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  • miR-199a在2,4,6-三硝基苯磺酸/乙醇溃疡性结肠炎大鼠中的表达及雷公藤多苷的作用研究

    作者:钦丹萍;杨新艳;周毅骏;张春丽;杨雪静;李艳平;孙佩娜;代群

    目的 探讨miR-199a在2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇诱导的溃疡性结肠炎(UC)大鼠中的表达情况及雷公藤多苷(TWP)对其的作用.方法 采用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇灌肠法建立溃疡性结肠炎动物模型.对大鼠结肠组织进行大体形态损伤评分和镜下结肠损伤评分;采用芯片分析、Real-time PCR技术评估各组结肠黏膜组织中miR-199a的表达水平;针对milwalk数据库中预测的下游靶基因mRNA用表达谱进一步筛选分析靶基因mRNA,并用Real-time PCR技术验证靶基因mRNA在各组中的表达,后在DAVID数据库进行pathway分析,以分析miR-199a参与UC炎症活动时所调节的靶基因mRNA.结果 TWP高剂量组结肠黏膜大体形态损伤评分、组织病理损伤评分与模型对照组间差异有统计学意义(P<0.01).芯片分析显示,模型对照组中miR-199a较正常对照组上调(P<0.01),在AZA组表达较模型对照组下调(P<0.01,P<0.05).miR-199a-3p在TWP中剂量组,miR-199a-5p在TWP高剂量组中较模型对照组均下调(P<0.05).miR-199a的Real-time PCR结果显示,模型对照组miR-199a的表达水平较正常对照组明显上调(P<0.01);TWP的中、高剂量组和AZA组中miR-199a-3p的表达水平较模型对照组均下调(P<0.05);TWP中剂量组miR-199a-5p的表达水平较模型对照组下调(P<0.05).表达谱分析显示,FASL为miR-199a的靶基因.模型对照组中靶基因FASL表达水平较正常对照组上调(P<0.05),TWP组、AZA组中靶基因FASL表达水平较模型对照组下调,其中以AZA组的下调为显著(P<0.01).靶基因FASL的Real-time PCR结果显示,模型对照组中靶基因FASL表达水平较正常对照组明显上调(P<0.01);TWP中剂量组、高剂量组和AZA组中靶基因FASL表达水平较模型对照组下调(P<0.01).结论 miR-199a在TNBS/乙醇UC大鼠中有上调表达,FASL是miR-199a的下游靶基因.TWP能改善UC的炎症活动,对UC活动时上调的miR-199a具有下调作用;FASL在UC活动时呈上调表达,TWP对miR-199a下游靶基因FASL具有下调作用.

  • miR-199a在宫颈癌及宫颈上皮内瘤样病变中的表达及意义

    作者:邹阮敏;胡芝;陈昊;张丽芳;张文淼;薛向阳;黄引平

    目的 探讨miR-199a在宫颈癌及宫颈上皮内瘤样病变(CIN)中的表达情况及与宫颈癌各种临床病理特征的关系.方法 采用茎环 Realtime RT-PCR方法检测48例宫颈癌、12例CIN及正常宫颈组织中miR-199a-3p和miR-199a-5p的表达,分析miR-199a-3p和miR-199a-5p表达与宫颈癌常见的临床病理特征的关系.结果 用茎环 Realtime RT-PCR方法检测miR-199a-3p和miR-199a-5p表达的敏感性和特异性良好;miR-199a-3p和miR-199a-5p在宫颈癌及CIN组织中的表达低于非肿瘤组织,差异性显著(P<0.05),miR-199a-5p/miR-199a-3p表达比值未见明显差异(P=0.219).其中miR-199a-5p的表达与宫颈癌的组织分化程度存在一定相关性.小细胞型(Ⅲ级)宫颈癌的miR-199a-5p表达低于其他组织分化类型的标本(P=0.054)).miR-199a-3p和miR-199a-5p的表达与年龄、肿块大小、大体类型、病理类型及FIGO分期未见显著相关性(P>0.05).结论 miR-199a-3p和miR-199a-5p在宫颈癌及CIN组织中的表达显著低于正常宫颈组织.miR-199a-5p的表达与肿瘤的分化程度存在一定相关性.miR-199a在宫颈癌组织中的异常表达,可能在宫颈癌的发生和发展过程中发挥重要作用,有望成为宫颈癌新的治疗靶点.

