细胞与分子免疫学杂志
Chinese Journal of Cellular and Molecular Immunology 세포여분자면역학잡지
- 主管单位: 中国免疫学会;第四军医大学
- 主办单位: 陕西省免疫学会,中国免疫学会
- 影响因子: 0.81
- 审稿时间: 1-3个月
- 国际刊号: 1007-8738
- 国内刊号: 61-1304/R
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
-
人整合素β3亚基真核表达载体的构建及αIIbβ3在细胞表面的表达
目的: 构建人整合素β3亚基真核表达载体,并探讨如何使人整合素αIIbβ3在CHO细胞表面有效表达,为进一步研究整合素β3亚基作为汉坦病毒(hantavirus, HV)受体的特异性奠定基础. 方法: 构建编码人整合素β3真核表达载体pcDNA3.1-β3.将其与编码人整合素αIIb亚基真核表达载体, 分别及共转染至中国仓鼠卵巢(China hamster ovary, CHO)细胞中进行表达.采用间接免疫荧光法(IFA)检测外源基因的表达. 结果: 共转染组目的蛋白呈高效的细胞膜表达.pcDNA3.1-β3单独转染组β3亚基在细胞膜的表达较共转染组弱; 而pBJ1-αIIb单独转染组则未见有效的细胞膜表达. 结论: 人整合素αIIbβ3在CHO细胞表面的有效表达需要两个亚基共同参与.
-
p27KIP1-绿色荧光蛋白融合基因在HCC-9204细胞中的瞬时表达
目的: 观察p27KIP1-绿色荧光蛋白(GFP)融合蛋白在肝癌细胞系HCC-9204中的表达及定位. 方法: 根据p27KIP1基因的编码顺序, 应用PCR技术将p27KIP1基因3′末端终止密码TAA突变为TGT, 并通过基因重组技术将其与GFP基因融合.再采用脂质体转染法, 将p27KIP1-GFP融合基因转入HCC-9204细胞中, 用荧光显微镜观察其表达情况. 结果: DNA序列测定的结果显示, p27KIP1 基因与基因库中已收录的p27KIP1 的序列相比较, 仅有1个核苷酸的差异.荧光显微镜显示, 在转染GFP基因的HCC-9204/GFP 细胞中, 荧光均匀地分布于整个细胞; 而在转染融合基因p27KIP1-GFP 的HCC-9204/GFP-p27细胞中, 绿色荧光主要见于核内. 结论: 转染的HCC-9204细胞能高效表达融合基因p27KIP1-GFP, 且定位于细胞核内, 与p27KIP1 基因的表达方式相同.
-
人视网膜前膜组织及培养的人RPE细胞上C5a受体的表达
目的: 检测手术中取出的增生性玻璃体视网膜( PVR )病变患者的视网膜前膜( ERM )组织及培养的人视网膜色素上皮细胞( RPE )中的C5a受体(C5aR)的表达及分布, 阐明C5a受体在发生PVR的病理过程中可能的作用.方法: 手术取出ERM组织, 常规制备石腊切片.另取新鲜人眼球, 常规分离、培养人RPE细胞.以小鼠抗人C5aR单克隆抗体作为检测抗体, 对PVR患者的ERM组织及培养的人RPE细胞做细胞免疫化学ABC染色, 检测C5aR的表达.结果: PVR患者的ERM组织及培养的人RPE细胞上均有C5aR的表达.结论: C5a作为一种前炎性因子, 与RPE细胞上的C5aR结合后, 可能介导PVR的发生, 即PVR的发生可能与C5a有关.
-
C3d-P28增强乙肝病毒基因免疫诱导的特异性细胞免疫应答
目的: 研究补体C3d中P28分子对HBV基因免疫诱导的细胞免疫应答的调节作用, 为增强基因疫苗细胞免疫的效果寻求新方法.方法: 分别分离获取C3d-P28和HBV-preS2/S编码基因, 并克隆入真核表达载体pVAON33中, 构建相应重组质粒pVAON33-S2/S(仅含HBV-preS2/S编码基因)和pVAON33-S2/S-P28.4(含HBV-preS2/S和4拷贝C3d-P28的编码基因), 并以PCR、酶切和DNA序列测定进行鉴定. 以肌肉注射法对BALB/c小鼠实施3次基因免疫(100 μg/100 μL*只), 间隔3 wk, 并以空质粒免疫小鼠作为对照.免疫小鼠脾细胞体外经HBsAg刺激后, 用3H-TdR掺入法和同位素释放法, 分别检测特异性淋巴细胞增殖和CTL杀伤活性.结果: pVAON33-S2/S和pVAON33-S2/S-P28.4免疫小鼠的脾细胞, 均显示较强的特异性增殖活性和CTL杀伤活性, 但后者显著强于前者(P<0.05). 结论: C3d-P28可增强HBV-preS2/S基因免疫诱导的特异性细胞免疫应答.
