细胞与分子免疫学杂志
Chinese Journal of Cellular and Molecular Immunology 세포여분자면역학잡지
- 主管单位： 中国免疫学会；第四军医大学
- 主办单位： 陕西省免疫学会,中国免疫学会
- 影响因子： 0.81
- 审稿时间： 1-3个月
- 国际刊号： 1007-8738
- 国内刊号： 61-1304/R
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
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KyoT2 结合蛋白KBP1对RBP-J介导的转录活性的影响
目的: 研究KyoT2与 KyoT2结合蛋白1 (KyoT2-binding protein 1, KBP1)之间的物理相互作用, 以及这种相互作用对重组信号结合蛋白J (recombination signal binding protein-Jκ, RBP-J)介导的转录活性的影响.方法: 体外GST-pull down、体内免疫共沉淀、哺乳动物细胞双杂交实验和报告基因实验证实, KBP1与KyoT2之间存在物理和功能上的相互作用.结果: 体内和体外证实, KBP1与KyoT2之间均存在相互作用.转录活性分析实验显示, 过表达KBP1可拮抗RING1对RBP-J介导的转录的抑制效应.结论: KBP1可通过与RING1竞争结合KyoT2而间接参与对Notch信号途径的调控.
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犬IL-18 cDNA的克隆及其免疫学特性
目的: 获得犬白介素-18(cIL-18)基因并探讨其作为基因疫苗佐剂的免疫效果.方法: 从犬的外周血中分离白细胞, 经ConA刺激培养5～12 h.提取犬白细胞总RNA作为模板, 通过RT-PCR技术扩增cIL-18 cDNA.将其克隆到载体pMD18-T中测序, 并与已发表的序列进行比较.将cIL-18 cDNA克隆入pIRES1neo中, 构建cIL-18真核表达载体.以200 μg∶200 μg的比例, 与狂犬病病毒糖蛋白表达载体pIGneo混合免疫犬, 并与糖蛋白单独免疫犬的免疫应答进行比较.结果: 扩增获得单一长约0.6 kb核酸带, 测序证明长度为582 bp, 编码193个氨基酸, 与从犬肺巨噬细胞中扩增的cIL-18基因的序列完全一致.以构建的表达载体pIIL18与pIGneo混合免疫与用pIGneo单独免疫相比较, 前者抗狂犬病病毒特异性抗体的水平显著低于后者; 但混合免疫组犬外周血淋巴细胞对特异性和非特异性抗原刺激的反应性显著高于糖蛋白单独免疫组.结论: cIL-18全长为582 bp, 其真核表达载体具有增强细胞免疫应答的能力, 同时可显著抑制体液免疫应答.本研究为cIL-18作为基因疫苗佐剂的研究奠定了基础.
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口蹄疫病毒 VP1 蛋白在酵母中的表达及免疫原性分析
目的: 利用毕赤酵母表达系统表达牛O型口蹄疫外壳蛋白 (FMDVVP1 ), 并对表达的蛋白进行免疫原性鉴定.方法: 将FMDV vp1 基因克隆到毕赤酵母Pichia pastoris 分泌性表达载体 pSuperY 中, 构建重组表达载体 pSuperY/vp1, 经测序证明vp1基因序列的正确性.将纯化的重组质粒经线性化酶切后, 用电转化法将pSuperY/vp1导入毕赤酵母菌种SMD1168H中.对表达产物用 SDS-PAGE 和Western blot 进行分析, 并用酵母表达的FMDVVP1蛋白免疫小鼠.结果: 以重组质粒pSuperY/vp1转化毕赤酵母菌后, 能表达相对分子量(Mr)为66 000 和43 000 的FMDV VP1蛋白. 动物免疫结果表明, FMDV VP1蛋白能诱导小鼠产生特异性的体液和细胞免疫应答.结论: 在毕赤酵母中成功地表达FMDV VP1 蛋白, 为研制新型FMDVVP1 的基因工程疫苗奠定了基础.
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逆转录病毒介导IL-18基因在大鼠胶质瘤细胞C6中的表达
目的: 建立表达IL-18基因的大鼠胶质瘤细胞C6/IL-18, 并探讨外源性IL-18基因对C6细胞生长的影响.方法: 应用逆转录病毒载体, 将IL-18基因导入C6细胞.经G418筛选后, 获得表达IL-18分子的细胞克隆C6/IL-18.用RT-PCR法检测目的基因mRNA的表达; 用流式细胞和免疫细胞化学染色法检测目的蛋白的表达.用ELISA法检测C6/IL-18细胞培养上清诱导脾细胞分泌IFN-γ的能力, 以确定IL-18的生物学活性.用MTT比色法检测细胞体外增殖的状况, 用流式细胞技术检测细胞的增殖活性, 并建立大鼠胶质瘤模型, 观察C6/IL-18细胞体内致瘤性的改变. 结果: 外源IL-18基因于mRNA水平和蛋白水平可获得稳定表达, 并可诱生大鼠脾细胞分泌IFN-γ.同时, 该细胞系的体外增殖率及体内致瘤性, 均较亲代C6胶质瘤细胞明显下降.结论: 外源性IL-18基因能部分地抑制C6细胞的体外增殖率和体内致瘤性.建立了可进一步用于相关肿瘤基因免疫和基因治疗研究的大鼠胶质瘤细胞系C6/IL-18.
