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听神经病的分子机制
听神经病(auditory neuropathy)是指由听觉编码异常所造成的听觉障碍.这种听觉障碍除了影响听力外,还影响了言语理解能力.听神经病可以由内毛细胞、内毛细胞带状突触或耳蜗螺旋神经节细胞受损引起.目前遗传学、生理学及动物模型研究显示,破坏内毛细胞带状突触功能(通过改变基因表达从而影响突触前突触囊泡谷氨酸装载、钙离子内流或突触囊泡胞吐作用)可导致类似“听觉突触病变”的听力受损.此外,动物研究已证明过度声刺激会造成内毛细胞带状突触兴奋性毒性损伤,这可能是噪声暴露或年龄相关性听力损失造成听力障碍的机制.虽然听神经病的定义包括了中枢部分,但由于其发病少、病因和病理机制均不清楚,而大部分听神经病发生在外周听觉系统,所以本文主要集中阐述听神经病外周(突触和听神经)病理机制及相应临床发现,讨论听神经病患者听力康复的现行策略,并对未来恢复听力的治疗方式进行展望.
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早期听觉衰老小鼠在110dB白噪声暴露下听力损害特征及机制研究
目的 观察6月龄和2月龄C57BL/6J小鼠经中等偏强的白噪声暴露后的听力学、耳蜗带状突触及毛细胞线粒体的变化.方法 16只听力正常的6月龄C57BL/6J小鼠随机分为4组,其中3组为实验组,分别为噪声暴露后1天组(P1)、噪声暴露后7天组(P7)、噪声暴露后14天组(P14),另外1组未经噪声暴露,设为对照组.每组4只小鼠(8只耳蜗),实验组小鼠用110dB SPL白噪声暴露2小时,在噪声暴露后1天、7天和14天分别检测小鼠ABR阈值.之后处死动物取耳蜗器官行免疫荧光染色,观察各组小鼠内外毛细胞、带状突触及线粒体DNA氧化损伤产物8-羟基-2-脱氧鸟苷(8-OHdG)变化.另取16只听力正常的2月龄同品系小鼠,实验分组及方法同上.结果 1)听力学结果:6月龄小鼠P1时各频率阈值与对照组相比均显著提高(P<0.05);P7时小鼠听阈与P1相比有所恢复,P14时小鼠听阈仍显著高于对照组(P<0.05).2月龄小鼠经同等条件噪声暴露后,其听力在P7时基本恢复,P14时则与对照组无显著性差异(P>0.05).2)形态学结果:6月和2月龄小鼠在P1时耳蜗带状突触数量均明显减少,但2月龄小鼠突触数量在P7时明显恢复,P14时则完全恢复,与对照组无明显差异(P>0.05);而6月龄小鼠P14时突触数量仅有部分恢复,其数量仍显著少于对照组(P<0.05).6月龄小鼠经中等强度噪声暴露后中回区域内外毛细胞及纤毛大体上无明显缺失.但是在噪声暴露后各时间点,6月龄小鼠耳蜗毛细胞均可见8-OHdG明显表达.结论 噪声暴露可与听觉老化作用相互叠加,使听力损害程度显著加重,其机制可能与毛细胞内线粒体损伤和带状突触受损有关.
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半胱氨酸链蛋白β在内耳中的表达及其与听功能的相关性研究
目的 研究半胱氨酸链蛋白β(cysteine string proteinβ,CSPβ)在巴马小香猪及出生后不同日龄的C57小鼠内耳组织中的表达,探讨其与听功能的相关性.方法 应用耳蜗冰冻切片免疫荧光染色观察CSPβ在内耳中的表达分布,应用基底膜铺片观察CSPβ随生长发育的表达变化.应用ABR检测C57小鼠发育过程中的听力变化.结果 采用SPSS23.0统计学软件进行各组间单因素方差分析.结果 CSPβ在成年C57小鼠的螺旋神经节以及内毛细胞中均有表达,而在外毛细胞中没有表达;出生12天之前的C57小鼠耳蜗基底膜内毛细胞中都没有CSPβ的表达,直到出生后第12d,内毛细胞中才出现CSPβ的表达,且随着小鼠日龄的增加,CSPβ的表达信号增强,而在外毛细胞中始终没有出现CSPβ的表达.与C57小鼠不同的是,出生1天的小型猪内毛细胞胞中即有CSPβ表达,但在3排外毛细胞中没有表达;ABR结果显示自小鼠出生第14d开始检测到ABR,随着日龄的增加听力越来越成熟.结论 我们推测CSPβ与内毛细胞释放神经递质之间可能存在密切联系,可能是神经递质释放,信息传递以及听觉发生的前提条件之一.