-
CVB3-VP1基因免疫诱导特异性抗病毒免疫应答及保护作用
目的: 构建表达柯萨奇病毒B3(CVB3)主要包膜蛋白VP1的基因疫苗, 并研究该疫苗诱导CVB3特异性免疫应答及免疫保护的作用.方法: 抽提CVB3 RNA, 以RT-PCR扩增VP1基因, 克隆于真核表达载体pcDNA3中, 构建质粒pcDNA3-VP1.将该质粒转染Hela细胞, 观察其表达情况; 以50 μg pcDNA3-VP1质粒DNA肌注免疫BALB/c小鼠3次, 检测CVB3特异性体液和细胞免疫应答.间隔4 wk以5×LD50的CVB3攻击小鼠, 观察攻击后小鼠的存活情况.结果: 构建了重组质粒pcDNA3-VP1, 并在体外获得有效表达.以该质粒肌肉免疫BALB/c小鼠, 可诱生高水平的IgM和IgG, VP1多肽特异性淋巴细胞增殖反应及CTL活性均显著高于pcDNA3免疫的对照组.病毒攻击试验表明, pcDNA3-VP1免疫组33.3%小鼠可长期存活, 其心肌组织未见明显的病理学改变; 而对照小鼠平均仅存活6.7 d, 心肌显示大量的局灶性坏死和炎性细胞浸润.结论: pcDNA3-VP1免疫可诱生CVB3特异性体液及细胞免疫应答, 保护免疫小鼠抵抗CVB3的致死性攻击.
-
VEGF真核表达载体的构建及在内皮与心肌细胞内的表达
目的: 探讨外源性人VEGF165基因在内皮细胞与心肌细胞内表达的可行性.方法: 构建了(vascular endothelium growth factor, VEGF)与增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)基因共表达载体pIRES2-EGFP-VEGF165, 以脂质体法转染内皮细胞和心肌细胞, 采用荧光显微镜检测内皮细胞与心肌细胞中EGFP的表达, 同时利用免疫组织化学方法检测VEGF的表达.结果: 成功地构建了真核表达载体pIRES2-EGFP-hVEGF165, 采用脂质体法转染内皮细胞与心肌细胞后, 经荧光显微镜观察, 可见细胞内有EGFP的表达, 同时经免疫组化证实有VEGF的表达.结论: 采用脂质体法可以成功地将外源性VEGF165基因转染到内皮细胞与心肌细胞中, 并进行表达. 本研究为今后利用VEGF基因治疗心肌缺血等疾病提供了实验基础.
-
GPI-CTLA4Ig嵌合分子的构建和在CHO-dhfr-细胞膜上的表达
目的: 研制GPI锚定修饰的新型免疫抑制分子GPI-CTLA4Ig.方法: 通过将从促衰变因子(DAF)来源的GPI修饰性信号序列与CTLA4Ig嵌合, 获得GPI修饰的CTLA4Ig分子.将编码GPI-CTLA4Ig嵌合分子的基因克隆到真核表达载体pCI-dhfr中, 并用脂质体法转染CHO-dhfr-细胞, 用氨甲喋呤(MTX)进行筛选.重组蛋白的表达用RT-PCR、 ELISA、细胞免疫荧光和Western blot进行鉴定.后采用Protein A亲和层析纯化.结果: 构建了GPI-CTLA4Ig嵌合分子, 并在CHO-dhfr-细胞膜上稳定表达.结论: GPI修饰的CTLA4Ig分子有可能作为新型的免疫抑制剂用于器官移植中, 抑制移植排斥反应.
-
人KIR2DL1-Ig融合蛋白在COS-7细胞的表达
目的: 获得人KIR2DL1分子(killer Ig-like receptor 2DL1)胞外区与人IgG Fc段的融合蛋白.方法: 从人外周血单个核细胞中提取总RNA, 通过RT-PCR扩增编码KIR2DL1胞外段cDNA, 经Nhe Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切后, 定向插入真核细胞表达载体CD5lnegl中.构建的重组真核表达载体CD5lnegl-KIR2DL1.经酶切分析和测序鉴定后, 通过DEAE-dextran/chloroquine法转染COS-7细胞.瞬时表达后, 取培养上清液经亲和层析、ELISA、SDS-PAGE及Western印迹,鉴定融合蛋白的表达及其免疫学活性.结果: 序列测定证实, 该重组表达载体含有正确的KIR2DL1胞外区基因序列.重组真核表达载体CD5lnegl-KIR2DL1转染COS-7细胞后, ELISA法检测细胞培养上清中有融合蛋白的表达.SDS-PAGE结果显示, 该融合蛋白的相对分子质量(Mr)约为73 000.Western印迹结果证实, 该蛋白能被特异性单克隆抗体(mAb)EB6所识别.结论: KIR2DL1-Ig融合蛋白表达载体成功构建并在COS-7细胞中获得功能性表达, 为KIR2DL1的功能及其配体MHC的研究奠定了基础.
-
脑啡肽和多巴胺在大鼠实验性脑震荡脑组织中的表达及意义
目的: 探讨大鼠实验性脑震荡脑组织中脑啡肽和多巴胺的表达及其意义.方法: 采用Wistar雄性二级大鼠复制脑震荡动物模型, 于伤后1、3、7、14及30 d活杀.取脑组织, 经免疫组化染色等技术, 研究脑震荡发生发展中脑啡肽和多巴胺的变化规律.结果: 体质量100 g大鼠组出现典型的脑震荡临床表现, 其病理改变为脑血管收缩与扩张、脑组织淤血与水肿、神经元变性、凋亡与坏死.脑啡肽于伤后1 d表达增强, 阳性部位见于大脑、小脑和海马区的血管内皮细胞胞质中; 于伤后7 d达高峰, 阳性部位仍见于大脑皮层、海马区和小脑神经元中.14 d后表达逐渐减少, 30 d仍高于正常水平.多巴胺于伤后7 d, 在大脑、海马区、丘脑及小脑各部分血管内皮细胞、血管壁的表达明显增多, 但各时间点无明显变化.结论: 脑震荡后可出现以血液循环障碍和实质细胞变性和坏死为主的病理改变.脑啡肽和多巴胺参与了脑震荡发生时脑损伤的病理生理过程, 可能对脑血管损伤、血脑屏障功能和神经细胞变性、坏死起重要的调节作用.
