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乳腺癌他莫昔芬耐药相关基因及通路的筛选
目的:利用美国国家生物技术信息中心基因表达数据库中雌激素受体阳性乳腺癌表达谱芯片进行生物信息学分析,筛选他莫昔芬耐药的关键基因和信号通路.方法:利用基因芯片GSE26459,R软件分析得到差异基因,DAVID进行Gene Ontology和KEGG富集分析,STRING绘制蛋白作用网络.GSEA富集分析得到耐药相关通路及基因.结合蛋白作用网络筛选目标基因并验证.结果:筛选出差异基因1 516个,上调基因505个,下调基因624个.通路富集分析发现脂肪酸代谢通路、细胞粘附、胰岛素抵抗等信号通路在乳腺癌的他莫昔芬耐药中起重要作用,并在富集通路中筛选出ACSL1等候选目标基因并验证.结论:利用生物信息学有效分析他莫昔芬耐药的基因芯片数据,为他莫昔芬耐药的治疗靶点提供重要依据.
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基于芯片数据的雌激素受体阳性乳腺癌他莫昔芬耐药相关基因分析
目的:从分子水平揭示激素受体阳性乳腺癌他莫昔芬耐药的机制,并寻找潜在的治疗他莫昔芬耐药的靶点.方法:从公共基因芯片表达数据库(GEO)中下载雌激素受体阳性乳腺癌的相关基因芯片数据GSE67916,利用GEO2R在线分析工具筛选他莫昔芬耐药性与敏感性乳腺癌的差异表达基因;并利用DAVID软件对所筛选差异表达基因进行相关功能及通路富集分析;通过STRING、Cytoscape等工具对其进行蛋白间相互作用网络的构建和分析.结果:筛选出438个差异表达基因,其中300个上调表达基因,138个下调表达基因.GO功能分析发现这些差异基因主要参与蛋白结合、细胞对雌激素的反应、免疫应答、细胞质及细胞外基质等分子功能及生物学过程;KEGG通路富集分析显示主要富集在MAPK信号通路和HIF-1信号通路等.STRING、Cytoscape分析显示MAPK1、ESR1、SMARCA4、RANBP2和PRKCA为潜在的关键节点基因,对其进行文献挖掘及分析显示与激素受体阳性乳腺癌他莫昔芬耐药相关.结论:利用生物信息学方法对他莫昔芬耐药与他莫昔芬敏感的雌激素受体阳性乳腺癌的差异表达基因分析,可有效发掘这些差异表达基因的相互作用,为雌激素受体阳性乳腺癌他莫昔芬耐药寻找新的治疗靶点提供新方向.
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三黄煎剂降低ROS促进乳腺癌他莫昔芬耐药细胞凋亡的实验研究
目的 探讨三黄煎剂对MCF-7他莫昔芬耐药(MCF-7/TAMR)细胞ROS水平和凋亡的影响.方法 建立MCF-7/TAMR细胞系,采用CCK-8法检测他莫昔芬对乳腺癌细胞MCF-7、MCF-7/TAMR增殖的影响,并检测耐药指数;同时检测三黄煎剂对MCF-7/TAMR增殖的影响.免疫荧光法评价MCF-7、MCF-7/TAMR及各给药组的ROS的水平;流式细胞仪检测各实验组细胞凋亡情况;Western Blot法检测三黄煎剂对MCF-7/TAMR细胞凋亡相关蛋白表达对的影响.结果 成功构建了MCF-7/TAMR细胞株,不仅在形态上发生了改变,而且对他莫昔芬的抵抗能力得到了增强,其RI指数为(3.61 ±0.35) (P ＜0.05),三黄煎剂对MCF-7/TAMR细胞株有明显的抑制作用,IC50值为(4.28士0.06)mg/mL,能够降低耐药细胞株的ROS水平,同时能够下调MCF-7/TAMR细胞的Bcl-2活性,上调BaX/Bak,促使MCF-7/TAMR细胞产生凋亡.结论 三黄煎剂通过降低乳腺癌MCF-7TAMR细胞内的ROS水平,抑制乳腺癌MCF-7TAMR细胞增殖并促进乳腺癌MCF-7TAMR细胞凋亡.