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120dB白噪声对C57BL/6J小鼠听力损失的观察研究
目的 观察120dB宽频带白噪声对C57BL/6J小鼠听阈阈值、耳蜗基底膜毛细胞形态与带状突触数量的影响.方法 :20只听力正常的5-6周龄C57BL/6J小鼠随机分为四组,3组实验组,分别为给予白噪声后立即测量组(0d)、噪声暴露后7天测量组(7d)、噪声暴露后14天组(14d);1组对照组.每组5只小鼠(n=10),实验组小鼠120dB白噪声暴露2h,0d组立即测量小鼠听阈,7天和14天应用相同方法 测量小鼠听阈值,并计算出每只小鼠噪声暴露前后的阈移值.各组测量阈值后立即处死取耳蜗用4%多聚甲醛固定后进行免疫荧光染色和扫描电镜检查,观察小鼠带状突触与内外毛细胞形态变化并计数.结果 噪声暴露2h后即刻组其各个频率5只小鼠(n=10)阈值均未引出,暴露后七天小鼠听阈部分恢复(P<0.01).暴露后第14天,14天组各频率的听阈继续恢复,但与暴露前的差异较第7天比有所减小,但仍有统计学差异(所有P<0.01).并且观察到带状突触明显减少,扫描电镜观察外毛细胞纤毛有倒伏粘连.结论 120dB白噪声噪声暴露2小时能够造成小鼠听力永久性阈移,外毛细胞明显损伤,带状突触数量明显减少.
关键词： 永久性阈移 带状突触 噪声性耳聋 C57BL/6J小鼠 耳聋 -
MicroRNA调控神经突触囊泡循环的研究进展
microRNAs(miRNAs)是一类大约含有22个核苷酸的单链非编码小分子RNA,通过对mRNA转录及稳定性的负向调控对基因表达具有重要作用.miRNAs在脑组织中大量表达,对神经元的生长发育以及神经功能的调节均发挥重要作用.神经信号传递始于神经递质从突触囊泡的释放.突触囊泡需要经历释放-回收的动态过程以维持突触前终末的结构和功能的完整性,此过程称之为囊泡循环.随着研究的深入,发现miRNA在神经突触中起着重要的作用.本文将对miRNA对神经突触囊泡循环的调节作用做一综述.
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膳食铁过量诱导的2型糖尿病雄性小鼠听力脑干反应及耳蜗带状突触损伤的初步研究
目的 探讨2型糖尿病对雄性小鼠听力脑干反应(ABR)和耳蜗带状突触的作用.方法 将24只健康6周龄清洁级雄性C57BL/6J小鼠按体重随机分为2组,分别为对照[饲料含铁量为(8.26±2.67) mg/kg]组和糖尿病[饲料含铁量为(8.39±1.03) g/kg]组,每组12只.分别于喂养第0、4、8、12、16周监测血糖,第16周测定血红蛋白、血清铁、血清铁蛋白、总铁结合力、转铁蛋白饱和度,并进行葡萄糖耐量及胰岛素耐量测验,采用ABR检测.应用免疫荧光检测左侧耳蜗基底膜C末端结合蛋白2(CtBP2)、囊泡谷氨酸转运体3(VGLUT3)、肌球蛋白Ⅶa(MyosinⅦa)在耳蜗内外毛细胞分布,分离右侧耳蜗进行HE染色.结果 与对照组比较,糖尿病组小鼠血清铁、血清铁蛋白、转铁蛋白饱和度均升高,差异有统计学意义(P＜0.05);而血红蛋白、总铁结合力均无明显改变.与对照组比较,糖尿病组小鼠血糖水平在喂养8周后明显升高,喂养16周时胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)明显升高,差异均有统计学意义(P＜0.05).与对照组比较,糖尿病组小鼠血糖水平在葡萄糖耐量试验的60、120 min时较高,差异有统计学意义(P＜0.05);而在15、30 min时仅略有升高.与对照组比较,胰岛素耐量实验各检测时间点糖尿病组小鼠血糖水平均较高,差异有统计学意义(P＜0.05).与对照组比较,糖尿病组小鼠在2、3 kHz下的ABR阈值较高,差异均有统计学意义(P＜0.05):而在1、4kHz下的ABR阈值仅略有升高.糖尿病可造成小鼠内毛细胞CtBP2标记带状突触数量减少,但在耳蜗毛细胞中VGLUT3、MyosinⅦa免疫荧光阳性反应未受影响,另外,耳蜗Corti氏器、螺旋神经节细胞及神经丝未见损伤.结论 膳食铁过量诱导的2型糖尿病小鼠可能出现内耳毛细胞带状突触数量减少,从而扰乱小鼠听力脑于反应,呈现高频段小鼠听力损伤.
