细胞与分子免疫学杂志
Chinese Journal of Cellular and Molecular Immunology 세포여분자면역학잡지
- 主管单位： 中国免疫学会；第四军医大学
- 主办单位： 陕西省免疫学会,中国免疫学会
- 影响因子： 0.81
- 审稿时间： 1-3个月
- 国际刊号： 1007-8738
- 国内刊号： 61-1304/R
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
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可溶型人干细胞因子cDNA的克隆表达、复性与纯化
目的:构建可溶型人干细胞因子(hSCF)基因的表达载体.优化培养条件,实现hSCF基因在大肠杆菌中的高表达.方法:利用PCR技术,以人淋巴结cDNA为模板扩增并克隆hSCF基因.用简并PCR对hSCF基因5′端的序列进行修饰,以实现在大肠杆菌中的高效表达;用MTY比色法测定初步复性和纯化的hSCF蛋白的生物学活性.结果:扩增并克隆了hSCF成熟肽cDNA.将其插入表达载体pBV220构建了hSCF基因的表达质粒,并在大肠菌中初步表达.表达量占总菌体的20%以上,优化培养条件后表达量可达到40%以上,表达产物为包涵体.将包涵体溶解在8 mol/L脲或7 mol/L盐酸胍中,用疏水色谱法进行复性并同时纯化,得到具有天然生物学活性的rhSCF蛋白.结论:成功地克隆hSCF基因,并实现在原核系统中的高表达,所获表达菌株可用于生产以获得具有生物学活性的rhSCF蛋白产品.
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一株变异SARS冠状病毒N蛋白的原核表达及活性测定
目的:克隆编码严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)N蛋白的DNA,构建原核表达质粒pGEX-2T/N,并诱导表达.方法:采用RT-PCR方法从病毒培养液中获得N基因片段,并克隆入T-EASY载体中.经PCR、双酶切鉴定后,测序.将N蛋白基因序列定向插入原核表达载体pGEX-2T中,表达融合蛋白.用表达产物与抗SARS-CoV抗体阳性血清做Westernblot.结果:N蛋白DNA测序的结果与GenBank比对缺失20个bp.GST-N融合蛋白以可溶形式表达.Western blot检测表明,其与抗SARS-CoV抗体阳性血清的反应呈阳性.结论:成功地构建原核表达质粒pGEX-2T/N,并表达GST-N融合蛋白,为下一步的研究奠定了基础.
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pcDNA3.1/hTSHR真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达
目的:构建pcDNA3.1(+)人促甲状腺激素受体(hTSHR)基因真核表达载体,并在COS-7细胞中进行表达.方法:以限制性内切酶EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切pBluescript SK(-)/hT-SHR,获得hTSHR cDNA的全长片段,在以低熔点琼脂糖回收纯化后,定向插入真核表达载体pcDNA3.1(+)的多克隆酶切位点中,构建重组体pcDNA3.1/hTSHR,进行酶切、PCR及测序鉴定.通过脂质体介导,转染COS-7细胞进行瞬时表达,并用RT-PCR和免疫细胞化学染色法检测hTSHR的表达.结果:双酶切pBluescript SK(-)/hTSHR得到约2 700 bp含TSHR全长cDNA的片段,同预期片段的大小相符.所构建的pcDNA3.1/hTSHR经双酶切及PCR鉴定同预期大小相符;测序结果与GenBank中收录的hTSHR全长序列一致,表明真核表达质粒构建正确.以脂质体转染COS-7细胞后,用RT-PCR和免疫细胞化学染色法检测表明,细胞可表达hTSHR.结论:成功地构建真核重组表达质粒pcDNA3.1/hTSHR,为进一步研究TSHR的功能,以及利用hTSHR真核表达载体建立Graves实验动物模型奠定了基础.
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转位肽/粒酶B融合蛋白基因的构建、表达及对细胞生长的抑制作用
目的:研究转位肽/粒酶B融合蛋白对细胞生长的抑制作用.方法:采用重组PCR法,将绿脓杆菌外毒素(PE)部分转位肽编码序列与活性型粒酶B(GrBa)基因相融合,构建PE Ⅱ-GrBa融合蛋白基因,以粒酶活性中心丝氨酸突变的PE Ⅱ-mGrBa作为阴性对照.将所获重组基因克隆入真核表达载体pcDNA3和pIRES2-EGFP中,以脂质体法瞬时转染Hela等细胞系,通过与GFP共表达,用MTT比色、TUNEL及间接免疫荧光染色,检测PE Ⅱ-GrBa基因的表达对转染细胞的形态和生长的影响.结果:表达PE Ⅱ-GrBa融合蛋白的细胞的细胞骨架发生异常,细胞生长受到抑制,部分细胞呈现凋亡特征.结论:PE Ⅱ-GrBa融合蛋白的表达可抑制细胞生长.
