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PAX2稳转细胞系构建及对细胞迁移和侵袭能力的作用研究
目的：探讨PAX2稳转细胞系构建及生物学作用。方法选择处于对数生长期大鼠肾小管上皮细胞，实验分为稳转组、空载组、对照组。稳转组采用阳离子脂质体转导将pEGFP-PAX2转入大鼠肾小管上皮细胞，空载组采用同样方法配置空载质粒转染溶液，对照组不添加质粒转染溶液。经G418筛选，建立稳定转染细胞系。通过细胞划痕实验及Transwell实验检测PAX2稳转细胞系的细胞迁移率及细胞侵袭作用。结果应用G418筛选14 d，稳转组大鼠肾小管上皮细胞有明显克隆长出，建立PAX2基因稳定转染肾小管上皮细胞系。稳转组在荧光显微镜下可见绿色荧光，基因融合表达获得成功。稳转组细胞 PAX2条带密度与β-action 吸光度比值为（1.00±0.04），空载组为（0.83±0.03），对照组为（0.85±0.04），3组吸光度比值比较，差异有统计学意义（ F＝398.7，P﹤0.05）；其中稳转组吸光度比值高于空载组和对照组，差异均有统计学意义（ P﹤0.05）。细胞划痕后18 h，对照组、空载组和稳转组细胞迁移率分别为（39.34±5.34）％、（40.56±7.54）％和（83.72±7.12）％，3组细胞迁移率比较，差异有统计学意义（ F＝431.8，P﹤0.05）；其中稳转组细胞迁移率高于对照组和空载组，差异均有统计学意义（ P﹤0.05）。各组细胞培养48 h后，对照组、空载组和稳转组迁移细胞分别为（23.33±3.63）、（22.00±8.14）、（45.67±7.14），3组迁移细胞数比较，差异有统计学意义（ F＝248.5，P﹤0.05）；其中稳转组迁移细胞数高于对照组和空载组，差异均有统计学意义（P﹤0.05）。结论 pEGFP-PAX2质粒成功转染大鼠肾小管上皮细胞，并成功筛选出高效稳定表达PAX2的稳转细胞系。PAX2稳转增加了肾小管上皮细胞的迁移及侵袭能力。
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PAX2在梗阻性肾病大鼠中重新表达与尿β2-MG关系研究
目的:探讨PAX2基因在梗阻性肾病大鼠重新表达对肾功能的影响.方法:将80只成年雄性大鼠随机分为:假手术组(sham组)40只,模型组40只(单侧输尿管结扎,UUO组).分别于术后3d、5d、7d、14d(每组10只)处死,留取肾组织.光镜观察肾脏病理形态学改变,采用免疫组化检测肾组织PAX2蛋白表达.全自动生化分析仪一次性检测尿β2-MG含量.结果:①HE和Masson染色观察到UUO组出现明显的纤维化表现；②免疫组化结果显示UUO组随着梗阻时间的延长PAX2蛋白表达逐渐增加,UUO组尿β2-MG含量逐渐升高；③相关分析表明:PAX2蛋白表达量与尿β2-MG含量呈正相关(r=0.912,P＜0.05).结论:胚胎发育基因PAX2在梗阻性肾病大鼠重新表达与肾功能密切相关.
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PAX2在单侧输尿管梗阻大鼠肾小管间质纤维化中的作用
目的 通过检测PAX2和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)在单侧输尿管梗阻(UUO)大鼠肾脏组织中的表达,探讨PAX2在肾小管间质纤维化中的作用机制.方法 雄性6周龄Wistar大鼠48只随机分为模型组和对照组,每组各24只.模型组在无菌条件下于左侧背部肋下切口行左侧输尿管结扎术,对照组只探及肾包膜,不结扎输尿管.于造模第7、14、21、28天各处死大鼠6只,取其左侧肾脏组织行HE和Masson染色检测肾脏病理改变,计算肾小管间质纤维化指数.采用实时荧光定量PCR检测其肾组织PAX2 mRNA表达,免疫组织化学方法 检测其肾脏组织PAX2及α-SMA蛋白表达.结果 1.病理结果 显示:对照组各时间点肾小管及间质均无明显变化.随着梗阻时间的延长,模型组大鼠肾小管间质纤维化指数逐渐增高(Pa<0.01).2.对照组大鼠肾组织仅有少量PAX2 mRNA表达,而模型组第7天表达增高,随着梗阻时间的延长,PAX2 mRNA表达逐渐增高,于第28天达高,与对照组各时间点比较,PAX2 mRNA表达有显著性差异(Pa<0.01).3.模型组大鼠肾小管上皮细胞PAX2的蛋白表达及肾间质α-SMA的蛋白表达于第7天均增高,随梗阻时间的延长,PAX2蛋白表达及α-SMA表达逐渐增高,于第28天高,与对照组各个时间点比较有显著性差异(Pa<0.01).4.模型组大鼠肾小管上皮细胞PAX2蛋白表达与肾间质α-SMA表达呈显著正相关(r=0.880 P<0.05),PAX2蛋白及α-SMA的表达均与肾小管间质纤维化指数均呈显著正相关(r=0.886,0.918 Pa<0.05).结论 PAX2可能参与UUO大鼠模型肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分化,使间质中肌成纤维细胞的数量增多,引起细胞外基质积聚增加,导致了肾小管间质纤维化的发生发展.
