种库后, 筛选获得1个亲和力提高的克隆, 其相对亲和指数为1.37 mol/L, 较亲本抗体的相对亲和指数0.48 mol/L有明显提高.结论: 通过错配PCR和DNA交换引入随机突变构建抗体库, 可有效地提高scFv的亲和力.
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用RLM-RACE法克隆抗CD20单克隆抗体可变区基因及其信号肽基因
目的:寻找一种可同时钓取抗CD20 mAb VL、 VH基因及其信号肽基因的方法.方法: 使用Trizol提取杂交瘤细胞1-28的总RNA, 分别采用传统的快速扩增5' cDNA末端 (traditional rapid amplification of 5' cDNA end, T-5' RACE)和RNA连接酶介导的快速扩增5' cDNA末端 (RNA ligase-mediated rapid amplification of 5' cDNA end, RLM-RACE) 的方法钓取目的基因.将其克隆到pGEM-T Easy载体上, 测序后, 与Kabat数据库和GenBank中相应的序列进行比对.结果: 采用RLM-RACE法可同时钓取到抗CD20 mAb VL、 VH基因及其信号肽基因, 而用T-5' RACE法仅能获得VL基因及其信号肽基因.结论: RLM-RACE法是钓取抗体V区基因和信号肽基因的好方法.
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用噬菌体表面展示技术筛选与肝癌细胞系结合的抗体模拟肽
目的:从噬菌体展示肽库中, 筛选可与肝癌细胞特异性结合的抗体模拟肽.方法: 通过生物淘选使噬菌体富集.利用ELISA法, 鉴定噬菌体单克隆原种的亲和性, 并进行统计学分析.通过竞争ELISA, 分析筛选所得抗体模拟肽的结合位点, 并进一步分析抗体模拟肽的序列组成.结果: 随着淘选次数的增加, 出现噬菌体的富集.ELISA的结果显示, 相对于正常肝细胞, 筛选所得环状7肽对肝癌细胞系SMMC-7721和BEL-7402均有良好的结合活性(P<0.05), 且与SMMC-7721细胞的结合活性明显优于与BEL-7402细胞的亲和性(P<0.05).在α=0.01的水平上, 7肽单克隆噬菌体原种可明显与scFv竞争结合SMMC-7721细胞(0.005＜ P<0.01).竞争性ELISA的结果显示, scFv在一定浓度(0～10-5)范围内, 随着scFv浓度的逐渐降低, 竞争抑制率也在逐渐减小.测序结果证实, 所挑选的7肽阳性克隆的测序结果均相同.结论: 通过淘选获得的抗体模拟肽(CLPRQSSFC)是有效的, 为导向治疗提供了新的实验依据.
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抗人SARS病毒单链抗体库的构建
目的:利用细胞内重组的方法, 构建大库容量的人源性抗SARS病毒单链抗体(scFv)库, 为筛选SARS病毒抗原的人源性抗体奠定基础.方法: 取6例SARS康复患者的80 mL 外周血, 分离淋巴细胞后提取总RNA.分离纯化mRNA 并反转录成cDNA后, 扩增抗体重链、轻链可变区基因片段.然后经重叠延伸PCR装配成scFv基因并克隆入噬粒载体pDAN5中, 电转化大肠杆菌TG1构建初级抗体库.制备初级库噬菌体后, 感染大肠杆菌BS1365进行细胞内重组制备次级抗体库.结果: 初级库库容量为3×109, 在大肠杆菌BS1365中重组后得到3×1011的次级抗体库.结论: 细胞内重组方法的应用可使大库容量抗体库的构建变得简单易行.构建的抗SARS病毒单链抗体次库不仅接近人类天然抗体库的水平, 而且多样性好, 为筛选抗SARS病毒抗原的抗体提供了保证.
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人心肌肌钙蛋白I的原核表达及其兔抗体的制备
目的:构建人心肌肌钙蛋白I(hcTnI)基因的原核表达质粒, 在大肠杆菌中表达后, 并制备兔抗hcTnI抗体.方法: 以化学方法合成hcTnI基因并插入融合表达载体pET-21a(+)的多克隆位点, 构建重组表达质粒pET-21a(+)-hcTnI.以重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3) plysS, 筛选阳性重组子, 经IPTG诱导目的蛋白的表达, 表达产物的免疫学活性用Western blot进行鉴定.以表达的hcTnI蛋白免疫家兔, 制备抗hcTnI的抗体并进行纯化及特性鉴定.结果: 成功地合成hcTnI基因, 测序证实序列正确后亚克隆于表达载体pET-21a(+)中, 经PCR筛选和酶切鉴定获得阳性克隆, 序列分析表明其中的插入序列与cTnI基因完全一致.在大肠杆菌中表达出相对分子质量(Mr)为24 000的目的蛋白, 约占菌体总蛋白的28%, Western blot分析显示, 表达的hcTnI蛋白具有良好的免疫反应性.以纯化的hcTnI免疫家兔后, 能有效地刺激特异性抗体的产生, 抗血清的效价为3×10-4, 且具有良好的特异性.结论: 成功地构建hcTnI基因的原核表达载体pET-21a(+)-hcTnI, 并在大肠杆菌中获得高效表达.制备出兔抗hcTnI的抗体, 且效价及特异性均较良好, 为进一步建立酶联免疫吸附法检测hcTnI奠定了基础.
