细胞与分子免疫学杂志
Chinese Journal of Cellular and Molecular Immunology 세포여분자면역학잡지
- 主管单位： 中国免疫学会；第四军医大学
- 主办单位： 陕西省免疫学会,中国免疫学会
- 影响因子： 0.81
- 审稿时间： 1-3个月
- 国际刊号： 1007-8738
- 国内刊号： 61-1304/R
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
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重组载体pEGFP-ANG的构建及ANG基因在HUVEC中的表达
目的:建立血管生成素(angiogenin, ANG)基因的真核表达系统.方法:采用化学合成拼接法, 获得人ANG全长cDNA并测序, 构建重组荧光真核细胞表达质粒pEGFP-ANG, 然后经脂质体介导转染人脐静脉内皮细胞(HUVEC).应用荧光显微镜观测及免疫组化染色, 对转染细胞内pEGFP-ANG的表达进行鉴定.结果:测序表明, 编码的氨基酸序列与人ANG完全一致.荧光显微镜下可见转染的HUVEC内发出强绿色荧光.免疫组化检测显示, 转染的HUVEC中有棕色颗粒.结论:获得了人ANG的全长编码基因.构建的重组体pEGFP-ANG转染HUVEC后, 可表达人ANG蛋白.
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利用噬菌体肽库筛选抗黏附的活性多肽
目的:筛选抗内皮细胞与单核细胞黏附的活性多肽.方法:①以氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL, 100 mg/L) 损伤的内皮细胞作为筛选的"靶"细胞, 从XCX15肽文库(X代表随机氨基酸, C为半胱氨酸, X15代表编码随机15肽)中, 筛选能与受损内皮细胞特异性结合的多肽. ②用ELISA法鉴定部分阳性克隆, 经DNA序列测定确定其插入的氨基酸序列. ③以计数法检测特异性噬菌体多肽对内皮细胞与单核细胞黏附率的影响.结果:①从挑选鉴定的14个克隆中, 得到6个阳性克隆, 测序结果有两个克隆的外源多肽序列相同, 4个克隆的外源多肽中含有亮氨酸-亮氨酸重复序列. ②两个序列相同的克隆的噬菌体多肽, 能明显降低内皮细胞与单核细胞的黏附率(分别降低17.0%和17.6%, P<0.01, n=4).结论:从XCX15肽文库中, 初步鉴定出1个具有较明显地抗内皮细胞与单核细胞黏附作用的活性多肽.
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雌激素受体基因敲除小鼠脾脏免疫学改变的形态学观察
目的:形态学观察雌激素受体基因敲除小鼠脾脏免疫学指标是否发生改变.方法:应用免疫组织化学和免疫荧光法进行检测.结果:雌激素受体基因敲除小鼠, 尤其是ERβ敲除小鼠(BERKO)的脾脏出现多种异常, 如促炎症细胞因子和诱导型一氧化氮增高, 脾细胞增殖增强并能抵抗雌激素的抑制作用, IgM/IgG表达也明显增高.雌激素受体缺乏小鼠脾脏NF-kB的激活可能是脾细胞过分活跃的原因.结论:雌激素受体, 尤其是ERβ在介导雌激素对免疫反应的调节中起重要作用, ERβ缺失可能增加机体对自身免疫性疾病的敏感性.
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GFP基因转染对骨髓基质细胞体内向软骨细胞分化的示踪作用
目的:实现绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)报告基因在骨髓基质细胞(BMSC)中的高效、稳定、持久表达, 直接示踪BMSC在关节软骨缺损内的分布及分化.方法:构建重组逆转录病毒表达载体RV-GFP, 通过PT67包装细胞克隆、G418筛选及扩增, 获得大量含GFP基因的假病毒液, 并直接转染BMSC.将含有GFP基因转染标记的BMSC与生物可降解材料复合后, 植入猪自体关节软骨缺损处, 7个月后共聚焦显微镜检测修复组织中GFP标记的BMSC的分布及分化. 结果:经双酶切鉴定证实重组逆转录病毒表达载体RV-GFP构建成功, 转染PT67细胞后可在荧光激发波长下, 发出明亮的绿色荧光, 转染率达20%～50%, 经G418筛选后可达100%.筛选、扩增后, PT67细胞的上清培养液可成功地转染BMSC, 筛选后能稳定、持久、高效表达GFP.将标记的BMSC植入关节软骨缺损7个月后, 修复组织仍能高效表达GFP, 激光共聚焦显微镜下显示, 多数新生软骨陷窝内有GFP标记的细胞. 结论:构建的重组逆转录病毒GFP载体, 能持久标记骨髓基质细胞, 用于细胞动态变化的研究及细胞转归的示踪, 该方法简便、灵敏、可靠、直观.标记的BMSC可在关节软骨缺损内分化为成熟的软骨细胞, 并在软骨缺损的修复中发挥重要作用.