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连环蛋白基因功能区截短突变体的构建及其功能
目的:观察连环蛋白(β catenin)基因功能截短体的亚细胞定位及转录活性的变化.方法:采用反转录PCR克隆全长野生型β catenin基因.在此基础上,分别构建β catenin基因N端、C端及Armadillo区缺失突变体的真核基因表达载体和融合绿色荧光蛋白(EGFP)的表达载体.应用双荧光素酶报告系统,在293细胞中检测不同功能截短体的转录活性.在倒置荧光显微镜下观察不同功能截短体在COS7细胞中的亚细胞定位.结果:成功地构建了β catenin基因不同功能截短体的真核表达载体及与绿色荧光蛋白基因融合的表达载体.在293细胞中检测到Armadillo区缺失的突变体蛋白丧失了转录活性,N端及C端缺失突变体蛋白的转录活性较野生型分别下降了80%和90%.在COS7细胞中观察到C端缺失突变体蛋白主要定位于胞浆中,N端缺失突变体蛋白以粗颗粒形式定位于胞核中,Armadillo区缺失突变体的定位情况类似野生型β catenin,以细颗粒形式定位于胞核中.结论:β catenin基因不同功能区亚细胞定位的不同,提示其在转录激活过程中发挥着不同的作用.
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钙离子载体诱导HL-60细胞分化成树突状细胞的实验研究
目的:探讨一种钙离子载体(calcium ionophore,CI)A23187,能否诱导早幼粒白血病细胞株HL-60分化成具有活性的树突状细胞(dendritic cells,DCs).方法:将生长状态良好的HL-60细胞分别加在普通培养液中,或在含不同浓度(25～1 600μg/L)的A23187及100μg/L重组人粒/单集落刺激因子(rhGM-CSF)的普通培养液中培养.24～96 h后,在光镜及电镜下观察细胞的形态;用流式细胞仪检测细胞的表面标志,MTY比色法检测其刺激同种异体T细胞增殖的作用.结果:HL-60细胞以适量(200μg/L)的A23187诱导24 h,DC的特征性表面标志CD83分子的表达高,72 h可出现典型的树突状突起,96 h细胞表面CD80(B7.1)、CD86(B7.2)、MHC-Ⅱ分子及细胞间黏附分子CD54的表达高,且能明显激活同种异体T细胞.结论:钙离子载体A23187可将HL-60细胞诱导成具有活性的DC样细胞.
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核因子-κB p50亚基同源结构域的克隆鉴定及自主报告基因活性的检测
目的:获得NF-κBp50亚基同源结构域(RHD)cDNA及构建酵母双杂交系统的"饵"载体,并检测靶基因的酵母细胞毒性及自主报告基因的活性.方法:提取人外周血单个核细胞(PBMC)的总RNA,以RT-PCR扩增NF-κBp50亚基RHD基因片段,重组入酵母双杂交载体pGBKT7中.应用乙酸锂法,将重组质粒转化酵母细胞AH109,在SD/-Trp选择培养基上培养,观察转化株的生长情况;用滤膜影印法验证靶基因有无自主报告基因的活性.结果:经酶切及PCR鉴定,重组质粒中插入片段的大小与预期的结果相符.测序结果表明,其基因序列正确,无读码框移位,命名为pGBKT7-p50.转化酵母细胞后,对酵母细胞无毒性也无自主报告基因的活性.结论:pGBKT7-p50可作为酵母双杂交系统中的"饵"载体,用于后续的肽库筛选,捕捉与靶基因相互作用的多肽.
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人白细胞介素-21 cDNA克隆及其在大肠杆菌系统的表达
目的:克隆人细胞因子IL-21全长cDNA及其在大肠杆菌中表达,并进一步检测其表达产物的功能.方法:抽取外周血,分离淋巴细胞;抗CD3抗体刺激后,提取总RNA,通过RT-PCR获得两个部分重叠的IL-21 cDNA片段(分别为5′端242 bp,3′端425 bp),重组PCR扩增出IL-21全长cDNA.DNA测序正确后,将成熟IL-21 cDNA的编码框序列构建到原核表达载体pET28a(+)中.卡那霉素平板筛选及PCR鉴定,挑出阳性克隆进行扩增、转化大肠杆菌进行IPTG诱导表达.SDS-PAGE、Western blotting鉴定,亲和层析分离纯化得到Mr为18 600的带有组氨酸标签重组人IL-21融合蛋白.透析法重折叠复性,MTY法测定其对T细胞增殖活性.结果:成功获得人IL-21全长cDNA,并以包涵体形式表达于大肠杆菌中.重折叠后的rhIL-21融合蛋白具有与抗CD3抗体共刺激T细胞增殖作用.结论:获得具有生物学活性的rhIL-21细胞因子,为进一步研究其功能奠定基础.