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靶向hTERT RNA干涉促进人宫颈癌HeLa细胞凋亡的研究
目的:利用RNA干涉技术抑制肿瘤细胞端粒酶表达, 探讨其对肿瘤细胞凋亡的诱导作用. 方法: 将成功构建的针对hTERT的siRNA(small interferencing RNA)表达载体转染HeLa细胞, 通过透射电镜、免疫印迹和流式细胞术(FCM)等方法检测人宫颈癌HeLa细胞的凋亡情况.结果: 构建的siRNA表达载体可以诱导HeLa细胞发生凋亡.结论: 针对人端粒酶逆转录酶的siRNA表达载体稳定转染HeLa细胞, 可诱导HeLa细胞发生凋亡.
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单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)作为T细胞活化标志的探讨
目的:比较、分析单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)和CD69分子在人外周血γδT和CD3+ T细胞上的表达规律.方法: 用抗CD3单克隆抗体(mAb)和结核杆菌抗原(Mtb-Ag)等刺激剂分别刺激人外周血单个核细胞(PBMC), 部分实验组同时使用信号转导途径阻断剂处理.用流式细胞术检测不同时相γδT和CD3+ T细胞上GM1和CD69分子的表达率. 结果: Mtb-Ag刺激PBMC后0.5 h, γδT细胞上即表达GM1, 随着时间的推移表达水平持续升高; 而CD69的表达出现在刺激后的3 h, 于24 h达高峰, 然后逐渐下降, 72 h明显降低, 6 d时已接近静止状态.抗CD3 mAb刺激的CD3+ T细胞上, GM1和CD69表达的规律类似于γδT细胞.PD98059和LY294002均能够阻断Mtb-Ag刺激所致的γδT 细胞上GM1的表达, PMA能够促进GM1的表达.结论: GM1可作为一种新的T细胞活化的标志, 其与早期短暂表达的CD69分子有不同的表达规律.GM1的表达可能与Ras-Erk 通路、 PI3K和PKC有关.
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人组织金属蛋白酶抑制因子-3的分离纯化及其生物学性质
目的:从人胎盘中分离、纯化组织金属蛋白酶抑制因子-3(TIMP-3), 并对其对基质金属蛋白酶-1(MMP-1)的抑制作用进行评价.方法: 利用含4 mol/L尿素的Tris-HCl缓冲液(pH 8.0), 从除去多数水溶性蛋白的胎盘匀浆液中提取难溶性蛋白.经CM52阳离子交换树脂和Sephacryl S-200凝胶过滤两步柱层析纯化后, 用SDS-PAGE鉴定TIMP-3的纯度; 用EIA和Western blot检测TIMP-3的含量; 用免疫荧光测定法检测TIMP-3对MMP-1的抑制活性.结果: 人胎盘来源的TIMP-3由相对分子质量(Mr)为24 000的非糖化蛋白和Mr为27 000的糖化蛋白组成.非糖基化的TIMP-3对MMP-1的IC50为1.1×10-10 mol/L, 糖基化的TIMP-3为1.2×10-10 mol/L, 显著高于重组的TIMP-3 (IC50为8×10-8).结论: 人胎盘来源的TIMP-3由Mr为24 000的非糖基化蛋白和Mr为27 000的糖基化蛋白两部分组成, 二者对MMP-1均具有明显的抑制作用.