  • miR-199a通过MDR1/P-gp调节肝癌细胞的耐药

    作者:戴海峰;梁军;刘红霞;廖国清

    目的:通过检测Hep G2及Hep G2/ADM细胞中miR-199a和MDR1/P-gp表达的差异,探讨miR-199a与肝癌化疗耐药的关系。方法利用Lipofectamine 2000转染寡核苷酸探针,荧光定量PCR方法检测miR-199a和MDR1的表达水平,Western印迹检测P-gp蛋白表达水平,MTT检测细胞存活率。结果与Hep G2细胞相比,Hep G2/ADM细胞中miR-199a表达显著下降MDR1/P-gp表达显著升高。过表达miR-199a能显著增加阿霉素对Hep G2/ADM细胞的抑制率,并抑制MDR1/P-gp的表达。干扰miR-199a能够显著地降低阿霉素对Hep G2细胞的抑制率,并增加MDR1/P-gp的表达。结论 miR-199a通过调节MDR1/P-gp的表达参与肝癌耐药形成,miR-199a可能成为逆转肝癌耐药的作用靶点。

  • miR-199a靶向HIF-1α调控表皮细胞的增殖参与银屑病的发病机制

    作者:王祎琳;丁香玉;胡琨;刘冰;杨洁;李承新

    目的 探讨miR-199a靶向低氧诱导因子-1α(HIF-1α)调控表皮细胞的增殖参与银屑病的发病机制,以此为临床银屑病治疗提供靶点.方法 选取2014年1月-2017年10月我院收治的22例寻常性银屑病患者皮损区组织作为观察组,以自愿参与课题的21例健康体检者皮肤组织为对照组.对二组受试者检测miR-199a以及HIF-1α的表达差异,以此为依据分析miR-199a是否具有靶向调控HIF-1α的作用.然后验证miR-199a与HIF-1a的靶向结合关系,主要包括在人永生化表皮细胞中将miR-199a mimics转染,采用Western blot检测HIF-1α的蛋白表达水平以及通过利用双荧光素酶报告基因实验.后通过MTT法作为检测手段探究银屑病的发病机制,主要依据为miR-199a以及HIF-1α对人永生化表皮细胞增殖的影响.结果 通过对正常体检者以及寻常性银屑病患者皮损区检查发现,随着miR-199a的表达下调,HIF-1α的表达呈上调状态,统计学分析miR-199a与HIF-1α存在负相关性.在人永生化表皮细胞中转染miR-199a mimics,发现具有下调HIF-1a表达的作用,与上述研究结果一致.HIF-1α可恢复miR-199a对人永生化表皮细胞增殖的抑制作用.结论 银屑病的发病机制研究中发现miR-199a靶向HIF-1α调控表皮细胞的增殖,是银屑病发病的重要因素,同时值得临床在制定相应治疗手段时借鉴此依据.