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甘草酸18α体对梗阻性肾病大鼠肾间质中NF-κB表达的影响
目的:探讨甘草酸18α体对梗阻性肾病大鼠肾间质中NF-κ B表达的影响.方法:结扎大鼠单侧输尿管建立梗阻性肾病模型.分别于术后7、14、28 d和56 d处死实验动物, 切取肾皮质部位组织, 用光镜、电镜观察肾间质的病理形态学变化; 用免疫组织化学染色检测肾间质中NF-κ B和Ⅲ型胶原蛋白的表达, 并用EIG综合图象分析系统对其表达进行半定量分析.结果:模型显示肾间质呈进行性纤维化.半定量分析发现, 手术后7 d, 甘草酸治疗组和预防组与假手术组相比较, 肾间质中NF-κ B和Ⅲ型胶原蛋白的表达呈进行性的显著增多(P<0.01), 与生理盐水组相比较呈进行性的显著减少(P<0.01), 但甘草酸治疗组和预防组之间无明显差异(P>0.05).结论:甘草酸可能通过下调梗阻性肾病大鼠肾间质中NF-κ B的表达, 抑制肾间质纤维化的发生.
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ICAM-1协同参与TNFRI介导的TM-TNF-α杀瘤作用
目的:寻找协同参与TM-TNF-α杀瘤作用的膜表面分子, 探讨TM-TNF-α杀瘤及两型TNF-α生物学效应差异的分子机制. 方法:利用抗体封闭实验及RT-PCR, 检测ICAM-1及VCAM-1对TNFR1或TNFRII介导的TM-TNF-α杀瘤效应是否具有协同作用. 结果:封闭表达TNFR I的MCF-7细胞表面的ICAM-1, 可显著降低TM-TNF-α对其杀伤的作用; 而封闭VCAM-1无明显效应.封闭表达TNFR II的HL-60细胞表面的ICAM-1或VCAM-1, 均对TM-TNF-α的杀伤作用无影响.结论:ICAM-1对于TM-TNF-α通过I型受体介导的杀瘤效应具有协同作用.
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CⅡTA-pI在树突状细胞中特异启动活性的研究
目的:检测MHCⅡ类分子反式激活因子Ⅰ型启动子(CIITA-pI)是否具有启动活性及其在树突状细胞(dendritic cell, DC)中的特异启动活性.方法:利用荧光素酶报告系统, 检测仅112 bp的Ⅰ型CIITA-pI在DC中的特异启动活性及报告基因在DC不同成熟程度下的表达.结果:该启动子在DC中能够特异启动报告基因的表达, 而在非DC细胞中几乎无启动活性; 其启动活性随DC的成熟程度而上升.结论:为进一步应用CIITA-pI作为DC特异性启动子进行靶向基因治疗奠定了基础.
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γ辐射诱发的人AHH-1 T淋巴细胞凋亡及其调控机制
目的:研究电离辐射诱发正常人AHH-1 T淋巴母细胞凋亡的特点及其调控机制, 为辐射免疫损伤的防治提供实验依据.方法:用TUNEL、麦格-姬姆萨(MGG)法、MTT比色法及碱磷酶免疫组织化学染色法, 分别检测T细胞凋亡、细胞活存以及Bax、Bcl-XL和caspase-3重要凋亡相关蛋白的表达及规律.结果:①在一定照射剂量范围内随照射剂量的增加, AHH-1 T细胞凋亡率持续升高, 而细胞活的活存率则急剧下降, 两者均呈现明显的剂量效应关系.②促凋亡蛋白Bax的表达随照射剂量的增加明显增强, 而凋亡抑制蛋白Bcl-XL则呈持续下降的趋势.③活化的凋亡执行蛋白caspase-3的活性随照射剂量的增加显著升高, 与凋亡率呈现明显的相应关系.结论:AHH-1 T细胞的大量凋亡, 可能是辐射导致淋巴细胞急剧减少、机体免疫功能降低的重要原因; Bax、Bcl-XL和caspase-3蛋白在辐射诱发的T细胞凋亡调控中具有重要作用.
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人肝再生增强因子相互作用蛋白基因的克隆
目的:寻找与人肝再生增强因子(hALR)相互作用的蛋白质, 探讨其在肝再生过程中的分子生物学机制.方法:采用酵母双杂交系统, 以hALR作诱饵蛋白筛选预转化的人肝cDNA文库, 对阳性克隆进行生物信息学分析.结果:筛选出6组与hALR具有特异性相互作用的蛋白基因, 分别是:血清白蛋白、金属硫蛋白、Na/K-ATPase、硒蛋白P和两个未知功能基因的cDNA序列.结论:初步克隆了与hALR相互作用蛋白基因, 为以后深入研究这些蛋白质与hALR之间的相互作用, 进一步揭示hALR的作用机制奠定了基础.
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人肥大细胞羧肽酶编码区基因的克隆与鉴定
肥大细胞是变态反应发生的重要效应细胞, 可产生和释放多种参与变态反应的炎性介质, 其中蛋白酶是一类重要的炎性介质, 以中性蛋白酶为主, 约占肥大细胞蛋白总量的50%[1].中性蛋白酶主要包括肥大细胞类胰蛋白酶、肥大细胞羧肽酶(human mast cell carboxypeptidase, HMC-CP)和肥大细胞类糜蛋白酶, 分别占肥大细胞蛋白总量的20%、12%和3%左右[1].对于肥大细胞类胰蛋白酶和类糜蛋白酶, 有关学者已进行了较深入的研究.但迄今对HMC-CP的研究报道却甚少, 由于肥大细胞中HMC-CP的含量较高, 而其功能及其在变态反应中的作用尚不清楚.本研究中, 我们用RT-PCR法获取HMC-CP cDNA, 以便为进一步表达重组HMC-CP和对其功能进行研究打下基础.