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两型TNF-α的细胞毒效应与靶细胞内Ca2+浓度变化的关系
目的: 比较分泌型TNF-α(S-TNF-α)和跨膜型TNF-α(TM-TNF-α)发挥细胞毒效应时,引起靶细胞内Ca2+浓度的变化.方法: 采用生物学活性检测法, 观察两型TNF-α对不同靶细胞的杀伤效应; 用Fura-2检测细胞内Ca2+浓度的变化.结果: TM-TNF-α可杀伤实验所用6株靶细胞; 而S-TNF-α则仅对其中两株有细胞毒效应. 两型TNF-α杀伤靶细胞时, 均伴有明显的Ca2+浓度升高.用钙螯合剂EGTA(10 mmol/L)预先处理靶细胞30 min, 只能降低S-TNF-α作用的靶细胞内的Ca2+浓度, 并使其细胞毒效应明显减弱(P《0.01); 对TM-TNF-α无影响.结论: 两型TNF-α发挥细胞毒效应时, 均可引起靶细胞内钙离子的重分布, 导致靶细胞内Ca2+浓度的升高, 但S-TNF-α的作用还可能与促进胞外Ca2+内流有关.
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钙离子载体诱导人外周血单个核细胞向树突状细胞分化的信号转导
目的: 初步探讨钙离子载体(calcium ionophore, CI)诱导人外周血单个核细胞(PBMC)向树突状细胞(DC)分化的细胞信号转导途径.方法: 分离健康献血者的PBMC, 加入rhGM-CSF 及A23187各100 μg/L, 部分细胞预先用W-7(10 μmol/L)或CsA(0.5 mg/L)或KT5926 (1 μmol/L)处理30 min后, 再加入rhGM-CSF及A23187各100 μg/L.体外培养40 h后, 于相差显微镜下观察细胞的形态; 流式细胞仪检测细胞的表面标志; 用MTT比色法检测上述细胞刺激同种异体T细胞的增殖作用.结果: 与 100 μg/L的A23187及rhGM-CSF共同培养40 h的健康献血者的PBMC, 出现典型的树突状突起, 同时CD83、 CD80及CD86分子的表达上调, CD14分子的表达下调, 刺激同种异体T细胞增殖的能力增强; 而预先用W-7或CsA或KT5926处理30 min后、再给予rhGM-CSF 及A23187处理的PBMC, 其形态、表面标志物及对T细胞的刺激增殖能力, 均不同程度的受到抑制.结论: CI诱导的PBMC向DC的分化, 可能受控于Ca2+/钙调蛋白及其下游的多个细胞信号转导途径的调节.
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HBV preS2S-rhGM-CSF融合基因表达质粒的构建和表达
目的: 研究GM-CSF和preS2对乙肝DNA疫苗的免疫增强作用. 方法: 采用PCR方法, 扩增HBV preS2+S基因约846 bp的片段和rhGM-CSF(包括甘氨酸接头)基因450 bp的片段.通过T-A克隆技术和基因定向克隆, 构建融合基因的真核表达质粒pcDNA3.1-S2S-rhGM-CSF, 并在HepG2细胞中表达.结果: 经酶切、 PCR及DNA测序鉴定, 融合基因表达质粒HBVpreS2S-rhGM-CSF成功地构建.将其转染HepG2细胞后, 目的基因的转录通过RT-PCR得到证实, 而且表达的融合蛋白能与抗-HBs、抗-preS2和抗-GM-CSF单克隆抗体(mAb)均产生特异性反应. 结论: 融合基因表达载体pcDNA3.1-S2S-rhGM-CSF的成功构建并表达, 为进一步研究乙肝DNA疫苗奠定了实验基础.
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协同刺激分子4-1BB和CD28对人外周血不同T细胞亚群的激活作用
目的: 探讨4-1BB/4-1BBL协同刺激信号在CD4+和CD8+ T细胞活化、增殖中的作用, 并与CD28/B7信号作比较.方法: 用抗CD3单抗(mAb)刺激人外周血单个核细胞(PBMC).用阻断型抗4-1BBL mAb和抗CD80 mAb, 分别阻断4-1BB/4-1BBL和CD28/B7-1协同刺激信号.利用流式细胞术(FCM)检测CD4+ T细胞、 CD8+ T细胞的增殖率、 CD8/CD4 T细胞的比值变化和细胞分泌IFN-γ的情况.结果: 用抗4-1BBL mAb和抗CD80 mAb阻断相应的协同刺激途径后, CD4+和CD8+ T细胞的增殖和细胞分泌IFN-γ的水平均明显下降.培养8 d, 抗CD3 mAb单独刺激组CD8/CD4 T细胞的比值为1.98±0.06; 抗4-1BBL mAb阻断组CD8/CD4 T细胞的比值下降为0.96±0.03; 而在抗CD80 mAb阻断组, 其比值上升为2.69±0.16.结论: 4-1BB分子可在CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的活化、增殖中提供协同刺激信号.4-1BB分子所介导的协同刺激信号, 在CD8+ T细胞活化及增殖中发挥了更为重要的作用; 而CD28分子所介导的协同刺激信号则更有利于CD4+ T细胞的活化.
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乙型肝炎病毒多表位抗原DNA疫苗的免疫原性
目的: 探讨HBV复合多表位DNA疫苗诱导体液及细胞免疫的可行性.方法: 将HBV多表位抗原基因BPT克隆到真核表达载体pcDNA3.1中, 构建重组真核表达载体pcDNA3.1/BPT.将其通过肌肉注射免疫BALB/c小鼠, 用间接免疫ELISA法、 CTL杀伤功能检测和淋巴细胞增殖试验, 检测特异性体液免疫和细胞免疫的水平, 并观察其对免疫小鼠的毒副作用.结果: 用重组质粒pcDNA3.1/BPT免疫BALB/c小鼠后, 在效靶比为100∶1时, 可诱导显著地特异性CTL应答(P《0.05).ELISA检测免疫小鼠血清特异性IgG的水平明显升高(P《0.05).在BPT基因原核表达蛋白的刺激下, 免疫小鼠脾淋巴细胞增殖显著(P《0.05).RT-PCR分析表明, IL-12 mRNA的水平亦明显升高.结论: HBV多表位基因疫苗可诱发特异性免疫应答, 为预防、治疗性HBV疫苗的研制提供了一定的实验依据.