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表观遗传修饰-他莫昔芬耐药机制研究的新方向
他莫昔芬(tamoxifen,TAM)为人工合成的非甾体类抗雌激素药物,被广泛用于雌激素受体(estrogen receptor,ER)阳性的乳腺癌患者的治疗.但是仍有约40％的ER阳性乳腺癌患者对TAM产生继发性耐药.目前对TAM耐药机制研究众多,而表观遗传学是新的研究方向.在本综述中,我们将从表观遗传调控方面阐述当前对TAM耐药机制研究的新进展,以便更好地了解TAM耐药,并为乳腺癌治疗提供新的策略.
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微小RNA-10b靶向蛋白去乙酰化酶4调控雌激素受体阳性MCF-7乳腺癌细胞他莫昔芬耐药性
目的 探讨微小RNA(miRNA,miR)-10b靶向蛋白去乙酰化酶4(HDAC4)调控雌激素受体阳性(ER+)MCF-7乳腺癌细胞对他莫昔芬的耐药性.方法 建立ER+且他莫昔芬耐药的MCF-7细胞株MCF-7-TR,实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)法检测MCF-7细胞和MCF-7-TR细胞miR-10b表达水平.分别采用噻唑蓝(MTT)法和锥虫蓝法检测转染pre-miR-10b、miR-10b抑制物、siHDAC4的MCF-7细胞、MCF-7-TR细胞在不同他莫昔芬浓度下(0、5、10、15、20、30 μmol/L)的增殖能力和活性.采用Western blot检测HDAC4蛋白表达情况.结果 以MCF-7乳腺癌细胞miR-10b表达水平和侵袭能力作为标准,MCF-7-TR细胞乳腺癌细胞miR-10b表达水平和侵袭能力较MCF-7乳腺癌细胞分别为7.2±1.1和5.3±1.3.随着他莫昔芬浓度增加,各细胞增殖率均呈下降趋势,其中以MCF-7细胞为明显,其次为MCF-7-TR+ miR-10b抑制物+siHDAC4细胞以及MCF-7+ pre-miR-10b+ HDAC4细胞,而MCF-7-TR+ siHDAC4细胞和MCF-7-TR细胞增殖率下降程度低.MCF-7细胞和MCF-7-TR+miR-10b抑制物细胞的迁移能力下降多,而MCF-7+pre-miR-10b+他莫昔芬(10 μmol/L)细胞和MCF-7-TR+他莫昔芬(10 μmol/L)细胞的迁移能力比较差异无统计学意义(t=1.116,P=0.272),但显著高于MCF-7细胞和MCF-7-TR+ miR-10b抑制物细胞(t=0.124、10.769、14.569、11.577,P均为0.000).MCF-7+ pre-miR-10b细胞HDAC4蛋白表达水平低于MCF-7细胞,MCF-7-TR细胞HDAC4蛋白表达水平MCF-7-TR+ miR-10b抑制物细胞,MCF-7+ siHDAC4细胞HDAC4蛋白表达水平低于MCF-7细胞.结论 miR-10b-HDAC4信号通路可能作为乳腺癌他莫昔芬耐药的一种分子机制.
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雌激素受体GPER在乳腺癌中的研究现状
G蛋白偶联雌激素受体(G protein-coupled estrogen receptor, GPER,也称GPR30)在多种类型细胞中均可介导雌激素信号,其在乳腺癌、子宫内膜癌等激素敏感性肿瘤细胞中的作用尤为明显.雌激素及抗雌激素药物通过激活GPER促进下游信号通路的活化及靶基因的表达进而参与乳腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭及他莫昔芬耐药等恶性生物学行为.目前发现表皮生长因子受体(epidermal growthfactor receptor, EGFR)的转活是GPER引发下游生物学效应的关键靶点.此外,GPER还被认为是预测三阴乳腺癌患者预后的潜在生物学标志物之一,对GPER的深入研究可能为乳腺癌患者的综合性评估和临床治疗打开更广阔的前景.