-
汉滩病毒囊膜糖蛋白G2与核蛋白氨基端在昆虫细胞中的融合表达
目的: 在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中, 融合表达汉滩病毒的囊膜糖蛋白G2与核蛋白氨基端. 方法: 构建含有汉滩病毒G2S0.7嵌合基因的表达载体pFBDHTa-G2S0.7, 并转化DH10Bac感受态菌.利用其含有的细菌Tn7转座系统, 将嵌合基因重组至杆状病毒穿梭质粒bacmid中, 并筛选含有G2S0.7嵌合基因的重组杆状病毒, 在昆虫细胞中表达该融合蛋白.对表达产物用间接免疫荧光、ELISA和免疫印迹进行检测. 结果: 构建了的含G2S0.7嵌合基因的重组杆状病毒, 感染昆虫细胞后, 可表达相应大小的融合蛋白.该蛋白可被抗汉滩病毒核蛋白及糖蛋白G2的特异性单克隆抗体(mAb)所识别. 结论: 利用杆状病毒表达系统, 成功地表达同时具有核蛋白及糖蛋白G2生物学活性的融合蛋白G2S0.7, 为进一步研究其免疫学特性奠定了基础.
-
pcDNA3.1/hIL-18真核表达载体的构建及表达
目的: 构建重组真核表达质粒pcDNA3.1/IL-18, 并在哺乳动物细胞COS-7和Rlc310中进行瞬时和稳定性表达.方法: 从含hIL-18基因的中介载体pGEM-T Easy(pGEM-T/hIL-18)中, 以限制性内切酶酶切方法获得目的片段, 克隆入真核表达质粒pcDNA3.1(+)中.以脂质体法转染COS-7和Rlc310细胞, 用RT-PCR检测IL-18 mRNA的水平, 免疫组化染色法检测蛋白表达.结果: 构建了hIL-18基因的重组真核表达质粒pcDNA3.1/IL-18, 并可在哺乳动物细胞中瞬时、稳定表达, 获得了可稳定表达hIL-18基因的Rlc310细胞株.结论: pcDNA3.1/IL-18的构建及表达, 为IL-18抗肿瘤作用的研究奠定了基础.
-
人重构型caspase-6基因在Hela细胞中的诱导表达
目的: 将重构型caspase-6分子(RCasp-6)克隆入可诱导真核表达载体pIND中, 经蜕皮激素类似物诱导探讨其对细胞凋亡的促进作用.方法: 用PCR扩增RCasp-6基因, 并克隆入真核表达载体pIND中.以重组体转染Hela细胞系, 蜕皮激素类似物诱导. RCasp-6基因的表达产物采用免疫细胞化学染色检测.HE染色观察转染细胞的形态变化, 并计数细胞绘制生存曲线.结果: 成功地构建了RCasp-6基因的可诱导真核表达载体.转染的细胞经蜕皮激素诱导后, 细胞形态异常.转染了RCasp-6基因的细胞固缩同时很多细胞死亡.结论: RCasp-6基因具有促进细胞死亡的作用.
-
多黏菌素B对内毒素诱导的肺泡巨噬细胞中NF-κB活化的影响
目的: 观察多黏菌素B(PMB)对内毒素(LPS)刺激大鼠肺泡巨噬细胞(PAM)中核因子-κB(NF-κB)激活通路的影响, 并探讨PMB可能的抗炎效应.方法: 分离、培养大鼠PAM, 分为正常对照组、LPS刺激组及PMB+LPS干预组.各组PAM在刺激后0、15、30、60、120和240 min分别固定, 提取PAM核蛋白并收集细胞培养上清, 采用原位杂交(ISN)技术、凝胶电泳迁移率改变(EMSA)及ELISA法, 观察PAM中IKK-β mRNA及IκB-α的表达, 检测PMB核蛋白提取物中NF-κB的活性和上清液中TNF-α的含量.结果: LPS刺激组IKK-β mRNA的水平, 显著高于刺激前和正常对照组(P<0.01); IκB-α的水平的变化趋势与IKK-β mRNA刚好相反.NF-κB活性的峰值相对于刺激前和正常对照组有显著升高(P<0.01).培养上清中TNF-α的含量,亦显著高于刺激前和正常对照组(P<0.01). PMB干预组NF-κB的活性与TNF-α的含量虽较刺激前和正常对照组升高, 但均显著低于LPS刺激组(P<0.01). IκB-α水平的低值显著高于LPS刺激组(P<0.01); 而IKK-β mRNA的峰值则显著低于LPS刺激组(P<0.01).结论: LPS能诱导PAM中的IKK-β激活、IκB-α降解和NF-κB活化, 并促进TNF-α释放.PMB则能抑制LPS诱导的IKK-β激活、IκB-α降解、NF-κB活化和TNF-α释放.