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猪IL-18 cDNA的克隆及在大肠杆菌中的表达
1995年, Okamura等[1]首先从经热灭活的痤疮丙酸杆菌和LPS处理的小鼠肝脏中, 克隆到了能诱导T细胞产生IFN-γ的多肽因子, 因此, 又称其为干扰素诱导因子(interferon inducing factor, IGIF).之后, 1996年Ushio等[2]以mIGIF为探针, 克隆了人类hIGIF的cDNA, 并在E.coli中表达.鉴于IGIF的氨基酸序列与已知数据库中任何蛋白均不相同, 且生物学活性多样, 故1996年将其重新命名为IL-18.目前, 研究多的主要集中在小鼠和人的IL-18, 对猪IL-18来源的研究还鲜有报道.IL-18主要作用于Th1细胞[3], 可刺激其产生Th1相关的细胞因子, 调节Th1细胞分化、发育, 增强细胞免疫应答.IL-18对Th1细胞的作用是IL-12非依赖性的, 通过与IL-12不同受体及信号传导通路而发挥作用[3], 两者在IFN-γ产生上具有协同作用, 而在IL-2、 GM-CSF产生上则不表现协同效应[4].IL-18除了诱导Th1细胞产生IFN-γ外, 还能诱导GM-CSF、 IL-2及TNF-α等其他Th1型细胞因子的产生[5], 故具有促进Th1细胞发育、增殖和分化以及增强NK细胞活性的作用[6].多项研究提示, IL-18具有抗多种病原微生物感染及抗多种肿瘤的作用[7], 拮抗IL-18的效应可能在抗免疫排斥及在治疗多种自身免疫性疾病中发挥作用. 以上说明, IL-18是一种具有广泛作用的细胞因子, 临床应用前景广阔.
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人端粒酶催化亚单位mRNA的实时荧光RT-PCR定量检测
目的:建立可定量测定人端粒酶催化亚单位(hTERT)mRNA的实时荧光反转录PCR方法.方法:用Trizol 试剂从HepG2细胞中分离总RNA,然后反转录为cDNA.利用一对基因特异引物和一条TaqMan MGB探针,以实时荧光PCR定量hTERT的cDNA.同时定量测定人β-肌动蛋白(hBA)的mRNA作为内对照.用梯度稀释的克隆的人β-肌动蛋白基因制作标准曲线.结果:标准曲线的相关系数为1.00.实时荧光反转录PCR方法的平均变异系数为7.1%.HepG2细胞hTERT mRNA与hBA mRNA的比值为(1.3±0.3)×10-4.结论:建立了可定量测定人端粒酶催化亚单位(hTERT)mRNA的实时荧光反转录PCR方法.本方法的建立将有助于研究端粒酶的生物功能.
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兔抗STAT5抗体的制备及其在乳腺癌诊断中的应用
目的:制备并纯化兔抗小鼠脾信号转导和转录激活因子5(STAT5)的抗体,分析其在乳腺癌细胞以及良恶性乳腺组织中的表达.方法:应用重组小鼠STAT5蛋白,常规免疫雄性新西兰兔制备抗STAT5抗体,并用盐析法和离子交换层析技术进行纯化.用免疫印迹法(Western blot)检测抗STAT5抗体的纯度和特异性,以及乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-231中STAT5蛋白的表达;用免疫组化SP法检测STAT5在正常乳腺组织和乳腺癌组织中的表达.结果:以重组小鼠STAT5蛋白免疫新西兰兔6 wk后,用间接ELISA法检测静脉血中STAT5抗体的效价为1:204 800(A450=1.07).将STAT5经SDS-PAGE分离,可见1条相对分子质量(Mr)为90 000～95 000的蛋白带,与文献[3]的报道相符.用抗STAT5血清做Western blot分析显示,在Mr为90 000～95 000处也有1条明显的带,证明是抗STAT5的特异性抗体.将人乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-231的细胞浆和细胞核蛋白,与所制备的抗STAT5抗体均可起反应.人乳腺组织切片用抗STAT5抗体做免疫组化染色显示,在正常乳腺组织细胞浆中可见棕黄色颗粒,而在乳腺癌组织的细胞浆和细胞核中可见棕黄色颗粒.结论:制备了高效价、特异性的兔抗STAT5抗体.用该抗体检测证实,STAT5只在正常乳腺组织的细胞浆中表达,而在乳腺癌细胞STAT5的细胞浆和细胞核中均有表达,提示发生乳腺癌后,STAT5可由细胞浆易位入细胞核中表达,可作为乳腺癌临床诊断的参考指标.
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AD7C-NTP基因的染色体定位及其产物的跨膜区预测
目的:对AD7C-NTP基因进行染色体定位,预测其编码产物的跨膜区.方法:用Blat服务器进行AD7C-NTP mRNA序列与基因组DNA序列的比对.借助PHDhtm、TMHMM2.0、HMMTOP2.0、SMART和PSORT等服务器,预测AD7C-NTP基因编码产物的跨膜特征及其亚细胞定位.结果:AD7C-NTP基因定位于1p36.11负链,无内含子序列.AD7C-NTP基因编码产物具有3个跨膜区,可能定位于过氧化物酶体.结论:对AD7C-NTP基因及其产物的生物信息学分析为后续的基因克隆及功能研究提供了有益的线索.