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重组杆状病毒表达的EIAV Env蛋白与含有env基因重组痘苗病毒的联合免疫
目的:构建新型的马传染性贫血病毒(EIAV)的候选疫苗.方法:利用BAC-To-BAC杆状病毒表达系统,将中国马传贫驴白细胞弱毒疫苗(EIAV DLV)及其亲本株(EIAV LN)env基因导入到杆状病毒基因组中.转染昆虫细胞后,得到的重组病毒用SDS-PAGE和Western blot检测表达产物.以本实验室构建的含有EIAV env基因的重组痘苗病毒,单独或与重组杆状病毒表达的EIAV Env蛋白联合免疫小鼠.结果:构建的重组杆状病毒能正确表达全长Env蛋白.与单独免疫组相比,联合免疫组免疫应答显著增强,其中中和抗体的滴度提高5～9倍.结论:含有EIAV env基因的重组痘苗病毒与Env蛋白抗原联合免疫,能够诱导高滴度的中和抗体.
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从噬菌体构象型7肽库中筛选BLyS的抑制性短肽
目的:从噬菌体构象型7肽库中筛选BLS的抑制性短肽.方法:用重组人BLyS筛选噬菌体构象型7肽库,用间接ELISA、竞争ELISA和细胞增殖活性试验鉴定噬菌体克隆.结果:经过3轮亲和筛选,噬菌体的回收率增加,阳性克隆得到富集.所获两个阳性噬菌体克隆能特异性地抑制BLyS刺激细胞增殖的活性.结论:获得了噬菌体呈现的能够抑制BLyS的两个短肽.
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云南个旧肺鳞癌YTMLC-90细胞株cDNA文库构建和鉴定
目的:构建云南个旧肺鳞癌YTMLC-90细胞株的cDNA文库.方法:从培养的人肺鳞癌YTMLC-90细胞株中提取总RNA,利用经修饰的oligo(dT)引物(含SfiⅠ B酶切位点)合成cDNA第1链.同时,根据真核生物mRNA 5′端帽子结构的特点,利用SMART核苷酸(含SfiⅠ A酶切位点)作为cDNA第1链在mRNA 5′端延伸出去的模板.以此序列为引物,利用LD-PCR(long-distance PCR)合成双链cDNA.双链cDNA经SfiⅠ(Ⅰ A和Ⅰ B)酶切和过柱分级分离后,克隆入经SfiⅠ酶切的载体λTripIE×2,经体外包装即为cDNA文库.结果:人肺癌细胞株YTMLC-90的cDNA文库中,含有1.01×109pfu/L个重组子,重组率为93.2%.将该文库扩增后,克隆数可达5.24×1012pfu/L,插入cDNA的长度为750～3 000 bp.结论:所构建的cDNA文库具有较好的质量,为进一步筛选、克隆肺癌特异性表达基因奠定了基础.
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胆囊癌组织P62蛋白的表达及其与血管生成关系
目的:检测胆囊癌组织中P62蛋白、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的表达和微血管密度(MVD),探讨它们的相互关系,以及与胆囊癌临床病理特征的关系.方法:41例胆囊癌和22例慢性胆囊炎组织中,P62蛋白和bFGF的表达用SP免疫组化染色法进行检测.胆囊癌组织中MVD用抗CD34单抗(mAb)做SP免疫组化染色进行检测.结果:41例胆囊癌组织中,P62和bFGF表达阳性率分别为63.4%和75.6%,均高于22例慢性胆囊炎组织(P＜0.01).P62的表达与胆囊癌淋巴结转移有关(P＜0.05),与癌组织的分级、临床分期无显著关系.bFGF的表达与胆囊癌临床病理分期及组织学分级有关(P＜0.05),而与淋巴结转移无显著关系.P62表达率与bFGF表达率呈正相关关系(r=0.521;P＜0.01).两者的表达均与患者的年龄、性别、肿瘤的种类、是否伴有胆囊结石无关.胆囊癌组织中MVD明显高于慢性胆囊炎组织(P＜0.01).P62及bFGF表达阳性组织MVD高于表达阴性组织(分别P＜0.05和P＜0.01).MVD与胆囊癌的Nevin分期及淋巴结转移有关(P＜0.01),与患者的年龄、性别、肿瘤种类、分化程度以及是否伴有胆囊结石无关.结论:P62蛋白及bFGF的表达与胆囊癌组织中血管的生成相关,在胆囊癌的发生和发展过程中可能具有重要作用,对胆囊癌的诊治可能具有参考意义.
