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hBMP-2基因转染兔骨髓间充质干细胞体内移植后hBMP-2的活性检测
目的 探究人骨形态发生蛋白-2(human bone morphogenetic protein-2,hBMP-2)基因植入兔股骨头坏死模型体内后的活性,为后续实验奠定理论基础.方法 1.采用髓芯减压联合液氮冰冻法制备兔股骨头坏死模型;2.将造模成功的兔子随机分为A、B、C3组(n=12),A组不植入材料,为对照组,B、C组分别植入DBM/BMSCs、hBMP-2/BMSCs/DBM;3.术后第1、第2、第3周各组分别处死4只兔子,分别运用PCR、RTFQ-PCR、Western Blot检测股骨头内hBMP-2基因和蛋白的表达量,评估hBMP-2基因在兔体内的活性.结果 植入后,在第1、第2、第3周,PCR结果示:A、B两组hBMP-2基因呈阴性表达,C组hBMP-2基因呈阳性表达;RTFQ-PCR示:C组相对表达量分别为1,0.947±0.025,0.895±0.059,P=0.081;Western blot示:A、B两组hBMP-2蛋白在兔体内呈阴性表达,C组hBMP-2蛋白呈阳性表达;凝胶成像系统分析显示:C组hBMP-2蛋白表达灰度值(目的/内参)分别为:0.530±0.056、0.507±0.066、0.475±0.086,且两两之间比较P＞0.05.结论 hBMP-2基因转染BMSCs植入兔股骨头坏死模型体内后能够稳定表达,进而能够持续诱导BMSCs向骨细胞分化,达到修复股骨头坏死的目的.
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珊瑚羟基磷灰石负载含BMP-2纳米缓释微球体系促进人间、充质干细胞骨形成的研究
目的 探讨珊瑚羟基磷灰石负载含骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)纳米缓释微球体系在促进人间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)骨形成中的作用.方法 从骨移植患者中收集hMSCs,分离培养后使用BMP-2纳米微球作为载体,装载到珊瑚羟基磷灰石(coral hydroxyapatite,CHA)支架上.将CHA-BMP-2-hMSCs与CHA-hMSCs分别植入两组小鼠的L4和L5横向软组织中,10周后检测小鼠碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,通过Western blot检测Runx2蛋白与骨桥蛋白表达水平,通过显微镜观察骨质生长情况.结果 CHA-BMP-2-hMSCs小鼠的支架上骨组织覆盖面积显著大于CHA-hMSCs小鼠,ALP活性显著高于非缓释组小鼠,骨钙素、Runx2蛋白与骨桥蛋白表达水平高于非缓释组小鼠.结论 CHA-BMP-2-hMSCs缓释系统有利于在较长时间内诱导骨形成.
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不同植骨材料在腰椎融合过程中的应用及转化生长因子β的表达
背景:骨形态发生蛋白单独应用于骨移植效果不佳.而转化生长因子β能明显增强其在体内的诱导成骨作用.目的:观察自体骨及重组人骨形态发生蛋白2复合骨用于兔腰椎融合过程中转化生长因子β的基因表达.方法:将新西兰大白兔60只随机分为自体骨组、复合骨组和异体骨组,别于双侧L5-6横突间植入自体骨、重组人骨形态发生蛋白2复合骨及异体骨.植入后7,4,1,8,5 d取3组节段骨痂,用实时荧光定量RT-PCR检测转化生长因子β的基因表达水平.结果与结论:植入后28 d,合骨组转化生长因子β达峰值,后有所下降,均高于自体骨组和异体骨组(P < 0.05).结果证实,组人骨形态发生蛋白2复合骨缓释重组人骨形态发生蛋白2,效地促进了转化生长因子β的表达,显增强了体内的诱导成骨效应.
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人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2双基因共表达腺病毒载体的构建及鉴定
背景:内部核糖体进入位点序列载体能将上下游基因共同转录,故通过此载体可使连接在一起的人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2同时高表达,可为骨缺损的治疗提供新方法.目的:实验通过引入内部核糖体进入位点序列,采用基于attLXattR的λ噬茵体位点特异性重组系统的GatewayTM技术构建带有人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2双基因重组腺病毒载体并进行鉴定.方法:用聚合酶链反应方法扩增人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2目的基因,将两个基因亚克隆至pIRES2-EGFP载体中,构建phBMP2-IRES-hFGF2载体,通过BP反应将hBMP2-IRES-hFGF2重组到载体pDONR221中,再通过LR反应将其转移到腺病毒载体pAd/CMV/V5-DEST中,线性化后转染293细胞进行包装获得重组腺病毒Ad-hBMP2-IRES-hFGF2.结果与结论:phBMP2-IRES-hFGF2经酶切及测序鉴定正确,带hBMP2-IRES-hFGF2的载体在293细胞中包装成功,获得成熟的病毒颗粒,病毒滴度为2.82×1010 ifu/mL,证实成功构建了带有人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2双基因重组腺病毒载体.