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基于基因表达谱筛选乳腺癌他莫昔芬耐药的生物标志物与治疗药物
目的:利用基因表达谱和关联性图谱数据库筛选乳腺癌他莫昔芬耐药的潜在生物标志物和治疗药物.方法:在GEO(Gene Expression Omnibus)数据库中筛选得到他莫昔芬耐药的乳腺癌细胞基因表达谱数据集GSE67916和GSE26459,利用R语言和Bioconductor包筛选差异表达基因.Metascape对差异表达基因进行功能注释,Cytoscape构建差异表达基因编码蛋白互相作用网络图并确定核心基因.利用数据集GSE9893验证核心基因在他莫昔芬耐药患者中的表达及与临床预后的关系.后将差异表达基因导入关联性图谱数据库筛选他莫昔芬耐药的候选治疗药物并进行细胞实验验证.结果:共获得差异表达基因462个,这些基因显著富集于雄激素响应、糖酵解和胆固醇平衡等通路.ATP-柠檬酸裂解酶(ATP-citrate lyase,ACLY)为乳腺癌他莫昔芬耐药的核心基因,ACLY在耐药患者中的表达水平显著高于敏感患者(P＜0.05),ACLY低表达患者无复发生存率显著高于高表达患者(P＜0.05).终筛选得到匹莫齐特、LY-294002等10种候选治疗药物,经证实LY-294002可有效抑制耐他莫昔芬乳腺癌细胞的增殖.结论:ACLY可作为他莫昔芬耐药的生物标志物.利用基于关联性图谱数据库可快速筛选出他莫昔芬耐药的潜在治疗药物.
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PLK1调控Pin1促进乳腺癌对他莫昔芬耐药的机制
目的 探究Polo样激酶1(PLK1)对他莫昔芬耐药(TAM-R)乳腺癌中脯氨酰异构酶Pin1的调控机制.方法 长期低浓度加药法诱导TAM-R乳腺癌细胞系MCF-7R,采用荧光定量PCR、Western blot检测PLK1、p-PLK1、Pin1表达水平,应用免疫共沉淀技术证明PLK1和Pin1在细胞内相互作用,通过siRNA和PLK1抑制剂确认PLK1对于Pin1的调控作用.结果 他莫昔芬耐药乳腺癌细胞MCF-7R中,Pin1、PLK1、p-PLK1蛋白水平分别是亲本细胞MCF-7的3.1、1.3和2.4倍,差异有统计学意义(P<0.05).通过免疫共沉淀实验证明,PLK1和Pin1可以在细胞内相互作用,并且PLK1抑制剂或者siRNA显著减少Pin1蛋白表达水平.结论 TAM-R乳腺癌中PLK1与Pin1相互作用并能调控Pin1的蛋白水平.
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IL-6经MEK/ERK途径促进ERα-Ser118磷酸化影响卵巢癌细胞他莫昔芬耐药
目的 研究IL-6信号通路对ERα的Ser1 18位点磷酸化影响、对ERα转录活性的影响及IL-6诱导卵巢癌TAM耐药的机制.方法 脂质体转染法获得内源性过表达IL-6的人卵巢癌A2780细胞株和内源性抑制IL-6表达的人卵巢癌CAOV3细胞株,Western blot法检测内源性和外源性IL-6对ERK和ERα的Ser118位点磷酸化影响,MTT法检测IL-6的MEK/ERK信号通路对A2780细胞TAM耐药性的影响,荧光素酶活性检测IL-6的MEK/ERK信号通路对ERα转录活性的影响.结果 过表达IL-6能上调A2780细胞中ERα-Ser118的磷酸化水平,而抑制IL-6表达下调CAOV3细胞中ERa-Ser1 18的磷酸化水平;外源性IL-6上调A2780细胞中ERK的磷酸化水平,而MEK1/2特异性抑制剂PD98059则可以逆转IL-6介导的ERK及ERα-Ser118的磷酸化;PD98059可明显降低IL-6导致的A2890细胞对TAM的耐药性;IL-6明显促进ERa转录活性,而PD98059可逆转这一作用.结论 IL-6经ME K/ERK通路磷酸化ERα的Ser118位点促进ERα转录活性而激活ER途径,诱导OVCA细胞对TAM的耐药性.