  • c-Myc调控PIK3 R3抑制黑色素瘤B16-F10细胞的迁移和侵袭

    作者:杨镓宁;邓菲;潘宁

    目的::探讨c-Myc调控PIK3R3对黑色素瘤B16-F10细胞的迁移和侵袭的影响。方法:运用免疫组化检测PIK3R3在正常皮肤组织和黑色素瘤组织的表达;检测慢病毒(LV3-c-Myc和LV3-PIK3R3)对c-Myc和PIK3R3基因的沉默效率;使用EdU增殖实验检测沉默c-Myc和PIK3R3后黑色素瘤细胞株B16-F10的增殖情况;Transwell侵袭实验检测c-Myc和PIK3R3的表达对黑色素瘤细胞B16-F10的侵袭能力的影响;划痕实验检测c-Myc和PIK3R3的表达对黑色素瘤细胞B16-F10迁移能力的影响;qPCR检测沉默c-Myc和PIK3R3后miR-199a的表达;qPCR检测转染miR-199a mimics和miR-199a inhibitor后c-Myc和PIK3R3的表达;双荧光素酶报告基因系统检测miR-199a对c-Myc和PIK3R3转录活性的影响。结果:和正常皮肤组织比较,PIK3R3在黑色素瘤组织中表达明显增加;沉默c-Myc和PIK3R3基因后,黑色素瘤细胞株B16-F10的增殖、侵袭和转移能力明显降低;沉默c-Myc和PIK3R3基因后,miR-199a表达上调;转染miR-199a mimics后,c-Myc和PIK3R3表达降低;转染miR-199a inhibitor后,c-Myc和PIK3R3表达上调;双荧光素酶报告基因系统检测结果显示,miR-199a可以直接调控c-Myc和PIK3R3的转录活性。结论:c-Myc可以通过miR-199a调控PIK3R3的表达,从而促进黑色素瘤细胞的增殖、侵袭和迁移能力。

  • miR-199a在肿瘤中的研究进展

    作者:马中良;李雪;梁辰;金由辛

    MicroRNAs (miRNAs)是一类内源的、长度约为20~25个核苷酸非编码单链小RNA分子,在多种生理病理过程特别是肿瘤疾病中发挥着重要的作用.越来越多的证据表明,miR-199a在人类恶性肿瘤中异常表达.文章综述了miR-199a在肿瘤中作业及miR-199a-5p/3p成熟体调控机制.

    关键词: miRNA miR-199a 肿瘤 调控
  • miR-199a对肝癌HepG2细胞增殖的影响及机制

    作者:程顺舟;陈欣;王平;王吉荣

    目的:探讨miR-199a对肝癌HepG2细胞增殖的影响及机制.方法:使用DNA重组技术,将含有miR-199a的基因片段克隆入带有EGFP的慢病毒载体pLV-GFP-puro,DNA测序鉴定阳性克隆,并用脂质体介导法将慢病毒包装系统和带miR-199a的质粒共转染293T细胞包装病毒,纯化后感染肝癌HepG2细胞.用荧光显微镜观察感染效率;MTT法检测细胞增殖活性;Western blot检测HepG2细胞IκBα、p-NF-κBp65表达;并采用qRT-PCR分析感染HepG2细胞miR-199a和NF-κB相关抗凋亡基因(TRAF2、cIAP2、Bfl-1和cFLIP)的表达情况.结果:成功构建了miR-199α重组慢病毒载体,并对其包装、纯化及浓缩后测定病毒滴度为1.08×108 TU/mL;感染后HepG2细胞高表达miR-199a,抑制HepG2细胞增殖,并证实过表达miR-199a有效稳定IκBα表达,抑制NF-κB活性,进一步抑制NF-κB相关抗凋亡基因TRAF2、cIAP2、Bfl-1和cFLIP表达.结论:miR-199a重组慢病毒过表达载体有效感染HepG2细胞,并抑制HepG2细胞增殖,其机制可能与miR-199a抑制NF-κB活性及其相关抗凋亡基因表达有关.

  • miR-199a在肾细胞癌中的表达与临床病理特征及预后的关系

    作者:司彤;刘春晓;许凯;桂耀庭

    目的 检测miR-199a在肾细胞癌及癌旁相对正常肾组织中的表达量,分析其相对表达量和肾细胞癌相关的临床病理特征及其对肾细胞癌预后判断的意义.方法 采用RT-qPCR检测67例肾细胞癌及癌旁正常组织miR-199a表达,分析表达的差异与临床病理特征间的关系.结果 在肾细胞癌和癌旁相对组织中均有不同程度的表达,在肾细胞癌的表达显著低于癌旁相对正常组织,均值13.7倍(P=0.003).miR-199a的表达在不同肿瘤浸润程度及复发程度之间存在差别(P<0.05,x2=4.215),而与年龄、组织学类型、淋巴结转移、远处转移、Fuhrman分级等无统计学关联(P>0.05).miR-199a下调组生存期明显低于对照组(Log-rank test,P=0.017).结论 miR-199a表达下调与肾癌患者原发肿瘤浸润程度、复发及预后不良有关,可作为评估肾癌预后有价值的一种指标.