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人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2双基因共表达腺病毒载体转染人骨髓基质干细胞后的细胞增殖
背景:利用重组腺病毒载体转染外源性基因到组织工程骨的种子细胞是骨缺损基因治疗研究的热点.目的:用人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2双基因共表达腺病毒载体转染人骨髓基质干细胞,以探讨基因转染对人骨髓基质干细胞增殖的影响.方法:将Ad-hBMP2-IRES-hFGF2转染至人骨髓基质干细胞中,荧光显微镜观察转染效果,RT-PCR方法观察人骨形态发生蛋白2 cNDA和人成纤维细胞生长因子2 cNDA在人骨髓基质干细胞中的转录情况,Wester blot 方法检测人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2蛋白表达情况,锥虫蓝测定细胞活力,流式细胞仪分析其对细胞增殖的影响.结果与结论:转染后人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2基因在mRNA水平和蛋白水平均有表达,细胞活力无明显变化,流式细胞仪分析细胞周期中增殖细胞比例明显增加.说明该双基因可高效转染人骨髓基质干细胞,且促进细胞增殖.
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重组腺病毒介导的骨形态发生蛋白9与骨形态发生蛋白2复合纳米羟基磷灰石/聚酰胺多孔支架修复桡骨缺损的比较
背景:课题组采用新的重组腺病毒介导的基因表达手段,与传统方法比较具有高效、方便、安全等优点,可作为进入临床基因治疗应用的潜在有力手段.目的:比较腺病毒介导的人骨形态发生蛋白9(Adv-hBMP-9)与腺病毒介导的人骨形态发生蛋白2(Adv-hBMP-2)分别复合纳米羟基磷灰石/聚酰胺多孔支架材料修复重建桡骨缺损的效果.方法:新西兰白兔36只,随机分成3组,制成双侧桡骨中段13 mm骨缺损模型.分别植入Adv-hBMP-9+纳米羟基磷灰石/聚酰胺骨、Adv-hBMP-2+纳米羟基磷灰石/聚酰胺骨、Adv-GFP+羟基磷灰石,聚酰胺骨.植入后进行大体观察、X射线摄片、组织学检测.结果与结论:BMP-9组骨缺损完全修复,BMP-2组骨缺损部分修复,而GFP对照组骨缺损修复明显欠佳.提示重组腺病毒介导的BMP-9对桡骨骨缺损后的成骨修复作用强于BMP-2.
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缓释型重组人骨形态发生蛋白2/壳聚糖生物骨修复材料诱导骨形成
背景:重组人骨形态发生蛋白2在体内半衰期短、易降解代谢,达不到理想的骨再生效果.目的:制备缓释型重组人骨形态发生蛋白2/壳聚糖生物骨修复材料,并观察其缓释性能、骨诱导活性.方法:将重组人骨形态发生蛋白2与壳聚糖混合制备壳聚糖膜,涂覆于生物骨修复材料表面,ELISA方法检测其体外释药性能.茜素红染色检测缓释型人骨形态发生蛋白2/壳聚糖生物骨材料、重组人骨形态发生蛋白2生物骨材料、单纯骨填充材料诱导C2C12细胞骨钙蛋白的形成,观察其诱导成骨细胞能力.同时将3种骨修复材料植入清洁级KM小鼠股部肌袋内,2周后检测新生骨Ca2+离子含量,评价其异位骨诱导能力.结果与结论:材料表面的壳聚糖膜分布均匀,负载的重组人骨形态发生蛋白2呈团簇状.重组人骨形态发生蛋白2/壳聚糖生物骨修复材料体外释药存在突释,前4 d释放量达总药量的50%,持续至12 d,释药量达到90%,第18天时释放完全.与单纯骨填充材料、重组人骨形态发生蛋白2生物骨材料相比,缓释型人骨形态发生蛋白2/壳聚糖生物骨修复材料诱导C2C12细胞向成骨晚期分化能力与异位骨形成能力显著增强(P < 0.05).结果提示缓释型人骨形态发生蛋白2/壳聚糖生物骨修复材料缓释性能好,促进骨形成能力强.