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人源S100A8重组质粒的构建及其对他莫昔芬治疗乳腺癌的影响
目的 构建人源S1000A8的重组质粒,并在人乳腺癌细胞MCF7中表达,初步探索其对他莫昔芬处理下MCF7细胞的影响.方法 设计合成针对人源S100A8基因cds区的引物序列,采用PCR的方法以人乳腺癌细胞MCF7的cDNA为模板,扩增目的基因S100A8,经过NdeⅠ和BamHⅠ双酶切后,克隆至pCMV5-myc质粒上.通过脂质体转染至MCF7细胞中,应用Western Blot法检测其蛋白表达.脂质体转染S100A8至MCF7细胞并应用他莫昔芬处理后,用MTT法检测其细胞活力,Western Blot法检测相关蛋白表达.结果 酶切鉴定证明S100A8基因重组质粒构建成功,并且可以在MCF7细胞中过表达.MTT法显示S100A8可以部分逆转他莫昔芬所造成的细胞活力下降,部分抗凋亡分子表达上升.结论 人源S100A8基因的重组质粒构建成功,为进一步研究S100A8在乳腺癌对他莫昔芬发生耐药的过程中的作用奠定了基础.
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雄激素受体在乳腺癌他莫昔芬耐药中的作用和机制研究进展
他莫昔芬(tamoxifen,TAM)为人工合成的非甾体类抗雌激素药物,被普遍的应用于雌激素受体(estrogen receptor,ER)阳性的乳腺癌患者中.但大约一半的ER阳性的患者会出现耐药.可见内分泌耐药是当前临床迫切需要解决的问题.随着对耐药机制的深入研究:发现雄激素受体(androgen receptor,AR)在72.9％的原发性乳腺癌病例中表达,并在约65％的乳腺癌中与ER同时表达.有研究显示:AR/ER越高预示着TAM治疗率越低;AR与人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)之间所形成的正反馈循环能够增加TAM耐药;AR、髓样细胞白血病-1蛋白(myeloid cell leukemia-1,Mcl-1)与TAM耐药有可能相关.所以探讨AR在TAM耐药中的作用和机制是非常有意义的.为乳腺癌的靶向治疗掀开了新的一页.
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抑癌基因LKB1与乳腺癌他莫昔芬耐药性之间的关系
目的:研究抑癌基因LKB1对乳腺癌他莫昔芬耐药的影响及机制.方法:运用免疫组化技术对68例乳腺癌组织中LKB1、雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)的表达进行检测,并且利用GEPIA数据库验证实验结果;利用Kaplan-Meier Plotter数据库分析LKB1基因与ER/PR阳性的Luminal A/B亚型乳腺癌预后之间相关性;运用实时定量PCR、免疫印迹和免疫荧光技术分析LKB1在他莫昔芬耐药细胞系中的表达及定位;运用免疫印迹和免疫荧光技术分析他莫昔芬对LKB1表达及定位的影响.结果:在乳腺癌中LKB1与ER/PR的表达呈现显著的正相关性,ER/PR(+++)和ER/PR(+)两组间LKB1的表达差异具有显著的统计学意义(P＜0.001);LKB1的表达量与乳腺癌预后呈现正相关性,在Luminal A/B亚型的乳腺癌中LKB1表达越低其预后越差;在他莫昔芬耐药细胞系及对照细胞中LKB1的mRNA和蛋白表达量差异无统计学意义,但是在耐药细胞中LKB1的定位发生了从细胞质向细胞核的移行;在体外他莫昔芬能够诱导LKB1表达并且促进LKB1从细胞质向细胞核的移行.结论:在Luminal A/B亚型的乳腺癌中,LKB1的低表达是一种不良预后的指标,并且该蛋白从细胞质向细胞核的移行与乳腺癌他莫昔芬耐药密切相关,而耐药与蛋白的表达量无关.