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西安地区HLA-B15、B40抗原多态性的分析
目的:研究西安地区HLA-B15及B40的分布特征.方法:采用PCR/SSP及Dynal PCR/SSOP分型方法,对西安地区3 601份血样进行分型.结果:3 601份西安地区血样中,HLA-B15和B40基因的频率高,两者合计占HLA-B基因位点总数的57.91%.B15和B40的基因频率分别为0.1483和0.1414.B15、B40基因各位点基因频率在不同地区人群之间有显著性差异(P《0.01).结论:西安地区人群中,HLA-B15和B40基因的频率分布特征与其他地区人群存在差异.
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乙型肝炎病毒S基因的变异及其意义
乙型肝炎病毒(HBV)是严重危害人类健康的病原体,有关S基因的变异一直是研究的热点之一.ELISA检测的是ng水平的乙肝标志物,是病毒DNA的表达产物及其抗体的应答糸统,间接反映了HBV-DNA的复制情况.我们对儿科用ELISA法检测HBsAg阳性的188例患者,进一步检测乙肝两对半标志物的HBsAg、HBsAb同时阳性的病例,并对出现此现象的可能性做了分析.
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卵白蛋白诱导哮喘小鼠脾细胞增殖中STAT5的变化
目的:研究卵白蛋白(OVA)在哮喘小鼠脾细胞增殖中信号转导蛋白和转录激活因子5(STAT5)的变化,探讨STAT5在OVA诱导哮喘小鼠脾细胞增殖中的作用.方法:经腹腔注射与雾化吸入OVA诱发小鼠哮喘发作.激发后分离小鼠脾细胞,采用MTr比色法测定经OVA诱导的脾细胞增殖;用双染免疫组化法检查脾细胞中STAT5磷酸化与STAT5抗原的定位.用电泳迁移率变动分析(EMSA)测定STAT5与DNA探针的结合力.结果:OVA在体外能明显诱导哮喘小鼠脾细胞增殖(平均A值为0.543±0.112),呈剂量依赖性,与对照组相(平均A值为0.203±0.032)比较差异明显(P《0.01).OVA诱导1、3 h,能诱导哮喘小鼠脾细胞中的STAT5磷酸化,脾细胞中出现STAT5-DNA结合带.结论:OVA能诱导哮喘小鼠脾细胞增殖和脾细胞中的STAT5磷酸化,增加STAT5与DNA探针的结合力,说明STAT5信号途径在OVA诱导的哮喘小鼠脾细胞增殖中起重要作用.
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氧化低密度脂蛋白诱导Zucker大鼠肾小球系膜细胞中NF-κB活性的变化
目的:研究氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)对体外培养的Zucker大鼠肾小球系膜细胞(GMC)核因子κB(NF-κB)活性的影响以及NF-κB的活性变化与大鼠鼠龄及基因型的相关性.方法:(1)将3月龄和10月龄Zucker肥胖大鼠及Zucker瘦型大鼠的GMC(O3m、O10m,、L3m和L10m)进行传代培养.(2)采用电泳迁移率变动分析(EMSA)和超迁移率实验(GSA),检测不同浓度及不同时间相的Ox-LDL对GMC中NF-κB活性的影响及其亚单位p50和p65的变化.利用Western blot检测Ox-LDL刺激后NF-κB的核转位.结果:Ox-LDL刺激后,O3m、O1om及L3m3组GMC中NF-κB的活性均明显强于对照组(P《0.01);L10m组与对照组相比较无显著差异(P》0.05).随着Ox-LDL浓度的增加和刺激时间的延长,GMC中NF-κB活性也相应增强,50 mg/L的Ox-LDL刺激4 h时,NF-κB的活性强度达高峰.Ox-LDL主要激活NF-κB的p65及p50亚单位;各组NF-κB的活性相比较:O3m组高于O1om组,O3m组高于L3m组及O10m组高于L1om组(P均《0.01);L3m组NF-κB的活性高于L10m组(P《0.05).结论:Ox-LDL可诱导Zucker大鼠GMC中NF-κB活化,且呈时间和浓度依赖性;活性强度与大鼠的基因型及鼠龄密切相关.Ox-LDL诱导的NF-κB活化在Zucker肥胖大鼠的早期肾损害中起着更为重要的作用.
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联合应用卡介苗有效成分--罗莫肽和CpG-ODN刺激人PBMC分泌细胞因子
膀胱内灌注卡介苗(BCG)是目前预防膀胱肿瘤术后复发和治疗部分浅表性膀胱肿瘤的佳免疫治疗方法[1].其免疫学机制主要是通过BCG激活膀胱黏膜免疫系统,产生以细胞免疫为主的免疫应答,逆转肿瘤局部Th2细胞占优势的免疫抑制状态,发挥杀瘤作用[2],但毒副作用大,许多患者难以坚持完成整个灌注疗程.近来研究发现[3,4],来源于BCG细胞壁的罗莫肽(Romurtide,RM)是新发现的具有免疫活性的小肽,国外已初步用于因肿瘤放、化疗引起的白细胞减少症和血小板减少症等骨髓抑制现象的治疗,但RM是否能替代BCG用于膀胱肿瘤的治疗尚不清楚.本研究中,我们联合应用RM和细胞核有效成分-人工合成的具有非甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(CpG)基序的寡核苷酸(ODG),刺激人外周血单个核细胞(PBMC),并通过检测其培养上清细胞因子的类型及水平,为临床应用BCG的有效成分治疗膀胱肿瘤提供实验依据.