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人类TAP1基因克隆及表达载体的构建
抗原处理相关转运体(TAP)属于ABC(ATP-binding cassette)转运体超家族B亚家族.人类TAP基因位于6号染色体上的MHC-II类基因区, 其编码的TAP1和TAP2分子, 分别由748和686个氨基酸残基所组成, 两者可形成异源二聚体参与肽类的转运过程, 在MHC-I类分子介导的抗原递呈途径中起着重要作用[1, 2].因此, TAP的异常将严重影响抗原递呈, 成为病毒感染及肿瘤细胞逃避免疫监视的重要机制[3], 如卵巢癌 [4]、肝癌[5]及宫颈癌[6]细胞中TAP1的表达量明显下降.我们在本实验中, 从B淋巴母细胞系中克隆出TAP1基因, 并构建了其表达载体pcDNA3.1/V5-His TOPO TA-TAP1.
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基于重组α-病毒的基因疫苗对小鼠肥大细胞瘤P815的防治作用
目的:探讨基于α-病毒的基因疫苗的免疫学效应作用, 寻找更好的基因疫苗形式. 方法:用磷酸钙法共转染表达质粒P1A/pSMART2a和包装质粒helper到293细胞中, 制备高水平的重组α-病毒P1A/SFV.鉴定病毒及其表达后, 用其免疫小鼠, 测定免疫动物体内抗体生成情况和特异CTL的杀伤效应.在预防性和治疗性实验中, 测定该重组病毒免疫动物后60 d内动物的无瘤率和生存率.结果:该重组病毒疫苗在体外培养细胞中有很好的表达.用其免疫动物后, P1A/SFV能激发比对照组强得多的CTL杀伤效应.在E/T比为100∶ 1时, P1A/SFV组CTL的杀伤率为75%.抗体在所有组别中均未见产生.在保护性和治疗性实验中, 于60 d实验期限内, P1A/SFV的效果好.保护性实验第60天时, P1A/SFV组动物的无瘤率达到60%; 而P1A/pCI-neo组只有20%.在治疗性实验第60天, P1A/SFV组小鼠的存活率达到50%左右; 而其他对照组都只有10%左右.结论:相对于普通基因疫苗, 基于重组α-病毒的基因疫苗效果好, 为临床肿瘤的基因治疗提供了新的思路.
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小鼠白细胞介素21 cDNA的克隆及真核表达质粒的构建
目的:克隆小鼠白细胞介素21(IL-21)基因, 构建真核表达质粒, 用以进行肿瘤的基因治疗. 方法:用RT-PCR法, 从ConA活化的小鼠T细胞中扩增IL-21 cDNA, 克隆入哺乳动物细胞高效表达质粒pcDNA3.1中, 构建重组mIL-21真核表达质粒.重组体用载体上的通用引物和PCR下游引物为测序引物, 鉴定克隆的正确性.将已鉴定的重组质粒用脂质体法转染Sp2/0细胞, 用RT-PCR法鉴定转染细胞中IL-21基因的表达, 用MTT比色法检测表达的mIL-21诱导的NK细胞杀伤活性的增强. 结果:正确构建了重组真核表达质粒pcDNA3.1/mIL-21, 并在转染的细胞中检测出IL-21的表达, 表达的mIL-21可在体外增强NK细胞的杀伤活性.结论:成功地构建了重组真核表达质粒pcDNA3.1/mIL-21, 为进一步在肿瘤动物模型中进行IL-21基因治疗及疗效观察奠定了基础.
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具有自发活性的重组caspase-3对裸鼠SKBr-3肿瘤生长的抑制
目的:探讨具有自发活性的caspase-3分子对乳腺癌肿瘤细胞凋亡的诱导作用. 方法:重构型caspase-3转染SKBr-3细胞后, 以观察细胞的形态、进行细胞计数和及流式细胞仪分析等方法, 验证caspase-3大、小亚基顺序颠倒的重构型caspase-3分子的促凋亡活性.将重组真核表达载体pcDNA3-revcaspase-3直接注射荷瘤裸鼠研究其对肿瘤生长的抑制作用, 间接免疫荧光染色法检测肿瘤组织中重构型caspase-3基因表达情况, 用TUNEL法检测肿瘤细胞的凋亡. 结果:重构型caspase-3基因转染后, 可诱导SKBr-3细胞凋亡, 将pcDNA3-revcaspase-3重组质粒直接注射荷SKBr-3瘤裸小鼠后, 肿瘤的生长明显受到抑制, 免疫组化染色可检出重构型caspase-3蛋白的表达; TUNEL法检测证实肿瘤细胞发生凋亡. 结论:重构型caspase-3基因的体内表达可诱导SKBr-3细胞凋亡.
