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ISL-1诱导脂肪干细胞向起搏样细胞分化
目的 探讨过表达胰岛素基因增强子结合蛋白1(insulin gene enhancer binding protein 1,ISL-1)的慢病毒在体外转染脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs),能否诱导ADSCs向起搏样细胞分化.方法 取第3～5代ADSCs,随机分成Bank、mCherry和胰岛素基因增强子结合蛋白1(insulin gene enhancer binding protein 1,ISL-1)3组,按分组分别转染病毒,经荧光强度和流式分析确定适感染复数,与乳鼠心室肌细胞(neonatal rat cardiomyocytes,NRVMs)共培养7天后迸行实时荧光定量聚合酶式反应(quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR)、蛋白质印迹、免疫荧光检测分析,期间观察细胞形态和搏动频率变化,并用膜片钳技术记录细胞内电流活动.结果 分离贴壁后的ADSCs呈长梭形,慢病毒转染ADSCs的适感染复数为50.ISL-1组ADSCs形态呈多样化,窦房结特异性基因HCN4、Cx45和Tbx3的mRNA表达水平上调,而工作心肌特异性基因Nkx2.5下调,组间比较差异有统计学意义(P<0.05).ISL-1组大多数细胞可检测到HCN4表达并且可记录到超极化内向电流.结论 经ISL-1基因修饰的ADSCs通过体外心肌微环境诱导,产生了一定的高表达窦房结标志性基因并具有细胞内典型超极化电活动的起搏样细胞.
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阻断经典Wnt通路对棕色脂肪干细胞向起搏样细胞分化的作用
目的:研究阻断经典Wnt通路对棕色脂肪干细胞向起搏样细胞分化的影响.方法:在诱导棕色脂肪干细胞向起搏特性诱导的过程中,培养基中加入经典Wnt通路阻断剂Dkk-1培养10 d.相差显微镜观察诱导组细胞的形态学变化、应用real-time PCR检测其中起搏细胞发育相关结构基因的表达情况,免疫荧光显色普通光镜和激光共聚焦显微镜观察起搏特征分子的蛋白表达.结果:分化后的棕色脂肪干细胞具有起搏细胞特性,经Dkk-1诱导后,棕色脂肪干细胞向起搏样细胞的转化率明显提高,起搏细胞发育相关基因和蛋白表达明显上调.结论:阻断经典Wnt通路可促进棕色脂肪干细胞向起搏样细胞的分化.
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hHCN2基因转染的脂肪组织来源的成体干细胞可分化为起搏样细胞
目的 大鼠脂肪来源的成体干细胞(ADSC)转染人超极化激活环核苷酸门控离子通道-2(hHCN2)基因,观察其作为起搏细胞的可行性.方法 取生长良好的ADSC转染hHCN2基因,通过RT-PCR、Western blot分析、免疫荧光技术检测hHCN2基因及蛋白的表达,用膜片钳技术检测细胞的电生理特征并记录其内向电流.将转染hHCN2基因的ADSC与心室肌细胞共培养,观察其对心室肌细胞自发性搏动的影响.结果 hHCN2基因修饰的大鼠ADSC能表达较强的hHCN2基因及蛋白,还能够产生超级化激活内向离子流.将其与心室肌细胞共培养,能使心室肌细胞的自发性搏动明显增快增强.结论 将hHCN2基因转染ADSC能够使其分化为具有起搏功能的起搏样细胞,为进一步优化生物起搏器的研究提供了材料.