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自体树突状细胞体外增强肿瘤患者引流淋巴结细胞抗肿瘤活性的作用
目的:探讨自体树突状细胞(DC)体外对胃腺癌患者肿瘤引流区淋巴结(TDLN)细胞抗肿瘤活性的增强作用.方法:分离肿瘤患者的外周血单个核细胞(PBMC)经IL-4、GM-CSF和TNF-αt诱导其成熟,并以自体肿瘤冻融抗原预致敏,诱导其中的DC.另外,分离胃癌患者的TDLN细胞,在含有IL-2的培养体系中培养,并将TDLN细胞分为3组:(1)第1组为肿瘤抗原致敏的DC加TDLN细胞(D组);(2)第2组为冻融的肿瘤抗原加TDLN细胞(Ag组);(3)第3组不加DC及肿瘤抗原作为对照组(L组).比较3组TDLN细胞对胃腺癌细胞系KATO3和黑色素瘤细胞系A375的杀伤作用.结果:D组对KATO3细胞系的杀伤作用明显优于Ag组与L组;而对A375细胞,各组细胞的杀伤作用没有明显差异.结论:自体DC可明显增强胃癌患者TDLN细胞的杀伤作用.
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抗膀胱癌重组免疫毒素的可溶性表达及其抗肿瘤活性
目的:构建抗膀胱癌重组免疫毒素BDI-1-PE38/KDEL的可溶性表达载体,并表达、纯化具有抗肿瘤活性的可溶性蛋白.方法:将抗膀胱癌重组免疫毒素BDI-1-PE38/KDEL的基因片段,插入含有大肠杆菌脯氨酰顺反异构酶FkpA基因的共表达载体pTMFK中,构建重组共表达载体pTMFK-IT.以重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)-Star,共表达目的蛋白与Fk-pA.表达产物以镍离子金属螯合层析柱及抗PE抗体亲和柱层析进行纯化.用ELISA检测免疫毒素的抗原结合活性,用噻唑蓝(MTT)法进行体外细胞杀伤实验.结果:成功地构建了抗膀胱癌免疫毒素基因与FkpA基因的共表达载体,并获得纯度较高的目的表达产物.纯化后的表达产物与BIU-87膀胱癌细胞膜抗原具有良好的特异性结合活性,对BIU-87膀胱癌细胞有明显的体外特异性杀伤作用.结论:获得了对膀胱癌细胞具有显著特异性杀伤活性的免疫毒素,为将其进一步应用于膀胱癌的靶向治疗研究奠定了基础.
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抗HIV p24和人A型红细胞双特异性单克隆抗体的研制
目的:制备抗HIV p24和人A型红细胞双特异性单抗(mAb),并建立检测HIV p24的间接血凝试验.方法:将分泌抗HIVp24 mAb的杂交瘤株2-E4和分泌抗人A型红细胞mAb的杂交瘤株S2,分别用8-Ag和5-BrdU驯化,使成为HAT敏感株.将两者常规融合,筛选分泌双特异性mAb的杂交-杂交瘤株.然后制备并纯化双特异性mAb,用其建立的间接血凝法检测p24.结果:共获得6株杂交-杂交瘤细胞株,以其分泌的双特异性mAb建立了检测HIV p24的间接血凝法,敏感性可达400 ng/L.结论:获得可稳定分泌双特异性mAb的杂交-杂交瘤株,并用纯化的双特异性mAb建立了快速检测HIV p24的间接血凝法.
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抗血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa Fab抗体的原核表达及其生物活性
目的: 研制抗血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa Fab抗体. 方法: 通过间接免疫荧光试验和血小板聚集抑制试验, 选取鼠源抗血小板糖蛋白Iib/IIIa单克隆抗体(mAb P140).从分泌该mAb的杂交瘤细胞株(P140)中, 克隆到抗体轻链基因和重链Fd段基因, 构建原核表达重组质粒p3MH/P140к-Fd, 并在XLI-Blu菌株中进行表达.采用钴亲和层析法对P140 Fab抗体进行纯化, 用SDS-PAGE、 ELISA和Western blot等方法, 对P140 Fab抗体进行检测, 并通过血小板聚集抑制试验, 观察P140 Fab抗体的抗栓活性. 结果: SDS-PAGE和Western blot表明, 纯化的P140 Fab抗体的相对分子质量(Mr)约为47 000.ELISA的结果显示, P140 Fab抗体可与人血小板特异性结合.在体外ADP诱导的血小板聚集试验中, P140 Fab抗体对血小板聚集的抑制作用成剂量依赖性, IC50的平均值为16.85 mg/L.结论: 成功地研制出具有抗栓活性的抗血小板膜糖蛋白Iib/IIIa的Fab抗体.
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抗核糖核酸酶抑制因子抗体的制备与纯化
目的:制备并纯化抗核糖核酸酶抑制因子(RI)的抗体.方法:从人胎盘中提取RI,经亲和层析纯化后免疫家兔制备RI抗体.用rProtein A Sepharose Fast Flow层析对抗RI抗体进行纯化,并用SDS-PAGE、ELISA及Western blot等进行鉴定.结果:制备并纯化了抗RI抗体,经SDS-PAGE分析达到了电泳纯.结论:获得了效价高、特异性强、稳定性好的抗RI抗体,为对其深入研究奠定了基础.
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抗SARS-CoV抗原的人源Fab段噬菌体抗体库的构建
目的:利用抗SARS冠状病毒IgG抗体阳性的SARS康复患者外周血淋巴细胞,构建人源Fab段抗体文库.方法:制备外周血淋巴细胞总RNA,逆转录成cDNA.以其为模板,利用针对家族特异性Ig基因的引物扩增重链Fd段和轻链基因,并重组到噬菌粒载体pComb3中,将重组噬菌粒载体电转化大肠杆菌XL-1 Blue,酶切鉴定抗体库的重组率,并测定噬菌体抗体库的库容量.结果:构建了源于SARS康复患者血清中抗Fab段的抗体文库,轻链、重链Fd段基因的重组率分别为91%和75%,库容量为7.23×107.结论:成功地构建了抗SARS-CoV抗原的人源Fab段噬菌体抗体库.