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截短型人bid基因的克隆、表达和促凋亡作用的研究
目的:探讨截短型 bid(truncated bid, tbid)基因的表达对Hela细胞的促进凋亡活性.方法:用RT-PCR法克隆人全长bid基因, 测序正确后, 通过PCR截去编码N末端60个氨基酸残基的基因, 而获得tbid基因.将其克隆入含绿色荧光蛋白(GFP)基因的真核表达载体pIRES2-EGFP中, 用脂质体法转染Hela细胞.通过荧光显微镜、电子显微镜观察和TUNEL检测法, 检测目的基因的表达对转染细胞的形态及生长状况的影响.结果:成功地构建了tbid基因的真核表达载体.以其转染Hela细胞后, tbid基因在细胞中得到表达, 随后引起细胞荧光强度下降, 生长状况不良甚至死亡.电镜观察及TUNEL检测的结果显示, 许多细胞呈典型的凋亡特征. 结论:tbid基因的表达可促进Hela细胞的凋亡.
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hdll1ext-Fc融合蛋白真核表达载体的构建及表达
目的:构建人dll1ext(human delta-like1 extracellular region)-Fc融合蛋白的真核表达载体pEF-BOSneo-hdll1ext-Fc, 并在COS-7细胞中进行表达.方法:从人脑cDNA文库中PCR扩增人delta-like1胞外段, 通过DNA重组构建真核表达载体pEF- BOSneo-hdll1ext-Fc.瞬时转染COS-7细胞, 应用RT-PCR、细胞免疫荧光技术和双抗体夹心ELISA, 检测融合蛋白的表达.结果:成功地构建了真核表达载体pEF-BOSneo-hdll1ext-Fc.以重组载体转染COS-7细胞后, RT-PCR结果显示delta-like1胞外段与IgG1 Fc在mRNA水平正确拼接; 细胞免疫荧光染色呈阳性反应; 夹心ELISA法检测到细胞培养上清中有融合蛋白的表达.结论:成功地扩增了人delta-like1胞外段, 构建了pEF-BOSneo-hdll1ext-Fc真核表达载体, 并在COS-7细胞中获得表达, 为下一步研究奠定了基础.
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M-CSF、IL-10对单核细胞IL-12、IL-18产生及HLA-DR和CD80表达的影响
目的:探讨巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和白细胞介素10(IL-10)对人外周血单核细胞分泌IL-12、IL-18及细胞表面HLA-DR和CD80表达的影响.方法:从健康献血员血液中分离单核细胞并进行体外培养, 分别以M-CSF和IL-10单独及共同作用, 收集上清, 用ELISA法检测单核细胞IL-12和IL-18的分泌, 用流式细胞术检测细胞表面HLA-DR及CD80的表达.结果:①M-CSF能诱导单核细胞分泌IL-18(P<0.05); IL-10则能抑制IL-18的产生(P<0.05), 并拮抗M-CSF增强LPS诱生IL-18的作用(P<0.05).M-CSF和IL-10均能抑制单核细胞分泌IL-12 p40(P<0.05), 并具有协同效应(P<0.05).②M-CSF能诱导单核细胞表面HLA-DR的表达(P<0.05); IL-10则可抑制HLA-DR的表达, 并拮抗 M-CSF对HLA-DR的诱导作用.M-CSF对CD80表达的影响不大, IL-10能促进CD80的表达.结论:M-CSF和IL-10可通过对单核细胞分泌IL-12、IL-18及HLA-DR和CD80表达的调节, 影响T细胞的活化、分化及其介导的免疫应答.
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狼疮肾炎患者血清IL-16及PBMC中IL-16 mRNA的表达
近年来, 细胞因子及其网络在狼疮肾炎(LN)发病机制中的作用已得到人们越来越多的重视.同健康正常人群相比较, LN患者存在多种细胞因子的异常变化; 而其变化谱又不同于其他自身免疫性疾病(如类风湿关节炎), 更重要的是, 细胞因子的变化还与LN患者的不同临床表现相关联 [1].
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乙型肝炎病毒上调HepG2细胞表面HLA-I表达的机制
目的:探讨HBV野生株(WT)及核壳蛋白变异株L97、V60上调HepG2细胞表面HLA-I表达的机制.方法:将已构建的重组表达载体EBO-WT、EBO-L97及EBO-V60, 分别经脂质体介导转染HepG2细胞, 以空载体EBO作为对照.用RT-PCR半定量法, 检测细胞内HLA-A基因及抗原提呈相关基因LMP2、TAP1和tapasin mRNA的表达; 用Western blot测定细胞内HLA-I蛋白的表达.结果:3株HBV重组表达载体转染的细胞, 均呈现明显的HLA-A cDNA的PCR扩增条带及HLA-I蛋白条带, 但其条带的强度有差异, EBO-L97、EBO-WT和EBO-V60依次减弱. TAP1 cDNA扩增带清晰, 3株HBV间无明显差别.对照细胞未呈现HLA-A的条带和仅呈现微弱的TAP1扩增带.各转染细胞均未检出LMP2及tapasin mRNA的表达.结论:HBV能诱导 HepG2细胞内HLA-I分子的合成量, 使TAP1基因转录增强, HLA-I的表达上调. 核壳蛋白变异株L97和V60, 可使宿主细胞内HLA-I mRNA和其蛋白的表达水平发生变化.