-
逆转录病毒介导乙型肝炎病毒C基因在树突状细胞中的转移
目的: 探讨逆转录病毒介导乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)基因在骨髓来源的树突状细胞(DC)的转移效率, 以及对DC成熟和功能的影响.方法: 用含有HBV C基因的重组逆转录病毒载体, 感染处于分裂期的小鼠骨髓祖细胞, 感染后的骨髓细胞在GM-CSF和IL-4存在的条件下继续培养获得成熟的DC, 用PCR、RT-PCR, 分析目的基因的整合与转录; 用Western blot和流式细胞仪, 分析HBcAg的表达及基因转移效率, 以及检测感染前后DC CD80和MHC-Ⅱ类分子的表达以及分泌IL-12能力的变化; 通过将基因转移后的DC与淋巴细胞进行混合培养,检测其体外诱导CTL的能力.结果: 逆转录病毒感染后并不影响骨髓来源的DC成熟, 对其表面分子CD80和MHC-Ⅱ类分子的表达和分泌IL-12的能力没有影响.目的基因能整合到DC的基因组DNA中, 并能转录和翻译.约28%的DC能表达HBcAg, 感染后的DC体外能诱导T细胞应答.结论: 逆转录病毒能有效地将HBV C基因转移到骨髓来源的DC中, 对DC的成熟和功能无明显影响, 并能诱导CTL应答, 这将有助于开展以DC为基础的慢性乙肝的免疫治疗.
-
胃癌相关抗原表位模拟短肽的筛选
目的: 筛选能模拟胃癌相关抗原表位的功能短肽.方法: 利用离子交换层析, 对抗胃癌相关抗原单克隆抗体(mAb)进行纯化, 并以此mAb为靶标,将其包被于ELISA板上,以噬菌体随机12肽库对其进行3轮亲和筛选.结果: 从噬菌体随机12肽库中, 筛选到12个噬菌体阳性克隆.结论: 获得了具有模拟胃癌相关抗原表位的阳性噬菌体克隆, 且有共同的基序.
-
早孕和足月滋养细胞中侵袭相关性基因的表达变化
目的: 探讨早孕和足月滋养细胞侵袭能力差异的机制.方法: 分离并在体外培养早孕和足月的滋养细胞为, 采用RT-PCR法, 检测其侵袭相关性基因的表达.结果: 早孕滋养细胞表达MMP-2、MMP-9、TIMP-1和UPA; 而晚孕滋养细胞表达MMP-2、TIMP-1、TIMP-2和PAI.晚孕滋养细胞TIMP-1的表达显著高于早孕滋养细胞, 而MMP-2的表达则无明显变化.结论: MMP-9等蛋白酶及其抑制因子表达的变化, 可能是影响滋养细胞侵袭性的重要原因.
-
鼻咽喉部淋巴瘤免疫表型与发病部位的关系
鼻咽喉部淋巴组织丰富, 是淋巴瘤的好发部位, 非何杰金氏淋巴瘤(NHL)在此部位的淋巴瘤中占绝对优势.根据WHO关于淋巴瘤新的分类方案, NHL可分为B细胞淋巴瘤和T/NK细胞淋巴瘤两大类, 每一大类进一步又分为不同的型, 不同的免疫表型具有不同的临床病理和预后特征.鉴于我国淋巴瘤的类型及部位分布与西方国家存在一定差异[1], 特别是对NK细胞淋巴瘤的研究资料尚较缺乏, 因此, 探讨鼻咽喉部淋巴瘤的免疫表型与病变部位间的关系, 对于积累我国淋巴瘤的原始研究资料具有重要意义.本研究中, 我们检测西京医院病理科近3年的鼻咽喉部淋巴瘤的免疫表型, 并分析了其与发病部位间的关系.
-
丙型肝炎患者血清HSP70水平的检测及HSP70-HCV肽诱导CTL作用
目的: 检测丙型肝炎患者及正常人血清中HSP70的水平, 探讨HSP70-HCV肽体外诱导特异性CTL的作用.方法: 先用ELISA法筛选出丙型肝炎患者及正常人血清, 再用双夹心ELISA法检测血清HSP70, 并分析抗HCV抗体和HSP70之间的关系.用HSP70-HCV肽激活外周血单个核细胞后, 通过51Cr释放试验测定CTL的杀伤活性. 结果: 76份血清(抗HCV抗体阳性28例, 正常人血清48例)中, 抗HCV抗体阳性患者HSP70的检出率为82.1%, 正常人血清中HSP70的检出率为18.8%.HSP70的检出率与HCV感染呈显著相关(χ2=28.77, P<0.01).HCV感染者血清HSP70的含量显著高于正常人.HSP70与HCV C区肽(DLMGYIPAV)的混合物, 可诱导1例患者的CTL对自体HCV肽致敏靶细胞的杀伤率达37.8%, 而用HCV肽单独作用则不显著.结论: HCV感染可刺激机体过表达HSP70, 同时HSP70可能有增强HCV表位肽递呈促进CTL特异性杀伤HCV感染细胞的作用.