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肿瘤特异性凋亡基因诱导人淋巴瘤细胞凋亡的机制
目的:研究肿瘤特异性凋亡基因(apoptin gene)在诱导人淋巴瘤细胞U937凋亡时, c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路的作用.方法: 用含有apoptin基因的真核表达载体, 瞬时转染体外培养的人淋巴瘤细胞U937.采用流式细胞仪、 Western blot、台盼蓝染色及RT-PCR等研究其在不同时间条件下诱导U937细胞凋亡的作用.结果: Apopin基因瞬时转染U937细胞48 h, 可出现明显的凋亡; 而且凋亡细胞的数量与apoptin基因的转染时间有关.诱导后24 h, U937细胞中出现磷酸化的JNK蛋白的表达, 诱导后48 h达高峰; 而非磷酸化的JNK蛋白表达无明显变化.结论: Apoptin基因具有诱导U937细胞凋亡的作用.JNK信号通路的激活, 可能在apoptin基因诱导肿瘤细胞凋亡过程中发挥着重要作用.
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人嗜碱性粒细胞在不同刺激物作用下的组胺释放能力
目的:研究蛋白酶激活受体-2(PAR-2)激动剂和肝素等, 对嗜碱性粒细胞组胺释放的影响.方法: 用Ficoll进行密度梯度离心分离外周血单个核细胞(PBMC).经Hank' s平衡盐溶液(HBSS)重新悬浮后进行嗜碱性粒细胞激发实验, 用酶联免疫试剂盒来检测组胺的水平.结果: 浓度为10 mg/L胰蛋白酶可引起嗜碱性粒细胞释放组胺, 其作用强度较抗IgE抗体、钙离子载体(CI)及P物质等为弱.PAR-2特异性激动肽SLIGKV-NH2对嗜碱性粒细胞没有明显的激活作用, 但抗IgE抗体、 CI、 F-Met-Leu-Phe(FMLP)、 C5a及P物质可引起嗜碱性粒细胞显著的组胺释放.肝素、 C5和腺苷在试验浓度内未引起组胺释放, 但肝素可显著增加C5a和P物质诱导的组胺释放.结论: 胰蛋白酶、抗IgE抗体、 CI、 FMLP、 C5a及P物质均可诱导嗜碱性粒细胞显著地释放组胺.PAR-2激动肽SLIGKV-NH2不能引起组胺释放, 肝素可增加P物质和C5a引起的组胺释放, 具有放大嗜碱性粒细胞激活信号的作用.
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金黄色葡萄球菌核酸酶在大肠杆菌中的表达及其活性分析
目的:构建金黄色葡萄球菌核酸酶(SN)基因的原核表达载体, 研究其在大肠杆菌中的表达, 并制备兔抗SN抗体.方法: 从质粒pPLC-SN中扩增SN基因片段, 插入表达载体pLEX后转化大肠杆菌GI724, 以色氨酸诱导表达.以表达的重组蛋白免疫日本大耳白兔制备抗SN抗体, 用Western blot分析兔抗SN抗体的特异性. 结果: 重组表达载体pLEX-SN在大肠杆菌中获得表达, 表达的可溶性蛋白占菌体蛋白总量的37%, 具有良好的生物学活性.制备的兔抗SN抗体能够特异识别SN. 结论: 成功地在大肠杆菌中表达具有生物学活性的SN, 并制备了兔抗SN抗体, 为进一步探讨其作为抗病毒因子应用于病毒性疾病的治疗奠定了基础.
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人肺癌细胞株抗脱落凋亡特性的分析
目的:研究肺癌细胞A549、 Spc-A1、 PLA801及Calu-3抗脱落凋亡的特性, 为研究肺癌细胞抗脱落凋亡的机制提供理论依据.方法: 应用形态学观察, 流式细胞术结合PI及AnnexinV-FITC双标记染色法及Western blot法观察4株肺癌细胞脱落凋亡的特性.结果: 脱落培养12 h后, 4株肺癌细胞有不同形态学变化; 流式细胞仪检测发现Calu-3悬浮培养24 h后, 凋亡率与贴壁培养24 h的凋亡率有明显差别; 而A549等3种肺癌细胞系与贴壁培养的对照组相比较, 其凋亡率无显著性差异, Western blot结果也验证了上述结果.结论: 肺癌细胞Calu-3属于脱落凋亡细胞, 而A549、 Spc-A1、 PLA801属于抗脱落凋亡细胞.
| 年 | 期数 |
| 2018 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2017 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2016 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2015 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2014 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2013 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2012 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2011 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2010 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2009 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2008 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2007 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2006 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2005 | 01 02 03 04 05 06 z1 |
| 2004 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2003 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2002 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2001 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2000 | 01 02 03 04 05 06 |
| 1999 | 01 02 |
| 1995 | 01 02 03 |
| 1994 | 01 02 |
| 1993 | 01 02 03 04 |
| 1992 | 01 02 03 04 |
| 1991 | 01 02 03 04 |
| 1990 | 01 02 |
| 1989 | 01 02 03 04 |