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抗人B细胞淋巴瘤DNA疫苗的构建
目的:探讨人B细胞淋巴瘤活检组织中肿瘤细胞膜表面免疫球蛋白VH(smIgVH)基因片段能否在动物体内激发特异性抗独特型抗体.方法:以RT-PCR法获得IgVH基因片段, 以小鼠单核细胞趋化因子(MCP-3)基因作为佐剂分子, 进行重组PCR获得MCP-3和VH基因片段的融合基因, 克隆在真核表达载体pcDNA3.1中, 构建DNA疫苗质粒pcDNA/MCP-BVH. 通过脂质体转染验证该质粒在真核细胞COS-7中的表达.结果:通过上述方法获得了以活检组织肿瘤细胞mIg VH区基因片段; 成功地构建了DNA疫苗质粒pcDNA/MCP-BVH.体外瞬时转染实验证明, 该质粒能够在真核细胞COS-7中正确表达.结论:成功地构建重组表达质粒pcDNA/MCP BVH, 在体外能够正确表达, 为进一步研制抗B细胞淋巴瘤基因疫苗奠定了基础.
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mPEG-BTC对血小板表面HLA抗原的化学修饰
目的:研究mPEG有效修饰血小板表面HLA抗原的方法及效果.方法:在22℃、pH 7.4的PBS介质中, 采用浓度梯度法修饰血小板表面的HLA抗原.并分别用处理前后的血小板吸收血清中的相应抗体, 通过微量混合淋巴细胞毒试验检测化学修饰的效果.结果:经mPEG处理后的血小板无吸收血清中相应抗体的能力, 微量淋巴细胞毒试验为阳性; 未经mPEG处理的血小板则与之相反.结论:血小板表面的HLA抗原经mPEG修饰后, 可完全阻断其与相应抗体间的特异性免疫反应.
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类胰蛋白酶和环孢素体外促人胚肾成纤维细胞的增殖
自1976年报道环孢素A(cyclosporin A, CsA)可明显改善器官移植的成功率以来, 现已广泛应用于器官移植及自身免疫病的治疗, 尤其在防止早期的移植排斥反应、延长移植物的存活期方面, 已作为临床的首选药物.但随着应用时间的延长, 发现其存在着不可忽视的毒副作用(如慢性肾毒性).在肾移植的临床实践中, 慢性排斥反应已成为移植肾功能丧失的主要原因.在对慢性排斥肾的病理分析中, 发现慢性排斥肾的病理特征为肾脏组织的纤维化.动物实验也证实, CsA可引起肾脏、肝脏的纤维化改变[1], 在以往的实验中, 我们发现移植肾中存在大量的肥大细胞, 表明肥大细胞与肾移植排斥反应密切相关[2,3].Pardo 等[4,5]研究发现, 肥大细胞分泌的类胰蛋白酶(tryptase)在许多组织(如肺、肝和皮肤等)的纤维化病理过程中起着重要的作用, 为了探讨类胰蛋白酶、 CsA在肾纤维化过程中是否存在同样的作用, 我们对体外培养的原代及传代的人胚肾成纤维细胞进行了诱导, 观察了类胰蛋白和CsA体外促细胞增殖的效应.
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烧伤大鼠休克期红细胞趋化因子受体结合活性的变化
目的:探讨烧伤大鼠休克期红细胞趋化因子受体(ECKR)结合活性的变化.方法:SD大鼠随机分成烧伤组和对照组; 烧伤组大鼠体表总面积(TBSA)的30%为Ⅲ度烫伤.应用ELISA法, 以IL-8为配体检测烧伤后休克期不同时间点ECKR的结合活性.结果:伤后0.5 h起, 大鼠ECKR的结合活性均明显下降, 并维持至伤后48 h, 与对照组相比较差异显著(P<0.01).不同时间点相比较, 自伤后2 h起大鼠ECKR的结合活性呈逐渐下降趋势, 至伤后24 h达低值; 伤后48 h, 大鼠ECKR的结合活性则有明显升高, 与对照组相比较差异均显著(P<0.05～0.01).结论:烧伤后ECKR的结合活性明显下降, 提示红细胞可能通过趋化因子家族的作用参与了对炎症的调控.
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类风湿关节炎小鼠关节聚集的T细胞克隆型变化的分析
目的:通过对类风湿性关节炎(RA)小鼠模型发病不同时期的四肢足关节聚集的T细胞克隆型的分析,了解T细胞克隆型与RA病变的关系. 方法:用RT-PCR/SSCP法, 对一种自发性RA小鼠模型(SKG小鼠)发病初期与后期四肢足关节聚集的T细胞克隆型进行比较分析. 结果:在发病后期, 四肢足关节中一致的Vβ2和Vβ8.2 T细胞克隆型均明显升高(分别为72.3%和60.2%). 结论:TCR为Vβ2和Vβ8.2的T细胞克隆, 可能对于SKG小鼠RA的发展起重要作用.