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构建含双顺反子绿色荧光蛋白标记人骨诱导形成蛋白2真核表达载体
背景:腺病毒虽可携带骨诱导形成蛋白2基因转染靶细胞促进其分泌诱导形成蛋白2,但容易出现一些免疫应答反应,以质粒为载体的转染实验应具有良好的前景.目的:验证构建绿色荧光蛋白标记的人骨诱导形成蛋白2真核表达载体的可行性.设计:单一样本观察.单位:天津医院.材料:实验于2006-03/2007-03在天津医科大学卫生部激素与发育重点实验室(国家级)完成.含完整hBMP2基因片段的pcDNA3.1/CT-人骨诱导形成蛋白2质粒由李曦铭博士惠赠.双顺反子真核表达载体pSELECT-GFPzeo-MCS为Invivogen公司产品,Zeo购自Invivogen公司.pTA2(R)-T Easy为鼎国生物技术有限公司产品,限制性内切酶BamHI和NheI、T4 DNA连接酶(晶美生物工程有限公司),PCR上下游引物合成及测序(北京奧科生物技术有限责任公司).方法:以重组质粒pcDNA3.1/CT-人骨诱导形成蛋白2为模板,结合已设计好的特异性引物,采用PCR方法亚克隆出人骨诱导形成蛋白2目的片段,将该片段分别与克隆载体pTA2-T-easy和双顺反子真核表达载体pSELECT-GFPzeo-MCS连接,转化入感受态DH5α细胞中,通过筛选得到含有绿色荧光蛋白的重组表达载体pSELECT-GFPzeo-人骨诱导形成蛋白2.主要观察指标:采用PCR法鉴定人骨诱导形成蛋白2序列,同时进行酶切及测序鉴定人骨诱导形成蛋白2是否克隆入pTA2-人骨诱导形成蛋白2重组质粒及真核表达载体pSELECT-GFPzeo-MCS中.结果:PCR获得长度约1216bp的目的片段,经与克隆载体pTA2-T-easy和真核表达载体pSELECT-GFPzeo-MCS连接,筛选及序列分析后,证实所插入目的片段与GenBank检索的BMP2cDNA序列(NM-001200)100%匹配.结论:成功构建含双顺反子绿色荧光蛋白标记人骨诱导形成蛋白2真核表达载体.
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BMP-2对大鼠骨髓间充质干细胞成骨作用的影响
目的:携带骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)基因的慢病毒载体感染大鼠骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)后,观察BMP-2对BMSCs成骨作用的影响.方法:原代培养大鼠BMSCs并进行传代及鉴定,用携带BMP-2的慢病毒感染第3代BMSCs后,进行骨向诱导,通过茜素红染色观察钙沉积.观察细胞黏附能力及对成骨标志分子骨桥蛋白(OPN)、骨钙素(OCN)、胶原蛋白I(Col-I)及smad(drosophila mothers against decapentaplegic protein)表达的影响.采用SPSS11.0软件包对数据进行统计学分析.结果:①原代培养出大鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定;②携带BMP-2和EGFP的慢病毒感染第3代BMSCs后,免疫荧光检测和RT-PCR及WB检测感染成功;③大鼠骨髓间充质干细胞感染慢病毒后进行骨向诱导,钙沉积明显增加;④BMSCs细胞黏附能力增强;⑤ OPN、OCN、Col-I及smad表达增加.结论:BMP-2通路增强了细胞黏附及相关成骨分化因子的表达,可明显促进大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向分化,为BMSCs作为组织工程研究的种子细胞提供实验支持.
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携带BMP-2基因的慢病毒感染大鼠骨髓间质干细胞定向分化
目的 构建含有人骨形态发生蛋白2(human bone morphogenetic protein 2, hBMP2)cDNA的重组慢病毒DNA,在293T细胞中进行慢病毒包装和表达检测.用慢病毒感染大鼠骨髓间质干细胞后,观察其向成骨细胞分化的情况.方法 从GenBank中调出hBMP2基因序列,设计带有NheⅠ、AgeⅠ酶切位点引物.从人肝脏组织中抽提总RNA,再反转录成cDNA,扩增出hBMP2 cDNA的全长序列.测序验证后克隆到慢病毒载体pHIV-CS-CDF-CG-PRE上,通过PCR扩增、酶切、测序等方法鉴定重组慢病毒DNA.将该重组慢病毒DNA同辅助质粒一起共感染293T细胞,通过重组而包装成能表达hBMP2基因的有活性的慢病毒.慢病毒感染大鼠骨髓间质干细胞,通过碱性磷酸酶(AP)、钙沉积定量测定、Ⅰ型胶原蛋白表达观察干细胞向成骨细胞转化的情况.结果 ①扩增出1.2 kb左右的hBMP2全长cDNA与GeneBank中的hBMP2阅读框架序列完全一致;②成功构建和克隆了含hBMP2基因的慢病毒重组DNA(pHIV -hBMP2);③对重组慢病毒DNA进行了成功包装和分析.④大鼠骨髓间质干细胞感染慢病毒后,碱性磷酸酶分泌增加,钙沉积增加,Ⅰ型胶原蛋白表达增加,成功向成骨细胞转化.结论 重组慢病毒携带hBMP2基因感染大鼠骨髓间质干细胞可以使其向成骨细胞定向分化,为组织工程研究提供良好的种子细胞.