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亲和层析纯化重组人源性抗HBsAg Fab抗体
目的:纯化酵母发酵产生的重组人源性抗HBsAg Fab抗体,建立稳定、适于生产应用的纯化工艺.方法:以原核表达的重组人源性抗HBs scFv免疫BALB/c小鼠,经杂交瘤技术制备大量分泌mAb的杂交瘤细胞株14F7.将该细胞株注入小鼠腹腔制备mAb腹水,经辛酸沉淀纯化后,制备亲和层析柱,纯化酵母发酵产生的重组人源性抗HBsAg Fab抗体.结果:用抗scFv mAb亲和层析柱纯化的重组人源性抗HBsAgFab的纯度可达95%以上,回收率可达70%～85%.结论:人源性抗HBs scFv制备mAb作为亲和层析的介质,可有效地从酵母发酵上清中纯化重组人源性抗HBsAg Fab,适用于大规模生产重组人源性抗HBsAg Fab.
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黑素瘤患者噬菌体抗体库的构建与筛选
目的:构建噬菌体抗体库并筛选抗黑素瘤细胞的人抗体.方法:从1例长期存活的黑素瘤患者的外周血中分离单个核细胞(PBMC),提取总RNA,并逆转录为cDNA.用PCR扩增多样性κ链基因和重链Fd段基因,分别构建κ链库和重链库,组合为Fab段噬菌体抗体库,用两种黑素瘤细胞系对抗体库进行筛选和鉴定.结果:所构建的噬菌体抗体库的库容量达1.2×108,用两种黑素瘤细胞系进行亲和吸附筛选,获得针对其中1种黑素瘤细胞系的特异性抗体.结论:采用噬菌体抗体库技术,成功地从1例长期存活的黑素瘤患者体内克隆到特异性抗黑素瘤细胞的抗体,为进一步的研究和应用奠定了基础.
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抗人TNF单克隆抗体对TNF诱导的NF-κB核转位的抑制作用
目的:鉴定3株抗人TNF单克隆抗体(mAb)D2、E6和F6对TNF诱导的NF-κB核转位的抑制作用.方法:将不同浓度的3株mAb及无关mAb分别与TNF溶液孵育后,加入到ECV304细胞培养液中.孵育1 h后收获细胞,从中提取核蛋白并测定其含量,用电泳迁移率变动分析(EMSA)检测核提取液中NF-κB的核转位.结果:3株抗TNF mAb均可抑制TNF诱导的ECV304细胞中NF-κB的核转位.其中mAb D2的抑制作用强,其次为mAb F6和E6,无关对照抗体也有一定的非特异性反应.抑制作用与加入的mAb呈良好的剂量依赖关系,在10 mg/L和0.1 mg/L条件下,mAb D2的抑制率分别为94.2%和75.1%,mAb E6分别为64.9%和28.6%,mAb F6分别为70.3%和49.5%,无关对照抗体分别为20.0%和11.1%.结论:mAb D2、E6和F6可特异性地抑制TNF诱导的NF-κB核转位,为制备对感染性疾病和自身免疫性疾病等均具有治疗作用的嵌合抗体奠定了基础.
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抗CD3 scFv基因的真核表达及其生物学活性鉴定
目的: 真核表达抗CD3单链抗体(scFv), 并研究其生物学活性.方法: 将编码抗CD3 scFv的DNA片段插入真核表达载体pDisplay中. 对所构建重组表达载体进行测序确认后, 以电穿孔法将重组质粒导入Hela细胞, 以原位杂交法检测抗CD3 scFv的表达, 以3H TdR 掺入法检测其在体外对T细胞的活化作用, 以MTT比色法观察转染的Hela细胞与T细胞混合培养后, 诱发的细胞毒性T细胞的杀伤作用.结果: 成功地构建了抗CD3 scFv的真核表达载体, 并在Hela细胞中获得表达.所分泌的抗CD3 scFv在抗CD28 mAb存在的条件下, 能够刺激T细胞活化.将转染的Hela细胞与T细胞混合培养能够诱发CTL的杀伤作用.结论: 真核表达的抗CD3 scFv具有刺激T细胞活化的活性, 可用于构建对肿瘤进行免疫治疗的双功能分子.
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抗HEV中和抗体13D8的单链抗体的构建及表达
目的: 降低HEV中和性单抗(mAb)13D8的鼠源性, 表达其单链抗体(scFv).方法: 从分泌13D8鼠mAb的杂交瘤细胞中, 通过RT-PCR克隆mAb的VL、 VH基因, 并进一步组装成VH-linker-VL型的scFv片段.将scFv片段克隆到pTO-T7载体中, 在大肠杆菌中进行表达.用ELISA、 Western blot检测scFv的活性.结果: SDS-PAGE表明, 13D8的scFv在E.coli中得到高效表达, 表达量达菌体总蛋白的26.8%左右, 表达产物主要以包涵体的形式存在.间接ELISA和Western blot检测表明, 表达的13D8的scFv能与HEV OFR2区中一段重组蛋白(NE2)特异结合.竞争ELISA表明, scFv与原鼠mAb识别的为同一表位.结论: 成功地表达出具有免疫学活性的13D8的scFv.