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转基因小鼠高表达的FasL对Sertoli细胞免疫调节功能的影响
目的:研究转基因小鼠高表达的FasL对Sertoli细胞在睾丸局部感染时的免疫调节作用的影响.方法:将溶脲脲原体(UU)分别注入FasL转基因及野生型小鼠膀胱,模拟上行性感染的途径.分别在感染后1、2和3 wk处死小鼠,分离睾丸组织观察其病理变化,并用免疫组化染色法比较UU感染前后,Sertoli细胞上FasL和TGF-β、IL-1α、IL-6的表达及分泌格局的差异.从野生型小鼠睾丸组织中分离高纯度的Sertoli细胞,与未感染UU的对照组相比,观察UU感染后FasL+Sertoli细胞介导Fas+Jurkat细胞的凋亡能力的变化.结果:UU感染组的转基因小鼠,睾丸组织发生的病理改变比野生型更为明显;两种小鼠感染后Sertoli细胞分泌的调节因子变化格局不同;感染后Sertoli细胞对Jurkat细胞的杀伤能力增强.结论:在抗感染免疫中,转基因表达的FasL可影响Sertoli细胞分泌细胞因子的格局,进而影响睾丸局部的免疫平衡.过高表达的FasL对机体的抗感染应答并非一定有利.
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高浓度的糖刺激人肾小球内皮细胞表达单核细胞趋化蛋白-1的影响
目的:探讨高浓度的糖对培养的人肾小球内皮细胞(HUGEC)表达单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的影响,以及HUGEC的条件培养基对单核细胞(MC)的趋化作用及抗MCP-1抗体对MC迁移的影响.方法:采用原位杂交技术和细胞ELISA法,观察MCP-1的表达;用改良的Boyden小室微孔滤膜法,测定高浓度的糖刺激HUGEC后的条件培养基,对MC的趋化作用,以及抗MCP-1抗体对MC迁移的影响.结果:(1)在低浓度的糖(含5.5 mmol/L D-葡萄糖)条件下培养的HUGECMCP-1 mRNA呈弱表达.高浓度的糖(含25 mmol/L D-葡萄糖)刺激后,8 h即出现MCP-1表达增强,于16 h达高峰.(2)高浓度的糖刺激HUGEC后的条件培养基,对MC具有明显的趋化作用;抗MCP-1抗体可抑制其作用.结论:在高浓度的糖诱导下,人HUGEC MCP-1的表达增强,其条件培养基对MC具有趋化作用,从而可能招引单核细胞迁入内皮下间隙.
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三种检测SARS抗体试剂盒的临床使用效果比较
目的:对重组双抗原夹心法ELISA、全病毒间接法ELISA和免疫荧光分析法3种SARS抗体诊断试剂盒进行临床应用效果评价,比较不同试剂的使用效果.方法:使用3种试剂检测了257例临床确诊SARS患者的血清标本279例和其他非SARS患者标本24例、健康体检者血清标本80份.结果:临床确诊SARS患者发病1～20 d的病例中双抗原夹心法ELISA检出率高,间接免疫荧光法与其接近,全病毒间接法ELISA检出率低.在发病20 d后,三者检出率接近(94%左右),3种方法的符合率在97%以上.在104例非SARS病例中,双抗原夹心法ELISA和免疫荧光法均未见出阳性结果,全病毒间接法ELISA检出阳性结果3例,假阳性率2.9%.结论:检测SARS抗体双抗原夹心法ELISA试剂盒、免疫荧光试剂盒具有类似的灵敏度和特异性,其灵敏度和特异性高于全病毒间接法ELISA.
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早期狼疮肾炎患者血中sCD40L水平的变化及其意义
系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是常见的一种风湿性疾病,狼疮肾炎(lupus nephritis,LN)为其常见的脏器损伤,也是导致SLE患者死亡的重要原因之一.因此,探讨其发病机制已成为风湿性疾病研究的重要课题.近年来,人们对共同刺激信号CD40-CD40L在SLE发病中的作用十分重视[1].本研究旨在探讨早期LN患者血中可溶性CD40配体(sCD40L)水平的变化及其在该病发病中的作用.
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妊娠高血压综合征患者血清对内皮细胞表达CD226的影响
目的:探讨妊娠高血压综合征患者血清对体外培养的内皮细胞表达CD226的影响.方法:PIHS患者血清与血管内皮细胞进行共培养,用间接免疫荧光法进行标记,用流式细胞仪检测受刺激后血管内皮细胞上CD226的表达.结果:PIHS组患者和正常孕妇血清刺激的血管内皮细胞表达CD226的百分率分别为15.51%和7.15%,PIHS患者组显著高于对照组(P＜0.001).结论:PIHS患者血清具有刺激血管内皮细胞表达CD226的作用,提示PIHS患者血清中可能存在某些细胞因子能诱导内皮细胞合成CD226,由此进一步提示CD226可能参与PIHS发生的病理生理作用.