-
抗NKG2D多克隆抗体抑制NK和LAK细胞细胞毒效应的研究
目的: 分析抗NKG2D多克隆抗体(pAb)对NK和LAK细胞毒作用的影响.方法: 应用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC), 经10 mg/L PHA和1×106 U/L rhIL-2诱导LAK细胞产生, 再应用流式细胞术(FCM)分选NK细胞并进行表型检测.加入抗NKG2D pAb封闭NK和LAK细胞表面的NKG2D 分子后, 用MTT比色法检测其细胞毒效应.结果: 经FCM分析证实, 获得高纯度、高活性的NK细胞.抗NKG2D pAb能显著抑制NK和LAK细胞对K562、HepG2细胞的细胞毒效应. NK细胞对两种靶细胞的细胞毒效应分别下降了82.9%和75.6%; LAK细胞对两种靶细胞的细胞毒效应分别下降了52.8%和50.2%.但抗NKG2D pAb不能显著抑制两种效应细胞对人鼻咽癌细胞系CNE的细胞毒效应.结论: 抗NKG2D pAb可通过封闭NK和LAK细胞表面的NKG2D分子, 抑制其对肿瘤细胞的细胞毒效应.
-
抗单纯疱疹病毒单克隆抗体CHA9靶基因的定位
目的: 获得单纯疱疹病毒(HSV)新糖蛋白g30K的部分特征氨基酸信息, 以期对该蛋白基因的准确定位有所帮助.方法:将针对HSV新糖蛋白g30K的单克隆抗体(mAb) CHA9生物素化后, 淘筛噬菌体随机12肽库, 经3轮筛选后进行ELISA检测.随机挑取10个阳性克隆进行DNA测序, 并进行序列比较以得到保守序列, 然后对其疏水性进行预测. 结果: 得到的保守氨基酸序列(motif)为-PH/KHXHXGS-.携有此短肽的噬菌体可与CHA9特异结合而不与其它IgG出现交叉反应.疏水性分析证明其可能构成一个表位.结论: 筛选到一段具有含mAb CHA9 靶抗原-HSV新糖蛋白g30K部分氨基酸特征的短肽, 为新基因的预测提供了参考依据, 对进一步分析这一新糖蛋白的生物学功能也具有重要意义.
-
用体外致敏的鼻咽癌患者B细胞构建噬菌体抗独特型抗体库
目的: 构建噬菌体人源抗独特型抗体库.方法: 体外致敏并用EBV转化鼻咽癌患者的PBMC.用PCR分别扩增VH和VL基因并组成ScFv基因.将ScFv基因与载体连接后, 转化大肠杆菌MC1061, 构建噬菌体呈现型ScFv库.结果: 经EBV转化的10例鼻咽癌患者的PBMC中, 8例有鼻咽癌抗独特型抗体产生.经多次PCR, 扩增出5种VH(γ、μ)和7种VL(κ、λ)基因, 经连接组成14种ScFv基因.将ScFv基因与载体连接后, 导入大肠杆菌MC1061.经四环素抗性筛选, 得到库容为1.1×107的初级噬菌体抗独特型抗体库, 噬菌体DNA中全长ScFv基因的插入率为70%.结论: 用体外致敏法结合噬菌体抗体库技术, 制备人源抗独特型单链抗体(Ab2β ScFv)的策略是可行的.
-
利用DNA免疫法制备植物选择标记基因hpt表达蛋白抗体的研究
目的: 制备转基因作物中选择标记基因潮霉素B磷酸转移酶(hygromycin B phosphotransferase, hpt)基因表达产物的多克隆抗体, 并探讨影响核酸免疫效果的因素及相应机制.方法: 以hpt的cDNA全长插入真核表达载体pCDNA3中, 并经限制性内切酶酶切及DNA测序鉴定. 以纯化的重组质粒pCDNA3-HPT免疫BALB/c小鼠.用在E.coli中表达并纯化的(His)6-HPT进行ELISA, 检测免疫过程中小鼠血清抗体效价的增长状况, 并用Western blot检测抗血清的特异性.结果: 经3次核酸免疫后, 小鼠血清中未发现明显的抗HPT抗体.第4次加强免疫时, 将小鼠分为3组, 每组两只.第1组改用去内毒素的质粒提取试剂盒提纯的重组质粒免疫, 第2组用 (His)6-HPT融合蛋白免疫, 第3组仍用原来提取的重组质粒免疫.结果发现, 第1组小鼠抗血清的效价有所上升, 经ELISA检测达1∶200; 第2组抗血清的滴度显著升高, 达到1∶2 000; 而第3组小鼠血清中仍未检测到明显的抗体.Western blot证实, 前两组抗血清均可与亲和层析纯化的GST-HPT、(His)6-HPT融合蛋白及其诱导表达的相应菌体总蛋白发生特异性结合.结论: 用DNA免疫法成功地制备了抗hpt基因表达产物的特异性抗体, 但抗体效价不够理想.推测与hpt基因本身的性质及其在体内表达呈现的水平有关,可望通过调整影响核酸免疫的其他多种因素提高抗体的水平.
-
抗血小板单克隆抗体片段的抗栓效应研究
目的: 研究抗血小板膜糖蛋白IIIa(GPIIIa)单克隆抗体(mAb)SZ-21F(ab′)2片段的抗血栓效应.方法: 用木瓜蛋白酶在偏酸条件下(pH5.5)消化20 h, 经DEAE-52 NaCl梯度洗脱消化产物, 以得到F(ab′)2片段.收集产物经SDS-PAGE鉴定, 并通过ELISA和血小板聚集抑制试验, 观察所获F(ab′)2片段免疫原活性和抗栓活性.结果: 该法制备F(ab′)2片段的得率为60.32%; 酶免法测定其效价为0.8 ×10-9 mol/L; 体外血小板聚集抑制半数有效剂量(ED50)为3.395 mg/L.F(ab′)2片段与血小板的结合性及对血小板聚集功能的抑制效果均高于完整的IgG.结论: 利用木瓜蛋白酶制备的抗血小板mAb SZ-21的F(ab′)2片段, 产率高且其抗栓活性与免疫原活性均优于完整的mAb IgG, 为mAb SZ-21用于临床抗血栓治疗展现了良好的前景.