  • 超声微泡介导质粒转染对人肝癌HepG2细胞迁移、侵袭及克隆能力的影响

    作者:朱芳方;陈海清;赖己创;陈佳琳;过新民

    目的 探讨超声微泡造影剂介导miRNA质粒转染人肝癌HepG2细胞后迁移、侵袭及克隆能力的改变.方法 在前期实验所筛选的佳超声微泡转染条件下,转染目的基因反义miR-21/221、miR-199a进入人肝癌HepG2细胞,划痕实验、Transwell实验检测细胞迁移、侵袭能力,软琼脂克隆形成实验检测细胞克隆能力.结果 转染目的质粒后,细胞的迁移、侵袭能力及克隆能力与对照组比较均显著受到抑制(P<0.05),其中以miR-199a质粒组的抑制效果佳(相对细胞迁移率31.05%;平均视野侵袭细胞数38.67±4.51;克隆数105.67±5.86),与其它目的质粒组比较,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 通过分析miRNAs对人肝癌HepG2细胞部分细胞功能的影响,为肝癌的基因治疗提供新的靶点及思路.

  • 超声微泡造影剂介导mir-199a转染人肝癌HepG2细胞的实验研究

    作者:过新民;阮黎;全显跃

    目的:探讨微泡造影剂介导miRNA-199a在人肝癌HepG2细胞中的效率和稳定性.方法:利用超声造影剂六氟化硫微泡(SF6)介导miRNA-199a在人肝癌HepG2细胞中的转染率.将待转染的细胞分为以下5组:质粒组;质粒+超声组(4亚组);质粒+超声+ SF6组;质粒+脂质体组;空白对照组.通过MTT比色鉴定微泡造影剂对细胞的影响程度.结果:SF6浓度<10%时,微泡均不会引起明显的细胞死亡(细胞存活率>80%),当微泡造影剂浓度达20%时,对细胞的杀伤力明显增强(细胞存活率<65%);通过4组平行因素[机械指数(MI)分别为0.12、0.20、0.28、0.35]的超声微泡造影剂转染实验,利用荧光显微镜与流式细胞术发现造影剂的适宜的浓度(10%)下,超声频率为2.0 MHz,MI:0.28时,转染效率可达到(26.31±0.72)%.结论:在一定辐照条件下,微泡浓度10%介导miRNA-199a转染肝癌HepG2细胞效率较高,且显著高于传统的脂质体转染.