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恒磁场对 AngⅡ作用下人脐静脉内皮细胞分泌ICAM-1及与单核细胞黏附的影响
近年来,黏附分子与炎性反应在经皮冠状动脉介入治疗术后再狭窄发生中的作用受到重视[1],已证实细胞间黏附分子-1(ICAM-1)水平的增加与冠状动脉介入治疗术后的再狭窄显著相关[2,3].血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)有强烈的致炎症作用,可刺激内皮细胞ICAM-1等黏附分子的表达[4],增加内皮细胞对单核细胞的黏附作用及炎症浸润[5],因此也是冠脉介人治疗术后再狭窄发生的重要因素.
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促红细胞生成素对慢性肾性贫血患者红细胞CR1分子表达的影响
重组人促红细胞生成素(rhEP0)可促进红细胞生成,已被广泛用于肾性贫血的治疗[1].红细胞上的1型补体受体(CR1)其主要的免疫功能是清除循环中免疫复合物(CIC),并可将携带抗原给T细胞增强其免疫应答,参与免疫调节作用[2].为此,我们采用ELISA法,测定了rgEP0治疗前后28例肾性贫血患者外周血红细胞上CR1分子的表达,以了解rhEP0对红细胞免疫黏附(RCIA)功能的影响.
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IL-18和HIV-1 gag-gp120嵌合基因DNA疫苗联合免疫小鼠的免疫应答
目的:探讨IL-18和HIV-1 gag-gp120嵌合基因的DNA疫苗联合免疫小鼠的免疫应答.方法:构建含IL-18的真核表达质粒pVAXIL18,将他与表达HIV-1 gag-gp120嵌合基因的核酸疫苗质粒pVAXGE共同肌注免疫BALB/c小鼠,检测免疫小鼠脾特异性CTL杀伤活性和血清抗体滴度.结果:联合免疫组小鼠脾特异性CTL杀伤活性和血清抗体水平均显著高于单独免疫组(P＜0.05),空白质粒对照组(P＜0.01)和PBS对照组(P＜0.01).结论:IL-18和HIV-1 gag-gp120嵌合基因的DNA疫苗联合免疫可诱导小鼠产生特异性细胞和体液免疫,且IL-18发挥了免疫佐剂的作用.
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抗胰蛋白酶原激活肽单克隆抗体的制备及应用
目的:制备抗胰蛋白酶原激活肽(TAP)单克隆抗体(TAPmAb),并建立敏感、特异的TAP免疫检测方法.方法:将人工合成的TAP与血蓝蛋白(KLH)交联制成免疫原,免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与Sp2/0细胞融合,间接ELISA筛选阳性克隆,经多次克隆化,获得稳定分泌TAP mAb的杂交瘤细胞株,并进行鉴定,进而建立检测TAP的ELSIA竞争法.结果:获得10株能稳定分泌TAP mAb的杂交瘤细胞株,除1株为IgG1外,余9株均为IgM类;效价达1:105～1:106;与BSA、人白蛋白、胰蛋白酶原、淀粉酶均无交叉反应,中和抑制试验表明培养上清、腹水中的抗体能明显被TAP中和.建立了检测TAP的ELISA竞争法,灵敏度为0.69μg/L,批内变异系数为9.10%,批间变异系数为10.33%.用该法测定急性胰腺炎组患者及对照组患者TAP含量分别为57.35ug/L及9.30μg/L(P＜0.01).结论:成功制备抗TAP mAb,并建立了敏感的ELISA竞争法.
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应用噬菌体展示技术筛选、鉴定抗汉滩病毒单克隆抗体的模拟表位
目的:应用噬菌体12肽文库筛选抗汉滩病毒单抗(mAb)F3、B11的模拟配体肽,并对其免疫学特性进行初步分析.方法:以纯化的mAb为筛选配基,进行噬菌体肽库的生物亲和淘选.用ELISA法鉴定筛选克隆的结合活性,对阳性克隆进行序列测定和分析.用动物免疫试验初步分析噬菌体颗粒展示的抗原肽的免疫特性.结果:通过3～4轮生物淘选,ELISA显示筛选到的多数噬菌体克隆均可与mAb特异性结合;与mAbF3结合的阳性克隆的氨基酸序列高度一致,均为-MHG-PTKNQMWHT,与HTNV/SEOV M蛋白G2区第750～759位氨基酸具有较高的同源性;而mAb B11特异性的结合肽在氨基酸水平上表现出一定的多态性,其序列的基序尚未能确定;动物免疫试验表明,噬菌体肽抗原具有良好的免疫反应性和免疫原性,是天然病毒抗原较好的免疫原模拟物.结论:获得了具有良好结合活性的模拟表位肽,为基于表位的HFRSV多肽疫苗及DNA疫苗的研制奠定了基础.