关键词： 肿瘤抑制因子LKB1 他莫昔芬耐药 乳腺癌 -
Gαs在乳腺癌他莫昔芬耐药中的作用
目的:研究Gαs在乳腺癌他莫昔芬耐药中的作用,寻求逆转乳腺癌他莫西芬耐药的分子靶点.方法:通过RNA干涉技术沉默乳腺癌他莫昔芬耐药(TAM-R)细胞中Gαs的表达,QPCR及Western blot检测其沉默效果,给予细胞4-羟他莫昔芬(4-hydroxytamoxifen,OHT)处理,通过MTT检测Gαs表达改变对耐药细胞增殖的影响,并检测细胞中AKT磷酸化水平.结果:Gαs-RNAi可以有效沉默Gαs在mRNA及蛋白水平的表达,而沉默Gαs的他莫昔芬耐药细胞给予4-羟他莫昔芬10 nmol/L处理后,细胞增殖明显受到阻滞,AKT磷酸化水平明显降低.结论:Gαs通过诱导AKT磷酸化在乳腺癌他莫昔芬耐药中发挥着重要作用.
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miR -21通过调控 PTEN 介导乳腺癌他莫昔芬耐药的作用机制
目的：研究 miR -21在乳腺癌他莫昔芬耐药中的作用，寻求逆转他莫昔芬耐药的靶点。方法：荧光实时定量 PCR（RT - QPCR）检测乳腺癌 MCF -7细胞与乳腺癌他莫昔芬耐药细胞株 MCF -7/ TAM 细胞中miR -21的表达；将 miR -21 mimics 转染到 MCF -7细胞内，将 miR -21 inhibitors 转染到 MCF -7/ TAM 细胞内，并应用 RT - QPCR 分别检测细胞内 miR -21的表达变化，给予细胞4-羟他莫昔芬（4- hydroxytamoxifen， OHT）处理后，利用 MTT 法检测细胞增殖的变化；转染 MCF -7/ TAM 细胞 miR -21 inhibitors 及 mimics，利用RT - QPCR 检测细胞中 PTEN 的表达变化。结果：miR -21在 MCF -7/ TAM 细胞表达高于 MCF -7细胞，转染 miR -21 mimics 的 MCF -7细胞 miR -21高表达，PTEN 表达降低，转染 miR -21 inhibitors 的 MCF -7/TAM 细胞 miR -21表达降低，PTEN 表达增高；过表达 miR -21的 MCF -7细胞给予 OHT 处理后，细胞的增殖抑制不明显，而沉默 miR -21的 MCF -7/ TAM 细胞给予 OHT 处理后，细胞增殖明显受到阻滞；转染耐药细胞 miR -21 inhibitors 后，PTEN 表达增高，转染 miR -21 mimics 后，PTEN 表达降低。结论：miR -21通过调控PTEN 的表达在乳腺癌 TAM 耐药中发挥重要作用。
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双特异性磷酸酶1在乳腺癌及他莫昔芬耐药病例中的表达变化
目的 初步探讨双特异性磷酸酶1(DUSP1)在乳腺癌患者以及乳腺癌他莫昔芬(TAM)耐药患者中的表达变化及其与临床预后的关系.方法 使用TCGA数据库分析DUSP1在1 215名不同临床病理特点的乳腺癌患者中的分布和表达情况,使用生存分析数据库分析DUSP1表达水平与乳腺癌患者生存情况的关系;收集8例乳腺癌TAM耐药前后的配对标本进行免疫组化染色,分析DUSP1在耐药前后肿瘤标本中蛋白表达的变化情况.结果 DUSP1在乳腺癌组织中的表达水平显著低于正常乳腺组织(P＜0.001),且在Luminal A亚型中的表达高于其他亚型(P＜0.001);DUSP1的表达水平与乳腺癌患者的总生存(P＜0.05)和无复发生存(P＜0.001)呈正相关,与接受内分泌治疗的乳腺癌患者的无复发生存呈正相关(P＜0.001);DUSP1在8例TAM耐药患者的配对标本中表达变化未见统计学差异(P＞0.05).结论 在接受内分泌治疗的患者中DUSP1高表达的患者有更好的无复发生存,但是在8例配对标本的检测中未发现DUSP1的表达差异有统计学意义.提示DUSP1与TAM耐药之间关系的探索有待更大样本的临床研究和更深入的细胞和分子生物学实验.