  • 亚低温处理对大鼠脑缺血模型皮层神经元损伤和miR-199a表达水平的影响

    作者:王金领;李洪忠;侯立朝;刘姗姗;蔡铁良;胡宏强;袁欣;都继微;邓斌

    目的:探讨局部亚低温(mildhypothermia,MHT)处理对大脑皮层缺血半暗带内miR-199a表达的影响及其神经保护作用.方法:取成年雄性Sprague-Dawley大鼠,制作大脑中动脉栓塞(middle cerebral arterial occlusion,MCAO)模型,在再灌注后30 min时大鼠头部进行亚低温处理3h.再灌注后6h,24h和72 h时利用qRT-PCR检测大脑皮层半暗带内miR-199a表达;再灌注后24h时进行神经功能缺陷评分并测量脑水肿情况;再灌注后24h时制备脑组织冰冻切片,分别进行NISSL和FJC染色,观察神经元损伤及变性情况.结果:(1)再灌注后24 h时MCAO组miR-199a表达明显多于再灌注后6h和72 h时MCAO组miR-199a表达(P<0.05).再灌注后6h、24 h和72 h时,与各Sham组亚组相比,各MCAO组亚组miR-199a表达明显增加(P<0.05);与各MCAO组亚组相比,各MCAO+ MHT组亚组miR-199a表达明显减少(P<0.05).(2)再灌注24h时,与MCAO+ MHT组相比,MCAO组及MCAO+ MHT+ miR-199a mimics组模型动物神经功能缺陷评分显著增加(P<0.05),脑组织含水量明显增多(P<0.05),半暗带内正常神经元数量显著减少(P<0.05),变性神经元数量显著增加(P<0.05).结论:局部亚低温处理可通过抑制大脑皮层缺血半暗带内miR-199a表达,减轻脑水肿,缓解神经元变性和损伤,从而发挥神经保护作用.

  • miR-199a通过靶向ATP13A2抑制6-OHDA诱导的PC12细胞氧化应激

    作者:张百平;孙树凯;贾栋

    目的:探究miR-199a通过靶向调节ATP13A2对6-OHDA诱导的PC12细胞氧化应激的影响.方法:收集正常大鼠和帕金森(PD)模型大鼠脑组织,培养6-OHDA诱导的PC12细胞,利用Real-time PCR检测miR-199a和ATP13A2的表达,Western Blot检测ATP13A2表达.分别转染miR-199a类似物和miR-199a抑制剂,利用ELISA检测ROS、MDA、SOD和GSH-Px的表达.双荧光素酶报告基因检测miR-199a与ATP13A2的靶向关系.WesternBlot法检测ATP13A2和JNK/c-Jun表达的影响.MTT法检测细胞增殖的影响.结果:PD脑组织和细胞中miR-199a表达显著降低,ATP13A2表达显著升高(P<0.01).过表达miR-199a可显著降低6-OHDA诱导的PC12细胞的ROS、MDA活性,升高SOD、GSH-Px活性(P<0.01).miR-199a过表达显著降低荧光素酶报告基因的荧光强度,而结合位点突变后荧光素酶活性不变(P<0.01).过表达miR-199a显著降低ATP13A2的表达并抑制JNK和c-Jun的磷酸化水平,茴香霉素则升高ATP13A2表达并激活JNK和c-Jun的磷酸化水平,过表达miR-199a且给予茴香霉素处理可使JNK和c-Jun的磷酸化水平恢复到6-OHDA-PC12组水平(P<0.01).过表达miR-199a抑制6-OHDA诱导的PC12细胞增殖,茴香霉素则促进其增殖,过表达miR-199a且给予茴香霉素处理可使细胞增殖率恢复到6-OHDA-PC12组水平(P<0.01).结论:miR-199a可通过靶向调节ATP13A2抑制6-OHDA诱导的PC12细胞氧化应激并抑制JNK/c-Jun活化.

  • miR-199a抑制低氧诱导因子在银屑病患者皮损中的表达

    作者:杨志波;唐雪勇;王畅

    目的 探索miR-199a,HIF-1α在银屑病中的表达及其对表皮细胞增殖的影响.方法 首先检测了27例寻常性银屑病患者皮损区和19例健康志愿者皮肤的miR-199a,HIF-1α的表达差异,分析二者之间的相关性;然后在HaCaT细胞中转染miR-199a mimics,用Western blot检测HIF-1 α的蛋白表达水平;用双荧光素酶报告基因实验验证miR-199a与HIF-1α的靶向结合关系;后用MTT法检测miR-199a,HIF-1α对HaCaT细胞增殖的影响.结果 银屑病组织中miR-199a的表达下调,HIF-1 α的表达上调,且两者存在负相关性;在HaCaT细胞中转染miR-199a mimics可下调HIF-1α的表达;HIF-1α可回复miR-199a对HaCaT细胞增殖的抑制作用.结论 miR-199a靶向HIF-1α调控表皮细胞的增殖从而参与银屑病的发病机制.

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