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人肝再生磷酸酯酶2(PRL-2)的原核表达及其鸡卵黄抗体的制备
目的:原核表达人肝再生磷酸酯酶2(PRL-2)与谷胱甘肽S转移酶(GST)和6个串联组氨酸(6×His)的融合蛋白,并制备GST-PRL-2特异性鸡卵黄抗体.方法:将人PRL-2 cDNA的全长蛋白编码序列,克隆入两种原核表达载体pGEX-4T-2和pET21a中,在大肠杆菌BL21中诱导表达融合蛋白.用Glutathione Sepharose 4B和Ni-NTA agarose亲和柱分别纯化目的蛋白.以纯化的GST-PRL-2融合蛋白免疫产蛋母鸡制备多克隆抗体,应用6×His-PRL-2对抗体进行亲和层析纯化,纯化产物用Western blot进行分析.结果:得到高表达量的融合蛋白,经亲和层析柱纯化后获得较高纯度的GST-PRL-2和6×His PRL-2融合蛋白.以GST-PRL-2融合蛋白免疫鸡得到抗PRL-2的多克隆抗体,Western blot证实,经6×His PRL-2亲和层析纯化的抗体,能够识别6×His-PRL-2和GST-PRL-2融合蛋白,但不同GST蛋白起反应,表明具有较高的特异性.结论:利用原核表达的人PRL-2融合蛋白制备的抗PRL-2多克隆抗体具有较好的特异性,为研究PRL-2蛋白在细胞信号转导过程中的作用提供了重要的技术和材料保障.
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抗人CD3单链抗体/p53四聚功能域融合基因的构建及表达
目的: 构建抗人CD3单链抗体(scFv)/p53四聚功能域融合基因, 并进行真核表达及活性测定. 方法: 在已经构建抗人CD3 scFv和人IgG3上游铰链区/p53四聚功能域融合基因基础上, 将抗人CD3 scFv克隆入载体pUC18/IgG3/p53中, 构建抗人CD3 scFv/p53四聚功能域融合基因.经酶切鉴定及序列测定证实后, 将融合基因克隆入真核表达载体pSecTag2-B中, 并转染Hela细胞进行表达.表达产物纯化后, 利用流式细胞仪进行活性测定. 结果: 获得了抗人CD3 scFv/p53四聚功能域融合基因, 基因全长为882 bp, 可编码294个氨基酸, 与已发表的抗人CD3 scFv、人IgG3上游铰链区和人p53四聚功能域基因cDNA序列相一致.表达产物经SDS-PAGE和Western blot证实, 为Mr约35 000的特异蛋白条带.纯化后经流式细胞仪检测, 可特异性地结合人外周血单个核细胞(PBMC), 亲和力高于scFv. 结论: 获得了可与PBMC特异性结合的抗人CD3 scFv四聚体, 为进一步临床应用奠定了基础.
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抗IgE抗体的研究进展
Ⅰ型变态反应性疾病,包括哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎及食物过敏等,在过去的20年中发病率逐年上升,全世界约有1.0～1.5亿人患有哮喘,每年可导致约18万人死亡[1].估计全球为防治哮喘的经济代价已超过用于结核病和艾滋病的总和[2].目前,比较成熟的抗过敏疗法及脱敏疗法,仅以抗炎和缓解症状为目标,且存在较严重的副反应,治疗效果也不满意[2,3].因此,寻找更新、更特异的治疗途径是当务之急.
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DC-SIGN和DC-SIGNR与HIV-1传播的关系
人免疫缺陷病毒-1(human immunodeficiency virus-1,HIV-1)是引起获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiencysyndrome,ARDS)的主要病原.HIV-1感染主要经性接触传播、血源性传播及母婴传播[1].HIV-1感染传播的确切机制尚未阐明.近研究表明,树突状细胞(dendritic cell,DC)在HIV-1感染和传播中具有重要作用,而DC的这种介导作用与其表达的特异性表面分子(dendritic cell-specific ICAM-3 grabbing nonintegrin,DC-SIGN)相关[2,4].此外,一种由内皮细胞产生的DC-SIGN相关同源物(DC-SIGN related,DC-SIGNR)也具有吸附和传递HIV-1的作用[5-7].鉴于DC-SIGN和DC-SIGNR与HIV-1感染密切相关,兹重点综述DC-SIGN和DC-SIGNR在HIV-1性接触传播和母婴垂直传播中的潜在作用.
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人白细胞介素(IL)-28和IL-29基因的克隆与序列分析
人IL-28A、IL-28B和IL-29是由外周血单个核细胞(PMBC)和树突状细胞(DC)等产生的细胞因子,组成一个新的细胞因子家族[1,2].其基因结构与IL-10相近似,但氨基酸水平与干扰素(IFN)更接近,故Kotenko等[2]也将它们相应地称为IFN-λ1(IL-29)、IFN-λ2(IL-28A)和IFN-λ3(IL-28B).其基因均位于人19号染色体(19q13.13).IL-29与IL-28氨基酸的同源性为81%;IL-28A与IL-28B为96%.IL-28A、IL-28B和IL-29与其相应的受体结合而发挥抗病毒感染的作用.国外对IL-28和IL-29的研究刚刚起步,国内目前尚未见相关的研究报道.
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抗硝基酪氨酸单克隆抗体的制备与鉴定
硝基酪氨酸(nitrotyrosine,NT)为活性氮(reactive nitrogen species,RNS)对蛋白酪氨酸残基氧化修饰的产物,是体内RNS形成的重要生物标记物[1.2].目前,NT的检测主要采用HPLC、HPLC-EC及GC-MS等方法,需要大型仪器和专业人员操作,并需进行样品的预处理,费时费力;而且样品的处理过程还会人为地产生NT,影响检测结果的准确性[3,4].免疫学技术为检测NT开辟了一条新的途径,将NT与载体蛋白的连接物作为免疫原,制备针对NT的mAb,然后用于ELISA、Western blot、免疫组化染色和免疫电镜研究.用ELISA法定量测定NT时,样品不需要前处理,可同时测定大量的实验与对照组样品.本实验旨在利用一种新的NT与载体蛋白交联的方法,制备针对NT的特异性mAb,从而完善现有的NT检测方法,以更好地阐明NT的生理病理作用.