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抗HBV中和抗体MA18/7轻链可变区VL与GFP融合蛋白的表达及生物活性测定
目的:在大肠杆菌中表达抗HBV中和抗体MA18/7轻链可变区基因(VL)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的融合蛋白,并测定其生物学活性.方法:应用基因工程技术,将EGFP基因克隆到载体pTO-T7中构建原核表达载体.然后将MA18/7的VL基因按照读码框插入到无终止密码子TAA的EGFP基因的5′末端,构建融合蛋白表达载体.通过ELISA和相对荧光强度测定在大肠杆菌中表达的融合蛋白的活性.结果:构建了EGFP-MA18/7-VL表达载体.SDS-PAGE表明,融合蛋白主要以包涵体的形式存在.荧光测定显示,融合蛋白保持了GFP的荧光性质.ELISA的结果表明,融合蛋白与重链可变区(VH)片段结合成的Fv,能特异性地识别HBV pre-SI抗原.结论:成功地获得具有良好生物学活性的融合蛋白,可用于进一步的研究.
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兔抗人PDGF-A抗体的制备与鉴定
血小板衍生的生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)是由A、B链通过二硫键连接而形成的二聚体.有研究表明,PDGF-A参与创伤愈合过程中的炎症反应、肉芽组织和瘢痕形成[1].另外,PDGF-A对雄性小鼠生殖系统的发育也起着决定性的作用,提示其对于生殖系统某些疾病的诊断和治疗可能具有重要意义[2].为此,我们制备了兔抗人PDGF-A的抗体,为进一步研究PDGF-A的功能提供有用的试剂.
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用导向选择链更替技术建立抗肝癌抗原HAb18G的人源性Fab基因库
目的:在嵌合HAb18-Fab抗体的基础上,利用载体pComb3X,采用导向选择链更替技术建立全人源性Fab基因库.方法:用RT-PCR自肝癌患者外周血单个核细胞(PBMC)中,扩增全套人抗体Fd基因片段和L链基因.首先,将Fd基因克隆入已含嵌合L链基因的展示载体pComb3X/CL中,建立人-鼠杂合的Fab基因库,以原核表达的非融合HAb18G的胞外区片段为抗原,筛选杂合的Fab基因,以得到人Fd基因.然后应用筛选出的Fd基因与人L链基因库配对,建立全为人Fab的基因库,并筛选全人Fab基因.将IPTG诱导的表达菌裂解,取其上清对pⅢ-Fab融合蛋白的功能进行分析,并对其编码基因进行测序.结果:建立了库容为2×107的杂合Fab基因库,经6轮筛选后得到7株杂合Fab基因.利用筛选的人Fd基因建立了库容为0.8×107的全人Fab基因库,经4轮筛选得到2株亲和力较高、特异性强的人Fab基因.测序结果显示,2株Fab基因具有相同的Fd基因序列,与亲本抗体同属IgG2亚类;L链基因为κ型,可变区均属于Vκ3家族.结论:利用导向选择链更替技术,筛选出特异性较强、完全人源化的抗肝癌抗原HAb18G的Fab抗体,为进一步的工作打下了基础.
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抗角蛋白Fab抗体在大肠杆菌中的表达与复性研究
目的:用大肠杆菌分别表达抗角蛋白抗体的轻链和Fd片段,体外复性得到Fab抗体.方法:从已构建的质粒p3MH/Fab中,亚克隆抗角蛋白抗体的轻链和Fd片段基因,并分别插入载体pET32a中,构建重组质粒.以重组质粒分别转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下进行表达.SDS-PAGE分析发现,在相对分子量(Mr)为25 000处有外源蛋白表达.轻链和Fd片段变性后等量混合于折叠液中,复性后形成Mr约为45 000的蛋白.结果:成功地表达抗角蛋白抗体的轻链和Fd片段,ELISA和Western blot证实,复性产物具有与角蛋白结合的能力.结论:获得了具有活性的抗角蛋白的Fab抗体,为其应用研究打下了基础,也表明包涵体表达基因工程抗体技术是可行的.
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趋化性细胞因子对NK细胞生物学功能的调控作用
趋化性细胞因子(chemokine)及其受体在生理及病理情况下对白细胞间交流及移行起至关重要的作用,调控着白细胞在血管、淋巴及其他组织、器官间的迁移和募集.自1996年发现趋化性细胞因子受体CCR5和CXCR4是HIV-1感染人T淋巴细胞的协同受体后,对趋化性细胞因子及其受体的研究不断深入.
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分子佐剂C3d的研究进展
血清补体蛋白C3是宿主先天性免疫防御补体系统的中心分子,在补体活化的经典途径、替代途径以及甘露聚糖结合凝集途径中均发挥枢纽作用.1996年,Dempsey等[1]制备了鸡卵溶菌酶(hen egg lysozyme,HEL)分别与1～3个小鼠C3d分子融合的偶联蛋白.以此重组抗原免疫小鼠,发现HEL-C3d2和HEL-C3d3比天然抗原的免疫原性分别提高了1 000和10 000倍,其佐剂作用远远大于完全弗氏佐剂.因此,近年来C3d作为一种新型的佐剂分子日益引起人们的关注.