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庆大霉素对耳蜗内毛细胞带状突触数量的影响
目的 探讨庆大霉素对耳蜗内毛细胞带状突触数量的影响及其意义.方法 C57小鼠每日庆大霉 素(100mg/kg)进行腹腔注射,分别于第4d、第7d、第10d、第14d取耳蜗基底膜顶回作为实验组(每组5只);取正常小鼠(5只)耳蜗基底膜顶回作为对照组.使用免疫荧光双标法对突触前膜RIBEYE和突触后膜GluR2&3进行标记,激光共聚焦显微镜进行光学连续切片,3D MAX进行三维建模,对内毛细胞带状突触进行计数.结果 所有小鼠内毛细胞均无缺失,但内毛细胞带状突触数量存在差异(P
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卡那霉素对小鼠耳蜗内毛细胞带状突触数量的影响
目的 通过研究卡那霉素对小鼠耳蜗内毛细胞带状突触数量的影响,探讨卡那霉素耳毒性的发病机制.方法 实验组昆明小鼠分为6组,每组10只,每日丁胺卡那霉素( 400mg/kg)进行肌肉注射,并于第0d、第3d、第7d、第10d、第14d、和第21d取耳蜗基底膜顶回作为标本.对照组(每组10只)采用等体积生理盐水肌肉注射.使用免疫荧光双标法对耳蜗内毛细胞带状突触前膜RIBEYE蛋白和突触后膜GluR2&3蛋白进行标记,激光共聚焦显微镜对耳蜗基底膜顶回进行光学连续切片,运用3d Max8.0软件对带状突触进行三维建模及重构,并观察带状突触形态变化和计算其数量改变.结果 所有小鼠耳蜗内毛细胞轮廓完整,但内毛细胞带状突触数量存在差异.与生理盐水对照组相比,在卡那霉素注射初期带状突触数量未见明显变化,给药第7d时内毛细胞带状突触数量显著增加,第21d显著下降.结论 卡那霉素连续作用21d,耳蜗内毛细胞带状突触数量呈先增高后降低的趋势.
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三维建模方法分析耳蜗内毛细胞带状突触数量
目的 利用三维建模的方法对耳蜗内毛细胞带状突触进行计数分析,解决由于内毛细胞带状突触数量少、位置深在造成的计数困难,为内毛细胞带状突触的可塑性研究提供有效可靠城的计数方法.方法 取小鼠耳蜗基底膜,使用免疫荧光双标记的方法对突触前RIBEYE和突触后膜GluR2&3进行标记,激光共聚焦显微镜进行光学连续切片,每个荧光色对代表一个突触的存在.使用3ds max进行三维建模,对内毛细胞带状突触进行计数.结果 耳蜗基底膜内毛细胞的带状突触显示清晰,每个内毛细胞的带状突触数量为(16.10±1.03)个.结论 利用免疫荧光双标,激光共聚焦显微镜光学连续切片,3ds max三维建模所得的内毛细胞带状突触数量准确,方法简单可行,是一种对内毛细胞带状突触进行计数的可靠方法.
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长时程低强度噪声暴露对豚鼠内毛细胞带状突触的影响分析
目的 观察日常生活可遇低强度噪声多次暴露对豚鼠耳蜗带状体突触的损失和恢复,以及对听觉功能的影响.方法 对豚鼠行95dB声压级白噪声环境下4h/d暴露,连续暴露7d,于噪声后1d、1周、1个月分组行听力学检查,并与对照组动物比较(每组10只),以免疫荧光法双标法对突触前膜Ctbp2和突触后膜PSD95进行标记并计数.结果 长时程、低强度噪声暴露后听觉脑干诱发电位阈值提高(P<0.05),豚鼠内毛细胞排布、形态、数量均无明显改变,但内毛细胞带状突触数量有明显减少(P<0.05)并有不完全恢复.结论 "安全剂量"低强度噪声多次暴露后可造成可逆听觉阈值升高,伴随内毛细胞带状体突触的明显减少和不完全恢复.