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人幽门螺杆菌18 000外膜蛋白与HspA双价疫苗的构建和表达
目的:构建含人幽门螺杆菌(Hp)热休克蛋白A(HspA)和Mr为18 000的外膜蛋白编码基因的重组载体, 进行核苷酸序列分析, 并在E.coli BL21中表达.方法:用PCR方法从Hp DNA染色体中, 扩增HspA编码基因片段.将目的基因HspA与载体pET32a(+)分别经kpnⅠ和BamH I 双酶切后, 进行连接、测序.同时将重组载体pET32a(+)/HspA和pET32a(+)/Omp18, 分别经Hind III和BamH I 双酶切, 通过凝胶电泳回收pET32a(+)/HspA和Mr 18 000 OMP DNA片段, 经T4连接酶将HspA和Mr 18 000 OMP编码基因通过酶切粘端进行连接, 而后转化并筛选含有两种目的基因的重组载体, 并在大肠杆菌BL21(DE30)中表达.表达产物经Ni-NTA琼脂糖树脂纯化后, 以Western blot分析其抗原性.结果:经酶切、测序表明, 插入的基因片段为Hp HspA和Mr为18 000 OMP编码基因, 由891个碱基组成, 与GenBank中登录的序列相比较, 有1.15%的碱基发生变异, 1.26%的氨基酸残基改变.经SDS-PAGE分析发现, 融合基因表达的蛋白Mr为51×103 , 其中pET32a(+)表达的蛋白Mr约为20×103, 可溶性表达产物占菌体总蛋白的18.96%.重组蛋白经Ni-NTA琼脂糖树脂纯化后, 其纯度达95%以上.用Western blot分析显示, 该重组蛋白可被Hp阳性患者的血清及抗Mr为18 000 OMP单克隆抗体所识别, 具有良好的抗原性.结论:成功地克隆并融合表达了Hp HspA和Mr为18 000 OMP, 为Hp疫苗和快速诊断试剂盒的研制奠定了基础.
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人外周血抗CD3单克隆抗体激活的杀伤细胞系的建立
诱导和维持T细胞抗肿瘤的免疫疗法, 近有了新的认识[1].T细胞被活化还是产生耐受, 有赖于肿瘤特异性抗原产生的部位和时机[1,2].在肿瘤发生的局部, T细胞失能或被清除, 或者转移的瘤细胞与T细胞"隔离"使肿瘤抗原不能被T细胞识别而产生耐受[2].T细胞介导的特异性免疫应答, 在机体抗肿瘤过程中起主要作用, 必须打破其免疫耐受才有利于治疗.近年, 用肿瘤抗原体外致敏的树突状细胞回输, 可激发和增强T细胞的特异性抗肿瘤免疫应答.
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抗肉毒神经毒素A(BoNT/A)单克隆抗体的制备与鉴定
目的:制备抗肉毒毒素A(BoNT/A)的单克隆抗体(mAb).方法:用纯化的重组BoNT/A-Hc片段免疫BALB/c小鼠, 取其脾细胞与骨髓瘤Sp2/0融合, 经间接ELISA筛选和克隆化制备杂交瘤细胞系, 及Western免疫印迹分析等方法对mAb进行特异性鉴定.结果:获得3株杂交瘤细胞株:命名为4A8、2F7和4F2, IgG亚类鉴定均为IgG1, 腹水mAb的效价在1×10-4～1×10-6之间.其中, 4A8和4F2能稳定分泌抗BoNT-A mAb, 并可特异性地识别重组BoNT/A和天然BoNT/A, 特别是4A8可保护小鼠抵抗10 LD50 BoNT/A的攻击. 结论:成功地制备3株特异性抗BoNT/A mAb, 并有1株属于中和性mAb, 为BoNT/A的检测和肉毒中毒的临床治疗奠定了基础.
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兔抗人硒蛋白P抗体的制备与鉴定
目的:以原核表达的人硒蛋白P片段(HSelP)制备其兔多克隆抗体并进行鉴定.方法:在E.coli中诱导表达HSelP片段, 经DEAE fast flow和Ni-NTA-Agarose柱层析纯化后, 以其为免疫原制备兔抗HSelP抗体, 并以Western blot鉴定抗体的特异性.结果:成功地表达并纯化了HSelP, 制备的兔抗HSelP抗体可有效地检测天然的SelP.结论:以原核表达并纯化的HSelP为免疫原, 成功地制备了兔抗该蛋白的抗体, Western blot鉴定特异性良好.为进一步研究硒蛋白P的功能、分布及建立较简便的检测方法打下了基础.
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抗rhNDPK-A单克隆抗体的制备及鉴定
目的:研制抗rhNDPK-A(recombinant human nucleoside diphosphate kinase-A)单克隆抗体(mAb), 并鉴定其特性.方法:以纯化的rhNDPK-A免疫BALB/c小鼠, 采用杂交瘤技术制备抗rhNDPK-A mAb; 用免疫双扩散鉴定Ig亚类; Western blot鉴定mAb的特异性; 间接ELISA检测mAb的腹水效价、亲和常数, 并进行表位分析.结果:获得6株可分泌特异性mAb的抗 rhNDPK-A的杂交瘤细胞系2D9、8C7、13E2、15D9、15E3和20D9, Ig亚类均为IgG1; 其效价为1×10-4～5×10-6; 亲和常数为4.5×10-9～2.8×10-10 mol/L; 共有3个抗原表位. 结论:获得抗rhNDPK-A的mAb, 为进一步用于临床诊断和实验研究创造了条件.
