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  • PIK-75对体外细粒棘球蚴原头节的作用研究

    作者:杨仁坦;姜玉峰;邢国强;汤光耀;史红娟;秦文娟;李佳洁;吕海龙

    目的 探讨不同浓度PIK-75体外对细粒棘球蚴原头节生长作用及形态学的影响. 方法 将体外培养的细粒棘球蚴原头节分为空白对照组及PIK-75处理组(0.4、0.8、1.2、1.6及2.0 μmol/L),处理后的原头蚴用经0.1%伊红染色,置于倒置显微镜下观察原头节的形态及活力,试验独立重复3次并绘制活力曲线图.用Caspase-3试剂盒检测作用24、48 h后各浓度组原头节体内caspase-3酶活性;使用ELISA试剂盒测定不同浓度PIK-75作用后原头节体内抗氧化酶HO-1及NQO-1的活性变化. 结果 PIK处理组原头节的形态结构发生变化,活力减弱,以2.0tmol/L时组原头节变化更明显,且在第6d时原头节均发生死亡.随着药物浓度的增高,PIK-75对细粒棘球蚴原头节生长的抑制作用越强.0.8 μmol/I PIK-75处理组作用24 h后原头节活性开始下降,在第3d约为67.4%,作用7d后活力为32.1%,空白对照组原头节形态及活力无明显变化.不同浓度PIK-75作用细粒棘球蚴原头节24、48 h后caspase-3酶活性显著高于空白对照组(P<0.05).0.8 μmol/L PIK-75作用原头节2d、5d后,HO-1活性分别为(704.265±5.082) pg/ml和(656.05±0.095) pg/ml,NQO-1活性分别为(2.236±0.018) ng/ml和(1.446土0.026 ng/ml),与空白对照组比较显著降低(P<0.05),且作用5d后的原头节酶活性显著低于作用2d组(P<0.05). 结论 PIK-75能抑制体外细粒棘球蚴原头节的生长,降低抗氧化酶的活性,具体机制有待进一步研究.

  • 去氢骆驼蓬碱体外诱导细粒棘球蚴原头节凋亡过程中caspase-3及抗氧化酶活性检测分析

    作者:巩月红;高惠静;卢帅;郑璇;文丽梅;陈蓓;赵军;王建华

    目的 观察不同浓度去氢骆驼蓬碱体外诱导细粒棘球蚴原头节生长凋亡过程中虫体活力、Caspase-3及相关抗氧化酶活性变化. 方法 将体外培养的细粒棘球蚴原头节分为空白对照组、溶剂组、阿苯达唑(ABZ)阳性对照组及不同浓度去氢骆驼蓬碱(25、50 μmol/L)处理组进行体外干预试验,于48、96、144、192、240、288 h后取样,经0.1%伊红染色后置于倒置显微镜下观察原头节活力.试验重复验证3次,绘制活力曲线图.用ELISA试剂盒检测作用48 h、96h后各浓度组原头节caspase-3及抗氧化酶HO-1和NQO-1的活性变化. 结果 去氢骆驼蓬碱处理组从作用第48 h开始原头节活力开始下降,培养至第240 h时25 μmol/L组原头节死亡率为97.9%,50 μmol/L组原头节均死亡.ELISA法测定25、50 μmol/L去氢骆驼蓬碱作用原头节48 h后caspase-3活性分别为(32.776±8.437) ng/ml和(52.129±5.949)ng/ml,与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);ELISA法测定25、50 μmol/L去氢骆驼蓬碱作用48、96 h后原头节抗氧化酶HO-1和NQO-1活性分别为(0.563±0.031)ng/ml、(1.832±0.10)ng/ml和(0.425±0.011)ng/ml、(1.288±0.05)ng/ml,差异均有统计学意义(P<0.05),且呈时间及剂量依赖性. 结论 去氢骆驼蓬碱能抑制体外培养的细粒棘球蚴原头节的生长,并能降低caspase-3及抗氧化酶活性,具体机制有待进一步研究.