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Hsp70和PCNA在NIH小鼠前胃癌变过程中的表达及意义
目的:研究N-亚硝基-肌氨酸乙酯(N-nitrososarcosineethylester,NSEE)诱导NIH小鼠前胃癌变过程中,热休克蛋白70(heat shock protein 70,Hsp70)和增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表达及意义.方法:将144只小鼠分为6组,通过用NSEE灌胃建立小鼠前胃癌模型.每隔2 wk处死24只小鼠,取其前胃用免疫组化ABC法,对小鼠前胃癌变进程中细胞形态的改变,Hsp70和PCNA的表达进行跟踪研究.结果:在NSEE诱癌过程中,Hsp70的表达呈现马鞍型,而Hsp70的表达一直呈增强的趋势.给药后56、70 d,与对照组比较差异显著(P《0.05),84 d差异极显著(P《0.01).PCNA的表达随着诱癌进程呈现递增趋势,给药后42、56 d,与对照组比较差异显著(P《0.05),70、84 d差异极显著(P《0.01).Hsp70与PCNA的表达呈正相关关系(r=0.98,P《0.01).结论:在诱发NIH小鼠前胃癌变过程中,Hsp70、PCNA的表达均呈现升高趋势,且两者呈正相关关系.
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诱导表达人活性型颗粒酶B的Hela细胞系的建立
目的:构建人颗粒酶B基因的可诱导表达载体,并将其在Hela细胞中诱导表达.方法:用PCR法获取人活性型颗粒酶B基因序列,克隆入pIND诱导表达载体中.将其与辅助质粒pVgRXR通过脂质体法共转染Hela细胞后,用G418和zeocin筛选建系.通过免疫细胞化学染色法,确定蜕皮激素A佳的诱导浓度及诱导时间,并通过MTT比色法检测及细胞骨架染色等方法观察,表达的活性型颗粒酶B对Hela细胞形态和生长的影响.结果:获得可诱导表达人活性型颗粒酶B基因的Hela细胞系.免疫细胞化学染色表明,30 μmol/L蜕皮激素诱导5 d时目的蛋白表达强,同时观察到Hela细胞的形态发生变化,出现多核大细胞及固缩小细胞,并且细胞生长受到抑制.骨架分析进一步显示,多核大细胞的骨架发生异常.结论:活性型颗粒酶B的可诱导表达系统的建立,为进一步研究颗粒酶B的生物学效应功能奠定了基础.
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RDP1258对大鼠脾细胞增殖及HO-1活性的抑制作用
目的:观察一种新型HLA衍生肽(RDP1258)的免疫抑制作用,并探讨其机制.方法:用化学方法合成一种HLA衍生肽(RDP1258),以3H-TdR掺入法观察其在体外对大鼠脾细胞增殖的影响;以酶化学法观察其对脾细胞血红素氧合酶-1(hemeoxygenase-1,HO-1)活性的影响.结果:RDP1258可显著抑制大鼠脾细胞增殖并以剂量依赖的方式降低HO-1的活性.结论:RDP1258能够显著抑制丝裂原或同种抗原刺激所致大鼠脾细胞的增殖反应,其抑制作用可能是通过降低HO-1活性而实现的.
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微粒子化学发光免疫测定促甲状腺素敏感性方法的建立与应用
目的:建立一种低成本、高敏感性检测血清促甲状腺激素(TSH)的微粒子化学发光免疫分析(CLEIA)方法.方法:采用碱性磷酸酶标记的抗TSHβ亚单位特异性单克隆抗体(mAb),与FITC偶联的抗TSHα亚单位的另一mAb配对,构成双抗体夹心免疫结合,用抗FITC多抗免疫磁珠做固相分离载体,用金刚烷胺CSPD为发光底物的非均相免疫分析法.结果:方法灵敏度4μIU/L,批内变异系数(CV)平均为7.45%,批间CV平均为10.45%,回收率为91.4%～102.4%.将实际样品测定与ACS-180 系统检测的结果相比较有较好的相关性.结论:微粒子化学发光定量测定TSH的成本低、灵敏度及特异性高和稳定性好,具有广阔的应用前景.
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Paneth细胞分泌的α-防御素的免疫印迹鉴定
帕内特(Paneth)细胞(肠内的嗜酸性细胞)可合成、分泌具有广谱高效抗微生物活性的阳离子抗菌肽,α-防御素(α-defensin)为其中的一类,它是构成机体的天然免疫系统第一道防线的组成成分之一[1].小肠黏膜中的α-防御素分子量小、含量微,对其提纯和鉴定的难度较大.Selsted等[2]将其分离纯化后,对其纯度及分子量的鉴定采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)和质谱法(MS),但对其终定性还需进行氨基酸序列分析,整个过程极其复杂,不适合于大量样品的分析.
| 年 | 期数 |
| 2018 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2017 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2016 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2015 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2014 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2013 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2012 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2011 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2010 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2009 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2008 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2007 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2006 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2005 | 01 02 03 04 05 06 z1 |
| 2004 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2003 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2002 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2001 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2000 | 01 02 03 04 05 06 |
| 1999 | 01 02 |
| 1995 | 01 02 03 |
| 1994 | 01 02 |
| 1993 | 01 02 03 04 |
| 1992 | 01 02 03 04 |
| 1991 | 01 02 03 04 |
| 1990 | 01 02 |
| 1989 | 01 02 03 04 |