-
抗人肿瘤坏死因子α嵌合抗体的研制
目的: 研制抗人肿瘤坏死因子(rTNF-α)嵌合抗体.方法: 以具有中和TNF-α活性的鼠源性单抗(Z12)的轻、重链可变区基因, 构建人-鼠嵌合抗体基因的表达载体, 并转染COS7细胞. 用RT-PCR、ELISA、免疫印迹及体外中和rTNF-α活性实验, 分别对瞬时表达的抗rTNF-α嵌合抗体(CZ12)的细胞培养上清进行检测.结果: ①瞬时转染后, 细胞系经RT-PCR检测有人-鼠嵌合抗体mRNA的转录.②ELISA和Western blot检测表明, CZ12与TNF-α产生特异性反应, 并识别相对分子质量(Mr)为17 000的TNF-α.③竞争抑制实验中, CZ12能竞争抑制Z12与rTNF-α的特异性结合, ④体外中和实验证实, CZ12能中和TNF-α对L929细胞的毒性.结论: 成功地研制具有中和活性的人-鼠嵌合抗体CZ12.
-
具有乙酰胆碱酯酶催化活性的抗体酶的研究
目的: 研制具有乙酰胆碱酯酶 (AchE) 活性的抗独特型抗体.方法: AchE mAb是一种IgG1抗体, 先用木瓜蛋白酶酶切, 然后采用AchE-Sepharose-4B和SPA亲和层析柱进行提取纯化, 获得纯化的mAb Fab段.以Fab作为抗原免疫小鼠, 制备抗Fab片段的独特型抗体(AId Ab).结果: 酶催化ELISA法检测证明, 抗mAb 3F3片段的AId Ab具有AchE活性.结论: 成功地制备了一株具有AchE活性的AId Ab,为农药中毒的治疗开辟了新的途经.
-
Th1型细胞因子基因对结核分枝杆菌基因疫苗诱导BALB/c小鼠产生抗CFP10抗体水平的影响
目的: 研究分别表达含IL-12和IL-18基因的质粒, 对结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)H37Rv株CFP10基因疫苗诱导免疫应答的影响.方法: 从正常人外周血单个核细胞(PMBCs)中提取RNA, 用RT-PCR扩增IL-18 cDNA, 并克隆入载体pGEM-Teasy中.测序证实后, 亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1的BamH I和EcoR I酶切位点.将分别表达小鼠IL-12和人IL-18基因的真核表达质粒pcmIL12和pcIL18,与MTB CFP10基因疫苗联合肌注免疫BALB/c小鼠, 共免疫3次, 每次间隔2 wk.每次免疫后2 wk采血、分离血清, 用ELISA检测小鼠血清抗CFP10抗体的滴度. 结果: 用RT-PCR成功地从人PMBC的RNA中扩增出IL-18 cDNA, 测序结果正确.用BamH I和EcoR I酶切鉴定证实, 目的基因已插入载体pcDNA3.1中, 阳性克隆命名为pcIL18.pcCFP10组第1次免疫后, 血清抗CFP10抗体的平均滴度为1∶600, 末次免疫后的滴度为1∶4 000.pcIL18+pcCFP10组联合免疫后, 血清抗CFP10抗体的滴度高于pcCFP10组, 终达1∶8 000.而pcmIL12+pcCFP10组联合免疫后滴度仅为1∶200.结论: pcIL18与CFP10基因疫苗联合免疫, 可增强CFP10抗原的特异性体液免疫应答; pcmIL12则可使CFP10基因疫苗产生的抗体水平降低.pcIL18+pcCFP10基因联合免疫是否具有增强CFP10抗原特异性细胞免疫的作用有待进一步研究.
-
抗酪氨酸酶相关蛋白-1B细胞表位区多克隆抗体的制备及鉴定
目的: 制备多克隆抗体并初步用于TRP-1抗原表位区的研究, 为白癜风、恶性黑素瘤的免疫治疗提供实验依据.方法: 在大肠杆菌中表达PRSETA/TRP-1融合蛋白, 用所获得的蛋白免疫新西兰白兔得到多克隆抗体, 并用ELISA、Western-blot方法进行此抗体的鉴定.结果: ①表达了PRSETA/TRP-1融合蛋白; ②制备了抗TRP-1 B细胞表位区的多克隆抗体; ③并用多克隆抗体检测了毕赤酵母表达的6His-TRP1蛋白, 证实此抗体效价高、特异性强.结论: 此抗体可用于TRP-1 B细胞表位肽段的进一步研究.
-
抗性病性淋巴肉芽肿衣原体单克隆抗体的制备及初步应用
性病性淋巴肉芽肿衣原体(chlamydia lymphogranulorna venereum, CLGV)是沙眼衣原体的3个生物变种之一, 人是其自然宿主, 主要通过性关系在人群中传播.对男性主要侵犯腹股沟淋巴结, 引起化脓性淋巴结炎和慢性淋巴肉芽肿; 对女性主要引起会阴-肛门-直肠组织狭窄.目前, 主要检测方法是抽取化脓性腹股沟淋巴结的脓液, 涂片检查衣原体及包涵体, 或分离培养衣原体[1].我们试图制备抗CLGV的特异性单克隆抗体(mAb), 并进而建立其ELISA快速检测方法.