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巨噬细胞的异质性
巨噬细胞广泛存在于机体的各个脏器和组织,又称为单核吞噬细胞系统(mononuclear phagocyte system,MPS),参与免疫、炎性反应及维持内环境的稳定.但这些功能并非所有的巨噬细胞在同一时间内执行,也不是所有巨噬细胞均具有这些功能,因此,巨噬细胞显示出高度的异质性(heterogeneity).巨噬细胞的异质性即其特点的差异性,主要表现在形态学、生物化学、表型和功能等方面.不同种群、个体、器官及组织的巨噬细胞具有异质性,相同个体、器官和组织的巨噬细胞也存在异质性[1,2].近年来,人们越来越重视巨噬细胞异质性与疾病的关系,并试图从巨噬细胞异质性的角度探求疾病的发生机制及治疗手段.
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抗凋亡蛋白BAG-1在胃癌组织芯片中的表达及意义
胃癌是常见的恶性肿瘤,其发病机制尚未明了.近年来,凋亡障碍及其机制已成为肿瘤学研究的一个热点.研究这些基因在肿瘤中的表达及相互作用,对于揭示肿瘤发生,发展的机制有着十分重要的意义.BAG-1是一种已经被确认的多功能结合蛋白,具有与BCL-2形成复合物促进抗细胞凋亡的作用[1].我们采用免疫组化染色法,观察了胃癌组织芯片中BAG-1的表达并就其意义进行了初步讨论.
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食入性过敏原-杏仁蛋白组分的双向电泳分析
目的:应用蛋白质双向电泳的分析技术,对一种主要的食人性过敏原-杏仁果实的蛋白质组分进行分析.方法:通过三氯乙酸法提取杏仁果实总蛋白质,通过等电聚焦和第2向SDS-PAGE分析获得完整的杏仁果实全蛋白质的图谱,并应用相应分析软件(ImageMaster 2D)对电泳图谱进行分析.结果:通过等电聚焦和第2向SDS-PAGE,有188个不同的蛋白质组分被检测出来.其中大约28%的蛋白质等电点(pI)在4.5～5.5之间,大约62%的蛋白质的相对分子质量(Mr)在(20～25)×103之间.结论:所获得的高分辨率的双向电泳图谱,是我国杏仁果实蛋白质第一张完整的蛋白质图谱,为今后杏仁果实中致敏蛋白质的检测,分离、基因克隆和变应原的标准化奠定了基础.
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大鼠外周血内皮祖细胞体外分离鉴定及内皮细胞的分化
目的:建立一种稳定的体外分离培养及诱导分化大鼠外周血内皮祖细胞(EPC)的方法.方法:抽取SD大鼠外周血,应用Ficoll密度梯度离心的方法获得单个核细胞,同时应用VEGF和bFGF诱导,使之向内皮细胞分化,以免疫细胞化学鉴定贴壁细胞的内皮标志CD31,CD34,Flk-1和vWF.结果:经VEGF和bFGF诱导后的EPC的内皮标志CD31,CD34,Flk-1和vWF在不同时段呈阳性表达.结论:大鼠外周血中含有EPC,在体外特殊诱导环境下,可定向分化为内皮样细胞.
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小鼠催产素受体基因编码区全长的克隆和真核表达
目的:为了获得小鼠催产素受体(mouse oxytocin receptor,mOTR)基因的全长编码区和构建mOTR的真核表达载体,以及在哺乳动物细胞中真核表达mOTR.方法:采用RT-PCR方法,获得有相互重叠序列的mOTR的羧基端和氨基端的cDNA片段并分别将其亚克隆入PMD 18-T载体.通过对这2个片段加入酶切位点、双酶切和相互连接,获得全长的编码序列.然后将mOTR的全长的编码序列克隆入真核表达载体pEG-FP-N3,再用脂质体转染法将pEGFP-N3-mOTR质粒转染到COS-7细胞中并进行了瞬时真核表达.结果:将mOTR的羧基端和氨基端的cDNA片段亚克隆入了PMD 18-T载体.连接并终获得了mOTR编码区的全长序列,构建了pEGFP-N3-mOTR真核表达载体.将pEGFP-N3-mOTR载体转染入COS-7细胞,并成功地进行了瞬时真核表达.结论:成功构建了包含mOTR全长编码区序列的pEGFP-N3-mOTR真核表达载体,并在COS-7细胞中进行了瞬时表达,为今后研究mOTR的功能打下了基础.
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组织芯片微量抗体的免疫组化染色
组织芯片(tissue chip)又称组织微阵列(tissue microarray)技术,是由Kononen等[1]于1998年首先建立并报道,一般是将数十至上百个甚至更多小的组织整齐有序地排列在一张载玻片上而制成缩微组织芯片,即组织切片.组织芯片蜡块可连续切片100～200张,这样用同一套组织芯片即可对上百种生物分子标记(如抗体、DNA和RNA)进行分析、检测,具有广阔的应用前景,因而倍受组织病理学专家的重视[2-4].