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庆大霉素对内毛细胞带状突触CaV1.3钙离子通道蛋白表达的影响
目的:研究庆大霉素对C57BL/6J小鼠听力及耳蜗内毛细胞带状突触CaV1.3钙通道蛋白数量的影响,探讨听力损失与其剂量相关性变化之间的关系及意义.方法:采用固定剂量[100 mg/(kg·d)]的氨基苷类抗生素(庆大霉素)对C57BL/6J小鼠每日进行腹腔注射造模,分别在注射后的第7天、第14天、第28天(注射14d停药14 d)应用ABR分别测得小鼠的听力.免疫荧光方法观察耳蜗基膜内毛细胞带状突触CaV1.3钙通道蛋白的分布和表达(其中o天为空白对照组),内毛细胞突触前后膜分别采用CtbP2和CaV1.3进行免疫荧光标记.结果:随着注射药物天数的增长ABR反应阈值明显提高,所有小鼠内毛细胞数量、形态均无明显变化,但内毛细胞带状突触CaV1.3钙离子通道蛋白量的表达存在显著差异(P＜0.01). CaV1.3钙离子通道蛋白在庆大霉素腹腔注射CaV1.3/CtBP2表达数量在第7天时略有增加,在第14天时其表达数量明显减少,第28天与第14天比较CaV1.3/CtBP2表达数量有所增加,但低于正常.结论:在氨基苷类抗生素毒性环境中耳蜗内毛细胞CaV1.3蛋白表现为先增加后减少再增加的趋势,提示内毛细胞带状突触CaV1.3蛋白数量的增加可能存在对这类药物毒性的代偿作用,而随着药物毒性作用时间的增加,这种失代偿作用表现为听力下降,可能是损伤听力的机制之一.
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C57B L／6J 小鼠随年龄增长耳蜗内毛细胞带状突触数量变化的观察
目的：探讨C57BL／6J小鼠随年龄增长耳蜗内毛细胞带状突触（ribbon synapses ，RS ）的数量变化情况。方法分别取2、6、10、12月龄C57BL／6J小鼠耳蜗基底膜（每组5只），应用免疫组织化学染色方法对RS前、后膜进行双重标记，激光共聚焦显微镜下定位成像，并应用三维重建技术对基底膜各段RS的数量进行计数。结果与2月龄小鼠相比较，6月龄C57BL／6J小鼠耳蜗基底膜RS数量减少主要发生在底回，10月龄时各回RS数量均明显减少，12月龄时顶回、中回 RS数量继续减少，底回反而有少许增多。结论 RS 数量减少可能发生在C57BL／6J小鼠老年性聋的早期阶段，探索阻止RS数量减少的治疗措施可能成为早期干预老年性聋的重要途径。
关键词： C57BL/6J小鼠 内毛细胞 带状突触 -
铁缺乏对仔鼠内毛细胞带状突触的影响
目的：研究耳蜗内毛细胞带状突触在发育期铁缺乏过程中的变化特点。方法用普通饲料喂饲成熟雌性大鼠1周后，将其分成对照组和铁缺乏组，并分别给予普通饲料和铁缺乏饲料，2周后交配。仔鼠出生21 d断乳，出生40 d麻醉后行ABR听阈检测；ABR检测后，仔鼠经心脏采血，检测血红蛋白、平均红细胞容积、血清铁蛋白和血清铁；然后留取耳蜗，基底膜剥离，分别用CtBP2和VGLUT3进行免疫荧光标记，Dapi染核，激光共聚焦显微镜观察。结果发育期铁缺乏致仔鼠血清铁蛋白明显降低（P＜0.05），而血红蛋白、平均红细胞容积和血清铁均无明显改变（P＞0.05）；发育期铁缺乏并未明显改变仔鼠ABR听阈（P＞0.05），但P3与P1波间期延长（P＜0.05）。另外，发育期铁缺乏降低CtBP2、VGLUT3表达水平。结论发育期铁缺乏可引起仔鼠内毛细胞带状突触形态和功能改变。