  • 细粒棘球蚴原头节mRNA测序及生物信息学初步分析

    作者:朱明星;王娅娜;巨艳;王志昇;朱佳佳;赵巍

    目的 利用RNA-seq技术对细粒棘球蚴原头节的转录组进行测序并对测序数据进行生物信息学分析,以揭示细粒棘球蚴原头节mRNA所包含的信息. 方法 用Trizol法提取原头节总RNA,分离mRNA,利用Illumina公司的HiSeq2000高通量测序仪对mRNA序列进行测序.参考英国桑格研究院(Wellcome Trust Sanger Institute)公布的细粒棘球绦虫基因组数据,对测序数据进行拼接组装,将获得的unigene与非冗余的蛋白序列数据库(non-redundant,Nr)、全球蛋白资源数据库(universal protein,UniProt)、基因本体数据库(gene ontology,GO)以及日本京都基因和基因组百科全书通路数据库(the kyotoencyclopedia of genes and genomes pathway,KEGG pathway)进行比对,获得该unigene的蛋白功能注释信息. 结果 测序后共获得132 007 609条读段(reads),经过组装共形成91 342条unigene,平均长度为419 bp.通过GO分类注释,共有36 552个unigene获得了注释信息,分别归入到了生物学过程、分子功能、细胞组分3大类共计48个功能组.通过KEGG pathway的注释,有6 664条unigene注释到了KEGG上,参与了6大类生物过程中34个小类的代谢,共有227个代谢通路. 结论 获得了细粒棘球蚴原头节转录组相关信息,为棘球蚴病的后续研究提供了研究数据,积累了研究资料.

  • siRNA特异性干扰EgRad9基因表达对细粒棘球蚴原头节DNA氧化损伤机制的影响

    作者:郑璇;卢帅;赵军;吕国栋;文丽梅;李亚芬;田春艳;王建华

    目的 研究小干扰RNA (small interfering RNA,siRNA)特异性干扰EgRad9基因表达后对细粒棘球蚴原头节DNA氧化损伤机制的影响. 方法 利用电穿孔法将EgRad9-siRNA干扰序列和阴性对照干扰序列转染细粒棘球蚴原头节,实验分为EgRad9-si RNA-354、-614、-971干扰组,阴性对照组和空白对照组.电转染3d后,加入自然状态下原头节大耐受浓度的H2O2处理1h,伊红染液染色后,倒置荧光显微镜下观察原头节活性并计算存活率.收集各组原头节的培养液,进行碱性磷酸酶活性的检测.电转染3 d后,加入自然状态下原头节耐受H2O2的大耐受浓度处理1h后,TRIzol法提取总RNA.实时荧光定量PCR (qRT-PCR)检测EgRad9mRNA的表达.采用彗星实验检测干扰EgRad9基因表达后细粒棘球蚴原头节DNA氧化损伤情况,活性氧(reactive oxygen species,ROS)检测试剂盒检测干扰EgRad9基因表达后细粒棘球蚴原头节体内ROS的含量,采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析 结果 自然状态下细粒棘球蚴原头节体外耐受H2O2的大浓度为0.4 mmol/L,干预时间为1h;电穿孔法可将绿色荧光干扰序列有效的导入原头节体内,实验组和阴性对照组的原头节体内均有明亮的绿色荧光斑点;而空白对照组原头节体内无绿色荧光斑点.EgRad9-siRNA-354、-614、-971干扰组原头节的存活率分别为(42.99±4.03)%、(29.86±5.87)%和(56.48±4.64)%,初步筛选有效干扰序列为EgRad9-siRNA-614. siRNA-354、-614、-971干扰组碱性磷酸酶活性分别为0.024±0.001、0.004±0.001、0.039±0.002,其中EgRad9-siRNA-614组碱性磷酸酶活性与阴性对照组(0.095±0.001)和空白对照组(0.099±0.001)相比,差异均有统计学意义(t=10.227、10.934,均P<0.01),表明该组原头节EgRad9基因经干扰后对其活性影响大,有效干扰序列为EgRad9-siRNA-614.EgRad9-siRNA-354、614、971干扰组EgRad9 mRNA表达量分别为0.432±0.055、0.291±0.079、0.612±0.032,其中经EgRad9-siRNA-614序列干扰后,EgRad9 mRNA表达量与阴性对照组(1.001±0.020)和空白对照组(1.001±0.012)相比均显著下调(t=7.874、7.663,均P<0.01),可确定有效干扰序列为EgRad9-siRNA-614.相同电泳条件下,EgRad9-siRNA-614干扰组原头节DNA碎片离开核向阳极迁移,形成拖尾;EgRad9-siRNA-614干扰组彗星尾距OTM值为13.901±2.263,与阴性对照组(0.074±0.020)和空白对照组(0.047±0.034)相比,差异有统计学意义(t=12.845、13.251,均P<0.01).经EgRad9-siRNA-614序列干扰后,原头节体内ROS含量为13.024±0.154,与阴性对照组(2.728±0.083)和空白对照组(2.555±0.007)相比,差异有统计学意义(t=9.296、10.134,均P<0.01). 结论 EgRad9基因在细粒棘球蚴原头节DNA氧化损伤过程中发挥重要作用,EgRad9-siRNA-614干扰片段可特异性干扰EgRad9基因的表达,并降低原头节修复DNA氧化损伤的能力.