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重组人BMP-2生物活性的鉴定
鉴定在大肠杆菌中表达的重组人骨形态发生蛋白2(recombinant human bone morphogenetic pro-tein-2,rhBMP-2)的生物学活性.构建重组人BMP-2的原核表达质粒,在大肠杆菌中诱导表达目的蛋白,纯化复性后,采用细胞及动物实验对其生物活性进行鉴定.细胞实验表明,重组人BMP-2具有诱导MC3T3-E1前成骨细胞向成骨细胞分化的特性.动物实验显示,重组人BMP-2在大鼠肌肉内具有诱导异位成骨功能.制备的重组人BMP-2具有较好的生物学活性.
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BMP-2对间充质干细胞促迸造血干细胞增殖的影响及其机制
目的 探讨人骨形态发生蛋白2(BMP-2)对间充质干细胞(MSC)促迸造血干细胞(HSC)增殖的影响及其机制.方法 采用全骨髓贴壁法体外扩增成人骨髓MSC至第3代,采用流式细胞术鉴定MSC纯度为52.4%;通过miniMACS磁珠分选仪从骨髓中分选人骨髓CD34 +细胞即HSC,并用流式细胞术鉴定其纯度为81.9%;利用Transwell非接触共培养骨髓CD34 +细胞与第3代MSC,计数造血干细胞,确定HSC增殖快的时间点为共培养的第7天.将细胞分为六组,HSC组、MSC组单细胞培养,MSC+BMP-2组、HSC+BMP-2组分别加入100 ng/mL BMP-2共培养,HSC+MSC组两种细胞共培养,HSC+MSC+BMP-2组两种细胞与100 ng/mL BMP-2共培养.在培养第7天时,采用细胞计数板计数HSC数量,采用实时荧光定量qPCR法检测增殖指数Ki67及促血管形成相关因子血管生成素受体(Tie2)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素1(Ang1)mRNA表达.结果 HSC组、HSC+BMP-2组、HSC+MSC 组、HSC +MSC +BMP-2组HSC数量分别为(15.37 ±0.42)、(37.81 ±1.07)、(117.00 ± 2.53)、(129.06 ±5.13)×104个,组间比较P<0.05或<0.01.HSC组、HSC+BMP-2组、HSC+MSC组、HSC+MSC+BMP-2组Ki67及Tie2 mRNA相对表达量逐渐升高,MSC组、MSC+BMP-2组、HSC+MSC组、HSC+MSC+BMP-2组VEGF、Ang1 mRNA相对表达量逐渐升高,组间比较P<0.05或<0.01.结论 BMP-2可协同MSC促迸HSC增殖,其机制可能与BMP-2促迸促血管形成相关因子VEGF、Ang1和Tie2表达有关.
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人骨形态发生蛋白2真核表达载体构建及其基因/
目的：构建人骨形态发生蛋白（BMP）2的真核表达型载体，并利用其与壳聚糖制备纳米复合体。方法体外利用双酶切法将pMD18T-hBMP2-His质粒与pIRES2-EGFP真核表达载体连接，构建pIRES2-EGFP-hBMP2-His真核表达载体；采用5种不同相对分子质量及脱乙酰度的壳聚糖，通过去溶剂法在不同N/P比（壳聚糖中的胺基含量与质粒中磷酸基含量的摩尔比）情况下制备壳聚糖/pIRES2-EGFP-hBMP2-His纳米复合体。ZetaPALS电位及粒度分析仪检测纳米复合体的粒径大小、分布及Zeta电位，琼脂糖凝胶电泳分析及荧光分光法评定壳聚糖对pIRES2-EGFP-hBMP2-His纳米复合体的包裹情况，原子力显微镜观察粒径形貌。结果1）成功构建pIRES2-EGFP-hBMP2-His真核表达载体，并经酶切、测序证实；2）成功制备壳聚糖/pIRES2-EGFP-hBMP2-His纳米复合体，壳聚糖对pIRES2-EGFP-hBMP2-His质粒具有包裹作用；3）制备的壳聚糖/pIRES2-EGFP-hBMP2-His复合体呈球状，粒径为111.7~3214.2nm，Zeta电位为4.93~16.79mV。结论壳聚糖可与pIRES2-EGFP-hBMP2-His复合形成纳米微粒。