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pax2基因在肾小管上皮细胞转分化中的作用
目的 探讨pax2基因在大鼠慢性肾小管间质纤维化过程中的表达及其对肾小管上皮细胞转分化的可能作用.方法 大鼠5/6肾切除造模,分别于术后2、4、6、8、10、12周取左肾皮质,采用逆转录(RT)-PCR及免疫组织化学的方法检测模型组和正常对照组的pax2和α-SMA的表达.结果 病变组织见系膜细胞和基质增生,间质炎症细胞浸润,基底膜变厚.5/6肾切除模型组大鼠在术后第2周出现pax2 mRNA的强表达,第4周达高峰,与正常对照组比较P＜0.05,此后下降至痕量表达;α-SMA mRNA也在术后第2周表达逐渐增强,第8周达高峰,与正常对照组比较P＜0.05,此后逐渐下降.免疫组织化学染色显示,5/6肾切除模型组pax2蛋白的表达、肾小管上皮细胞中α-SMA的表达与pax2 mRNA、α-SMA mRNA的表达趋势相同.结论 在大鼠慢性肾间质纤维化的过程中,受损的肾小管上皮细胞可向肌成纤维细胞转分化,肾小管发育胚胎基因pax2在此过程中的一过性表达可能起到重要的作用.
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沉默PAX2基因对肾间质纤维化大鼠的影响
目的探讨体内沉默PAX2基因对肾间质纤维化大鼠肾小管上皮细胞转分化（EMT）的影响。方法64只Wistar大鼠麻醉后，单侧输尿管结扎法制作肾间质纤维化大鼠模型，随机分为阴性对照组和PAX2基因沉默组，每组32只。将200μL NC-siRNA-in vivo jetPEITM混合液转染阴性对照组大鼠，将200μL PAX2-siRNA-in vivo jetPEITM混合液转染PAX2基因沉默组大鼠，各组分别于转染后3、5、7、14 d分为4个亚组，每组8只。留取各组肾组织标本，应用Real-Time PCR及Western blot法检测肾皮质PAX2 mRNA及其蛋白的沉默情况，以及E-钙粘连素（E-cadherin）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）mRNA和蛋白表达情况。结果 PAX2基因沉默组PAX2 mRNA和蛋白表达量较阴性对照组均降低（P<0.05）。随着梗阻时间的延长，两组E-cadhelin mRNA和蛋白表达量逐渐下降，α-SMA mRNA和蛋白表达量逐渐升高；在转染14 d时，PAX2基因沉默组E-cadhelin mRNA和蛋白相对表达量明显高于阴性对照组（P<0.05），而α-SMA mRNA和蛋白相对表达量明显低于阴性对照组（P<0.05）。结论沉默PAX2基因在肾间质纤维化晚期大鼠中可明显抑制肾小管EMT进程，可能对肾间质纤维化有治疗作用。
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PAX2慢病毒表达载体的制备及鉴定
目的 构建大鼠PAX2慢病毒表达载体,以期在大鼠肾脏中高效、稳定表达.方法 设计引物引入Age I酶切位点,使用PCR方法从质粒pcDNA3.1-PAX2中扩增小鼠PAX2基因的编码区序列,对所扩增出的目的片段回收纯化.用In-Fusion技术将Age Ⅰ内切酶消化后目的片段交换连接入Age Ⅰ酶切的pGC-FU载体,构建PAX2慢病毒表达载体pGC-FU-PAX2.酶切验证并测序正确后,将质粒pGC-FU-PAX2与慢病毒辅助包装载体共转染293T细胞,Western-blot验证PAX2在转染293T细胞中表达.结果 通过PCR扩增获得了PAX2基因,将PAX2克隆到慢病毒转移质粒pGC-FU中,并在293T细胞中包装产生慢病毒颗粒.结论 成功构建了PAX2慢病毒表达载体,为进一步从分子水平探讨PAX2功能奠定了基础.
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一例肾-视神经乳头缺损综合征患儿基因突变检测分析
目的 检测并分析一例肾-视神经乳头缺损综合征(RCS)患儿的基因突变位点.方法 一例表现为右眼先天性白内障、左眼视盘缺损的患儿及其正常表型的父母纳入研究.采集3名受试者的外周静脉血,提取基因组DNA.应用二代测序法筛查、Sanger测序法验证PAX2基因突变位点.通过相关数据库和PubMed文献检索基因突变位点的致病性报道.结合患者临床表现和相关检查结果,根据《遗传变异分类标准与指南》判断该基因突变的致病性.根据基因突变结果针对性行肾脏彩色超声和肾功能检查.结果 该息儿存在PAX2基因c.70dupG(p.V26Gfs*28)杂合突变,导致PAX2基因的编码蛋白转录因子配对盒2的第26位氨基酸由缬氨酸突变为甘氨酸并移码28个密码子后终止翻译.正常表型的父母均不携带此突变.Sanger测序法验证结果显示,息儿及其父母的PAX2基因突变情况与二代测序一致.患儿疾病表型推断为PAX2基因c.70dupG(p.V26Gfs*28)杂合突变所致,系常染色体显性遗传.肾脏彩色超声检查发现,患儿左肾小囊肿及集合系统轻度分离.肾功能检查结果显示,患儿α1微球蛋白指标升高.结论 PAX2基因c.70dupG(p.V26Gfs*28)杂合突变是该患儿的致病原因.