  • 氯舒隆和奥硝唑体外抗细粒棘球蚴原头节和多房棘球蚴的效果评价

    作者:辛奇;高海军;宋晓霞;孙旭东;吕薇;Nabil PERVAIZ;鲁俊;景涛

    目的 研究氯舒隆和奥硝唑体外抗细粒棘球蚴原头节和多房棘球蚴的效果. 方法 从感染细粒棘球蚴绵羊肝脏中收集原头节;从感染长爪沙鼠腹腔中分离多房棘球蚴,加入预先接种人肝癌细胞的DMEM培养基中培养2个月后,收集直径为1~5 mm囊泡.实验分氯舒隆组(实验组)、奥硝唑组(实验组)、阿苯达唑组(阳性对照)和0.2%二甲基亚砜(DMSO)组(溶剂对照组).每种药物设2个平行孔,终浓度均为40μmol/L,重复2次.每孔加细粒棘球蚴原头节约100个或多房棘球蚴囊泡25~35个.药物处理细粒棘球蚴原头节24、48、72、96、120、144和168 h后,显微镜下观察原头节形态,用台盼蓝染色,计算原头节存活率,组间存活率的比较采用方差分析.药物处理多房棘球蚴囊泡36 h和120 h后,显微镜下观察囊泡的形态学改变,测定培养上清液中碱性磷酸酶的活性,组间酶活性的比较采用卡方分析. 结果 氯舒隆、奥硝唑和阿苯达唑作用于原头节后,原头节颜色变深、钙颗粒减少、头钩脱落、头节外翻并伸长,0.2% DMSO对原头节形态无影响.氯舒隆、臭硝唑和阿苯达唑作用24、48、72、96、120、144和168 h后,原头节存活率分别为79%、70%、56%、42%、33%、16%、15%,86%、67%、63%、48%、32%、28%、21%和85%、71%、45%、36%、21%、15%、8%;0.2% DMSO组原头节存活率为100%.氯舒隆、奥硝唑和阿苯达唑组原头节存活率与0.2% DMSO组相比差异均有统计学意义(x2=147.83、130.58、170.37,P<0.05).氯舒隆、奥硝唑和阿苯达唑作用后,多房棘球蚴囊泡均塌陷、皱缩,0.2% DMSO对多房棘球蚴囊泡形态无影响.作用36 h后氯舒隆、奥硝唑、阿苯达唑和0.2% DMSO组培养上清液碱性磷酸酶的吸光度(A405)值分别为0.196±0.030、0.186±0.004、0.244±0.049和0.131±0.020,作用120 h后分别为0.431±0.006、0.271±0.004、0.423±0.007和0.116±0.004.氯舒隆、奥硝唑和阿苯达唑组与0.2% DMSO组相比差异均有统计学意义(t=0.006、0.004、0.007,P< 0.05). 结论 氯舒隆和奥硝唑对体外培养的细粒棘球蚴原头节和多房棘球蚴均具有较强的作用,足潜在的抗棘球蚴药物.

  • p38MAPK抑制剂SB202190体外对细粒棘球蚴原头节的作用

    作者:张晶;吕海龙;王成华;孙冯;雷颖;彭心宇;姜玉峰

    目的 探讨p38MAPK抑制剂SB202190体外抑制细粒棘球蚴原头节生长的作用.方法 将体外培养的细粒棘球蚴原头节分别加入12.5、25、50、100 μmol/L的SB202190中体外孵育.利用伊红染色的方法,在光镜下观察原头节的活力变化.实验重复3次;扫描电子显微镜下(SEM)下观察SB202190作用后原头节表面超微结构改变;不同浓度SB202190作用24 h后,半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)活性检测试剂盒检测caspase-3酶活性.结果 50 μmol/L和100 μmol/L的SB202190作用1d后,头节活力开始下降.作用14d后,100 μmol/LSB202190组无存活的头节,50 μmol/L SB202190组的头节活力仅为13.8%.超微结构显示100 μmol/LSB202190作用6d后,原头节顶突外翻、变形,顶突界面缺损,吸盘变形,体表出现虫蛀样损害.不同浓度SB202190作用24 h后,与正常对照组比较,SB202190高浓度组原头节的caspase-3表达明显增高.结论 p38MAPK抑制剂SB202190在体外有明显的抑制细粒棘球蚴原头节生长的作用.