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人CD20跨膜区与g3pN端融合基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达
目的:构建g3pN1-hCD20跨膜及胞外区基因表达载体,并在大肠杆菌中进行高效融合表达.方法:利用反转录PCR和PCR方法,分别从Daudi细胞和M13K07噬菌体中扩增hCD20基因和编码g3pN1蛋白Nl端的基因,并重组到pTIGTrx表达载体中,在大肠杆菌中融合表达.结果:表达产物可被抗CD20分子的单克隆抗体(mAb)识别.结论:成功地表达并鉴定了目的蛋白.
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hIL-1Ra基因的克隆及在原核细胞中的表达
目的:克隆hIL-1Ra基因并在大肠杆菌中高效表达.方法:从人外周血中分离白细胞并提取其总RNA.用RT-PCR获得hIL-1Ra cDNA,克隆入pBV220表达载体进行诱导表达.对表达产物进行复性和纯化.结果:成功地构建了pBV220-IL-1Ra表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达,表达量占全菌的40%.对表达产物进行分离纯化及活性分析表明,获得纯度大于98%的样品.该样品具有明显抑制IL-1刺激EL-4细胞分泌IL-2的作用.结论:在大肠杆菌中成功地表达有活性的hIL-1Ra基因,为进一步的开发利用奠定了实验基础.
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人Nanog基因的克隆及其在COS-7L细胞中的表达
目的:克隆人Nanog基因,构建其真核表达载体,并观察其在哺乳动物细胞COS-7L中的表达.方法:利用HE293细胞的人基因组DNA为模板,以LA-PCR技术,扩增Nango的基因,定向克隆到带Flag标签的pCMV载体中,测序后,挑选序列正确的真核表达质粒pFlag-Nanog转染COS-7L细胞.用抗Flag标签的抗体,进行Western blot和间接免疫荧光染色法检测Nango蛋白的表达.结果:从人基因组DNA中克隆到序列正确的Nanog全长编码序列.所构建的Nanog质粒在COS-7L细胞中获得高效表达.结论:人Nanog基因的克隆、真核表达载体的构建及在COS-7L中的表达均获得成功,为进一步研究其功能,尤其是探讨其在神经干细胞中的作用奠定了基础.
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mTLR-2基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达
目的:克隆mTLR-2基因,并在毕赤酵母中的表达其融合蛋白.方法:采用RT-PCR从鼠肝脏中扩增mTLR-2全基因,并将其克隆到T载体中,测序验证.将目的基因编码序列插入毕赤酵母表达载体pPICZαC中,构建重组质粒,并转化毕赤酵母.重组酵母以PCR、RT-PCR验证,表达的重组蛋白用SDS-PAGE和Western blot进行分析.结果:克隆了mTLR-2全基因(AY179346),与已发表的mTLR-2基因的同源性为99.84%.构建了重组表达质粒pPICZ-mTLR-2.SDS-PAGE和Western blot分析显示,在相对分子质量(Mr)为约97 000处出现1条特异性蛋白带,且能与兔抗mTLR-2抗体发生反应.结论:克隆了mTLR-2全基因,并在毕赤酵母中获得表达.
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流式细胞术在外周血嗜酸性粒细胞及其相关分子检测中的应用
目的:应用流式细胞术,建立一种准确、外周血嗜酸性细胞及其相关分子的快速测定方法.方法:采集正常人外周血,用茶碱(10-4mol/L)、地塞米松(10-4mol/L)和rhIL-5(10-8mol/L)预处理,用抗CD16-PE mAb与FITC标记的抗相关细胞分子的进行双标记染色,并以CD16-FL2辅助设门,准确找到嗜酸性粒细胞群,然后对其相关分子进行分析.结果:嗜酸性粒细胞定位准确,茶碱和地塞米松能够抑制IL-5引起的Eos的活化并使其表面的CD62L脱落.结论:应用流式细胞术与二色荧光mAb CD16-PE阴性细胞法设门,可准确快速地检测外周血中嗜酸性粒细胞及分子的表达率,血液用样量小,人为影响因素少,是免疫学基础研究和临床检验较理想的测定方法.
| 年 | 期数 |
| 2018 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2017 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2016 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2015 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2014 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2013 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2012 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2011 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2010 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2009 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2008 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2007 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2006 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2005 | 01 02 03 04 05 06 z1 |
| 2004 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2003 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2002 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2001 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2000 | 01 02 03 04 05 06 |
| 1999 | 01 02 |
| 1995 | 01 02 03 |
| 1994 | 01 02 |
| 1993 | 01 02 03 04 |
| 1992 | 01 02 03 04 |
| 1991 | 01 02 03 04 |
| 1990 | 01 02 |
| 1989 | 01 02 03 04 |