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SARS冠状病毒编码蛋白质及其基因分析的研究进展
2003年初, 一种严重的急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome, SARS)从我国广东省迅速向周边地区蔓延.直到6月4日, 世界卫生组织(WHO)共接到来自全球29个国家和地区累计8 402起病例报告, 其中国内就有5 329人感染.在WHO的协调下, 全球10个国家的11个实验室, 于3月12日组成了合作研究网络.4月, 香港的研究人员宣布, 一种未知的新型冠状病毒(SARS-CoV)可能是SARS的病因[1]. 随后, 加拿大[2]、美国[3]和中国[4]的科研人员相继公布了SARS-CoV的全基因组序列.5月13日, 德国科学家在比较其他已知冠状病毒的基础上, 发表了SARS-CoV的一种主要蛋白酶的三级结构[5].研究SARS-CoV的结构特性、分布变异、传染途径、病理过程与临床表现, 对防治进而攻克传染性非典型肺炎具有十分重要的意义.本文将对SARS-CoV的编码蛋白、基因组序列分析以及系统发生等进行综述.
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重组人淋巴毒素α缺失体的表达、纯化及鉴定
目的:构建重组人淋巴毒素α缺失体(rhLT-αΔN27)的原核表达载体, 在大肠杆菌中进行表达, 建立纯化rhLT-αΔN27的工艺.方法:从Jurkat细胞中提取总RNA, 用RT-PCR扩增rhLT-αΔN27基因, 并插入原核表达载体pET-23b中, 转化大肠杆菌BL21(DE3), 用IPTG诱导rhLT-αΔN27表达.包涵体经洗涤和复性后, 用DEAE Sepharose FF和Phenyl-Sepharose FF纯化.结果:rhLT-αΔN27以包涵体的形式表达, 表达量占菌体总蛋白的30%以上.纯化后, rhLT-αΔN27的纯度达99%, 比活性高于8×107 U/mg.纯化样品的相对分子质量(Mr)、等电点, 以及N端序列等其他理化性质均同预计的结果相符.结论:构建了rhLT-αΔN27的表达载体, 并成功地在大肠杆菌中进行了表达, 建立了rhLT-αΔN27的纯化工艺.
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慢性粒细胞白血病患者红细胞免疫功能的检测
慢性粒细胞白血病(chronic granulocytic leukemia, CGL)是人体多能造血干细胞水平异常恶性增殖性疾病, 多见于中老年男性.CGL在细胞遗传学、分子生物学、细胞生物学及免疫学方面均有异常.为此, 我们检测了35例CGL患者红细胞免疫功能的相关指标.
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小鼠4-1BBL cDNA的克隆和表达及其抗肝癌的免疫作用
目的:克隆小鼠4-1BBL基因, 构建其真核表达载体, 并观察其在抗肝癌免疫中的作用.方法:取C57BL/6小鼠脾细胞, 经PHA诱导后, 以RT-PCR克隆4-1BBLcDNA, 测序, 构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-m4-1BBL.以重组体转染小鼠肝癌细胞Hepa1-6, 经G418筛选后, 以RT-PCR、间接免疫荧光及流式细胞仪, 检测m4-1BBL以获得稳定高表达克隆.然后将其制成肿瘤细胞疫苗与同源小鼠脾淋巴细胞混合培养, 采用 MTT比色法测定淋巴细胞的特异性杀伤活性.结果:从小鼠脾细胞中克隆到m4-1BBLcDNA, 经测序完全正确.所构建的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-m4-1BBL, 在小鼠肝癌细胞Hepa1-6中获得稳定高效表达.与野生型Hepa1-6细胞相比较, m4-1BBL基因转染的Hepa1-6细胞疫苗能较有效地诱导淋巴细胞产生针对野生型 Hepa1-6细胞的特异性杀伤活性 (P<0.01).结论:将 m4-1BBL基因导入肝癌细胞中表达, 能提高其免疫原性, 诱导有效地抗肝癌免疫应答.
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两种hIL-6/GM-CSF融合蛋白基因的构建、表达及活性比较
目的:构建及表达具有hIL-6和hGM-CSF双重生物学活性的hIL-6/GM-CSF融合蛋白分子.方法:应用PCR技术对hIL-6和hGM-CSF的基因分别加以改造, 同时在两者之间加上连接肽序列(G-G-S-G-S)3, 克隆PCR产物, 并构建成克隆有两种融合蛋白基因的pBV220表达质粒, 两种融合蛋白分别是:IL-6(1～184)-GM-CSF(9～127)(简称IG1)和IL-6(24～184)-GM-CSF(9～127)(简称IG2).将表达质粒分别导入E.coli BL-21中诱导表达.通过Q Sepharose HP离子交换柱和 Sephacryl S-200分子筛柱二步柱纯化目的蛋白.使用hIL-6依赖细胞株B9和hGM-CSF依赖细胞株TF1, 通过MTT比色法测定融合蛋白的生物学活性.结果:对两种融合蛋白基因的测序结果表明, 其序列与理论设计完全一致.表达质粒在E.coli BL-21中均得到高效表达, 表达的融合蛋白均占总蛋白含量的25%以上, 表达产物以包涵体的形式存在, 通过Q Sepharose HP离子交换柱和 Sephacryl S-200分子筛柱二步柱纯化及复性后, 获得两种目的蛋白, 其纯度均达到95%以上.活性测定结果表明, 两种融合蛋白均具有较高的hIL-6和hGM-CSF的双重生物学活性.结论:获得了具有较高纯度和双重生物学活性的hIL-6/GM-CSF融合蛋白.