-
大鼠肝贮脂细胞的分离、培养和鉴定
肝脏星形细胞(hepatic stellate cell, HSC), 又称贮脂细胞(fat-storing cell, FSC)、Ito细胞、窦周脂肪细胞、储存维生素A细胞及肝脏特异性周皮细胞(liver-specific pericyte)等, 是肝脏的一种非实质细胞.它是肝脏中兼具肌细胞、成纤维细胞及脂肪细胞特征的间质细胞[1].目前一致认为, 激活的HSC为肝纤维化时产生各种细胞外基质(ECM)成分的主要细胞群[2], 此外, 激活的HSC还可能在门静脉高压的形成中发挥重要作用[3,4].由于它在肝纤维化发生、发展中的独特作用, 贮脂细胞已成为肝纤维化细胞学研究的热点[5].建立稳定、经济、便捷的分离和培养HSC的方法, 已成为肝纤维化机制研究的重大课题之一.本实验室根据 Friedman等报道的方法, 采用更为经济的材料作为不连续密度梯度形成物, 成功地分离获得大鼠贮脂细胞.
-
P38信号通路在人脐静脉内皮细胞表达P-选择素中的作用
目的: 研究P38信号通路(P38 mitogen-activated protein kinase, P38MAPK)在人脐静脉内皮细胞表达P-选择素以及糖尿病动脉粥样硬化中的作用.方法: 分别以高葡萄糖、糖基化终产物(AGE)、高胰岛素和过氧化氢刺激人脐静脉内皮细胞系ECV-304, 再以P38MAPK特异性抑制剂SB203580预处理, 观察ECV-304细胞系中磷酸化P38MAPK和P-选择素的表达.结果: 4种刺激因素均可单独激活P38MAPK, 使磷酸化P38MAPK表达量明显增加, P-选择素表达量也明显增加; 以SB203580预处理后, P-选择素的表达被明显抑制.结论: P38MAPK是P-选择素的上游信号分子, 也可能是动脉粥样硬化发生的始动信号之一.
-
CKLF基因与CKLFSF1基因间的顺式调控元件
目的: 探讨CKLF基因与CKLFSF1基因间序列(CCS)的调控作用. 方法: 运用PCR技术扩增CCS, 并将此片段插入含有荧光素酶 (luciferase)报告基因载体pGL3-basic, 以及pGL3-SV40 启动子中, 构建受其调控的荧光素酶报告基因载体.应用脂质体介导基因转染技术, 将4种重组质粒转染Hela细胞, 进行瞬时表达分析.结果: 在pGL3-basic和pGL3-basic-CCS质粒中的报告基因luciferase均无表达, 但将CCS片段插入至promoter上游后, 荧光素酶活性增加近1倍. 结论: CKLF与CKLFSF1基因间的序列不具有启动子活性, 但该序列中却可能存在调控其下游基因表达的顺式增强子元件.
-
抗CD43单克隆抗体对B细胞增殖及抗体分泌的影响
目的: 研究抗CD43 mAb (DFT1)对B细胞增殖及其抗体分泌的影响. 方法: 细胞培养, 3H-TdR掺入法测定不同时间抗CD43 mAb对B细胞增殖的影响, ELISA测定其对PWM诱导系统内抗体分泌的水平.结果: 单独加入抗CD43 mAb对B细胞增殖无影响, 但在TPA诱导系统内加入抗CD43 mAb, 培养72 h可见显著增殖反应, 为单独加入TPA引起增殖反应的3 倍.在培养开始加入抗CD43 mAb可引起显著的增殖反应, 而延迟加入抗CD43 mAb对B细胞增殖的影响不显著.抗CD43 mAb对PWM诱导系统内B细胞的抗体分泌不产生影响.结论: 抗CD43抗体可引起TPA诱导系统内B细胞的显著增殖.而PWM诱导系统内B细胞抗体的分泌无影响.
-
含3C蛋白酶切位点的人CD226胞膜外区Ig融合蛋白的真核表达及应用
目的: 构建含3C蛋白酶酶切位点的人CD226(PTA1)分子胞膜外区Ig融合蛋白编码基因的真核表达载体,并进行表达和初步鉴定. 方法: 将人CD226分子的胞膜外区基因, 克隆入含3C蛋白酶靶序列的Ig真核表达载体p-3C-Ig中.测序证实后, 转染COS7细胞并进行瞬时表达.表达产物经亲和层析柱纯化, 并通过免疫荧光染色及3C蛋白酶酶切反应进行鉴定. 结果: 经表达和纯化获得CD226胞膜外区的Ig融合蛋白. 该融合蛋白可与表达于ECV304细胞表面的CD226配体有效结合.同时, 融合蛋白的Fc段亦经3C蛋白酶切除, 从而获得CD226胞膜外区的真核表达分子.结论: 成功地获得了含有3C蛋白酶酶切位点的人CD226分子胞膜外区Ig真核表达产物, 为进一步对CD226分子进行结构和功能研究, 以及X线结晶衍射提供了重要条件.