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HER-2/neu配体结合区2蛋白的甘露糖化修饰
目的:建立一种蛋白质甘露糖化修饰的方法. 方法:用离子交换层析和钴亲和层析法, 纯化重组HER-2/neu配体结合区2(LBD2)蛋白, 并将纯化后的LBD2蛋白进行甘露糖化修饰.新合成的LBD2拟糖蛋白经质谱法检测后, 用间苯二酚-硫酸法进一步鉴定. 结果:纯化后LBD2蛋白的纯度可达90%.新合成的LBD2拟糖蛋白在质谱图上呈现相应于甘露糖修饰后蛋白质分子量的预期峰形.经间苯二酚-硫酸法检测, 结合于LBD2蛋白上的化学基团为糖分子. 结论:获得了LBD2拟糖蛋白, 为开展甘露糖受体介导的抗原提呈及肿瘤疫苗的实验研究打下了基础.
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优势化Ⅱ型T淋巴细胞表达杀伤细胞抑制性受体的初步观察
Th2和Tc2细胞被称为优势化Ⅱ型T淋巴细胞, 在免疫反应过程中具有下调Ⅰ型T淋巴细胞(Th1和Tc1)的作用, 可能参与免疫耐受过程[1,2].本实验中, 我们对全T淋巴细胞进行训导, 获得低同种反应性的Ⅱ型T淋巴细胞, 旨在探讨杀伤细胞抑制受体在该类细胞的表达, 为免疫耐受的相关研究提供新的思路.
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通痹灵总碱对T细胞内Th1型细胞因子表达的影响
目的:研究通痹灵总碱(TBL)对T细胞中Th1型细胞因子表达的影响, 并揭示其抗炎机制, 为临床用药提供理论依据.方法:分离小鼠肠系膜淋巴结细胞, 加入不同浓度的TBL作用1 h, 再加多克隆刺激剂佛波醇酯(PDB)和离子酶素, 继续培养4 h收获细胞, 进行双色荧光素标记, 以流式细胞术对Th1型细胞因子INF-γ和TNF-α的表达进行分析.结果:200 mg/L 和100 mg/L的TBL, 能显著抑制T细胞内INF-γ和TNF-α的表达.结论:TBL可抑制Th1型炎症性细胞因子的表达, 可能是其治疗类风湿关节炎的免疫药理机制之一.
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鳖血提取物对小鼠免疫功能正向调节作用的研究
目的:研究鳖血提取物对小鼠的免疫调节功能.方法:采用环磷酰胺为免疫抑制剂, 获得免疫功能低下的小鼠动物模型.比较鳖血提取物作用前后, 小鼠T细胞亚群的数量、NK细胞的杀伤功能, 淋巴细胞的增殖功能以及细胞因子水平的变化. 结果:鳖血提取物对免疫功能低下小鼠的CD4+ T细胞在外周血中的比例、NK细胞的杀伤活性、淋巴细胞的增殖功能, 均具有正向调节作用(P<0.05), 并呈剂量依赖性; 能提高淋巴细胞分泌IFN-γ的能力.结论:鳖血提取物具有正向调节小鼠免疫功能的能力.
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采用简并引物克隆葎草花粉过敏原全长同源cDNA
目的:建立一套稳定可靠的方法, 对过敏原性物种中的过敏原同源基因进行快速克隆.方法:在分析生物信息数据库中积累的大量过敏原序列同源性的基础上, 设计简并引物, 基于高质量葎草花粉RNA, 逆转录合成cDNA.采用Touchdown方式在cDNA池中进行选择性PCR扩增.同时借助梯度PCR程序, 对引物扩增的简并性作进一步强化, 并结合RACE技术获取全长cDNA, 进而对葎草花粉中的过敏原同源基因进行克隆.结果:成功地获得3个全长cDNA克隆.序列分析显示, 这些基因与已知过敏原的基因序列相似性高达79%～85%, 初步认定其为泛过敏原肌球蛋白抑制蛋白(profilin)的同源基因.对比RACE技术获得的相应基因的全长序列发现, 这些序列在引物结合处与简并引物序列之间存在4个碱基的差异, 提示采用Touchdown方式的梯度PCR程序, 可使引物的简并性得到进一步扩展.结论:简并引物与Touchdown梯度PCR相结合的方法, 能够对以葎草为代表的基因组未曾深入研究的物种中的过敏原同源基因进行有效克隆.
| 年 | 期数 |
| 2018 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2017 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2016 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2015 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2014 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2013 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2012 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2011 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2010 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2009 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2008 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2007 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2006 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2005 | 01 02 03 04 05 06 z1 |
| 2004 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2003 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2002 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2001 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2000 | 01 02 03 04 05 06 |
| 1999 | 01 02 |
| 1995 | 01 02 03 |
| 1994 | 01 02 |
| 1993 | 01 02 03 04 |
| 1992 | 01 02 03 04 |
| 1991 | 01 02 03 04 |
| 1990 | 01 02 |
| 1989 | 01 02 03 04 |