-
hTrx基因重组逆转录病毒载体的构建及鉴定
目的: 构建携带人Trx(硫氧还蛋白)基因的逆转录病毒载体.方法: 用DNA重组技术, 将人Trx基因定向克隆入逆转录病毒载体pLXSN, 用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ进行酶切鉴定.以磷酸钙转染法, 将重组的逆转录病毒载体转染入包装细胞系PA317, 并用G418筛选的方法测定转染细胞上清中病毒的滴度.结果: 构建了重组逆转录病毒载体, 经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切, 电泳出现两个条带, 分别为0.3 kb和5.9 kb.转染细胞上清中病毒滴度为5.5×109 cfu/L.提示构建携带人Trx基因的逆转录载体成功.结论: 携带人Trx基因的逆转录病毒载体成功构建为Trx基因的治疗、实验研究奠定了基础.
-
日本血吸虫rGST-Sj32蛋白免疫小鼠感染前后细胞因子水平的变化
目的: 为进一步探讨rGST-Sj32保护性免疫机制.方法: 用rGST-Sj32加弗氏完全佐剂(FCA)皮下免疫BALB/c小鼠.于免疫前, 攻击感染前 (第3次免疫后2 wk)以及攻击感染后10 d、30 d及45 d, 各剖杀免疫组与对照组小鼠5只, 取脾细胞培养, 对体外培养的脾细胞诱生的细胞因子进行分析.结果: 用rSj32刺激体外培养的小鼠脾细胞时, 第3次免疫后2 wk(即攻击感染前)剖杀小鼠的脾细胞分泌IL-4、IL-5和IFN-γ的水平与佐剂对照组相比较, 均有不同程度的升高, 分别为(10.21±3.65) ng/L (P>0.05)、(19.89±9.57 ) ng/L (P>0.05)、(5.09±2.51) μg/L (P<0.01).攻击感染后10 d、30 d及45 d, 对照组与免疫组IFN-γ的水平未见升高; 对照组IL-4和IL-5的水平随着感染时间的延长明显升高, 免疫组升高不如对照组明显.结论: rGST-Sj32疫苗免疫BALB/c小鼠后, 可诱导以Th1类细胞因子为主的免疫应答; 而攻击性感染则诱导以Th2型细胞因子为主的免疫应答.
-
GST-GP302融合蛋白在大肠杆菌中的表达及其抗血清的制备
目的: 在大肠杆菌中表达血小板糖蛋白GPIbα之vWF结合区(GP302)与谷胱甘肽S-转移酶GST的融合蛋白并制备其抗血清 . 方法: 将GP302片断插入GST融合表达载体pGEX-4T-1, 重组载体酶切鉴定后, 在大肠杆菌中经IPTG诱导表达获得GST-GP302融合蛋白, SDS-PAGE分析表达产物.包涵体经变性复性后免疫新西兰白兔, 制备抗血清, ELISA、Western blot检测重组抗原的免疫活性.结果: 重组质粒酶切鉴定表明, GP302基因已正确插入到pGEX-4T-1中, 经IPTG诱导后, 表达出相对分子质量(Mr)约为 59 000的融合蛋白, 获得了ELISA效价为1×10-5的多克隆抗体.Western blot证明所制备的多抗可以与血小板糖蛋白特异性结合.结论: GP302片断在大肠杆菌中的成功表达及制备得到的多克隆抗体, 为检测血小板糖蛋白GPIbα及其在其他体系中的表达提供了一种检测途径.
-
一种快捷、定量检测烟曲霉GM抗原双mAb夹心ELISA的方法
目的: 建立一种快速诊断烟曲霉病的双mAb夹心ELISA法.方法: 应用4株抗烟曲霉GM单克隆抗体(mAb), 分别包被和制备HRP-mAb, 用双mAb夹心ELISA法配对试验, 选择捕获及检测mAb.结果: 经筛选得到捕获及检测mAb的佳组合,并建立了双mAb夹心ELISA法. 该法检测GM抗原的灵敏度为0.1 μg/L, 测出范围在0.1~10 μg/L之间. 连续6 d用ELISA法检测同一份样品, 所获CV的平均值为(7.2±3.8)%.结论: 建立了一种可快速、定量检测烟曲霉GM抗原的双mAb夹心ELISA法, 灵敏度高、重复性好, 对研制试剂盒应用于烟曲霉病早期诊断和防治, 具有重要的临床应用价值.
-
同步化处理对熊成纤维细胞周期影响的流式细胞仪分析
在克隆动物研究中,供体细胞的细胞周期状态是影响核移植重构胚胎进一步发育的重要因素.
年 | 期数 |
2018 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
2017 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
2016 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
2015 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
2014 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
2013 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
2012 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
2011 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
2010 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
2009 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
2008 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
2007 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
2006 | 01 02 03 04 05 06 |
2005 | 01 02 03 04 05 06 z1 |
2004 | 01 02 03 04 05 06 |
2003 | 01 02 03 04 05 06 |
2002 | 01 02 03 04 05 06 |
2001 | 01 02 03 04 05 06 |
2000 | 01 02 03 04 05 06 |
1999 | 01 02 |
1995 | 01 02 03 |
1994 | 01 02 |
1993 | 01 02 03 04 |
1992 | 01 02 03 04 |
1991 | 01 02 03 04 |
1990 | 01 02 |
1989 | 01 02 03 04 |