  • 甘氨鹅脱氧胆酸对体外细粒棘球蚴原头节活力及ROS影响

    作者:汤光耀;姜玉峰;吕海龙;李佳洁;杨仁坦;秦文娟;马斌;马容基;王麟尧;陈琳;许雅

    目的 研究甘氨鹅脱氧胆酸(glycochenodeoxycholic acid,GCDCA)对体外细粒棘球蚴原头节活力及活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平的影响.方法 将细粒棘球蚴原头节分为对照组及GCDCA处理组(500、1500、2500μmol/L),应用体外培养技术,通过伊红染色法每天定时在光学显微镜下观察原头节的活力并记录存活和死亡数目.使用试剂盒检测不同浓度GCDCA处理24 h后各组原头节体内caspase-3酶活性变化;DCFH-DA染色法荧光显微镜观察GCDCA作用24 h后原头节内ROS水平变化.结果 500、1500、2500μmol/L GCDCA处理后均可导致原头节活力减弱,且高浓度组在第7 d时原头节全部死亡.500、1500、2500μmol/L GCDCA组作用原头节24 h后caspase-3酶活性与对照组相比明显升高(F=555.162,P<0.05).500、1500、2500μmol/L GCDCA作用原头节24 h后原头节内ROS水平与对照组相比明显升高(F=216.901,P<0.05).结论 GCDCA能抑制体外原头节生长,促使原头节死亡,可能与活化caspase-3及提高原头节内ROS水平相关,具体机制有待进一步研究.

  • 过氧化氢体外诱导细粒棘球蚴原头节细胞Caspase-3表达及超微结构改变的影响

    作者:胡汉华;康金凤;陈蓉;白山别克;艾赛提;汤建安;谢风莲

    目的 探讨过氧化氢(H2O2)体外诱导细粒棘球蚴原头节细胞凋亡、Caspase-3表达和细胞超微结构的影响.方法 RPMI1640添加谷氨酰胺组即体外培养细粒棘球蚴原头节,用5mmol/L H2O2诱导8h,使其发生细胞凋亡.用原位末端脱氧核糖核苷酸转移酶标记技术(TUNEL 法)检测原头节细胞凋亡情况,用过氧化物酶标记链霉卵白素(SP)染色半胱天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3).在透射电镜下观察原头节细胞超微结构的变化.结果 过氧化氢诱导原头节细胞凋亡细胞增加,caspase-3表达增加,电镜观察原头节细胞异染色质增加,部分细胞染色质异常浓缩呈现凋亡细胞征象.结论 H2O2可诱导细粒棘球蚴原头节细胞凋亡,且caspase-3参与原头节细胞的凋亡.

  • siRNA特异性干扰EgRad9基因表达对细粒棘球蚴原头节DNA氧化损伤机制的影响

    作者:郑璇;卢帅;赵军;吕国栋;文丽梅;李亚芬;田春艳;王建华

    目的 研究小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)特异性干扰EgRad9基因表达后对细粒棘球蚴原头节DNA氧化损伤机制的影响. 方法 利用电穿孔法将EgRad9-siRNA干扰序列和阴性对照干扰序列转染细粒棘球蚴原头节,实验分为EgRad9-siRNA-354、-614、-971干扰组,阴性对照组和空白对照组.电转染3d后,加入自然状态下原头节大耐受浓度的H2O2处理1h,伊红染液染色后,倒置荧光显微镜下观察原头节活性并计算存活率.收集各组原头节的培养液,进行碱性磷酸酶活性的检测.电转染3d后,加入自然状态下原头节耐受H2O2的大耐受浓度处理1h后,TRIzol法提取总RNA.实时荧光定量PCR (qRT-PCR)检测EgRad9mRNA的表达.采用彗星实验检测干扰EgRad9基因表达后细粒棘球蚴原头节DNA氧化损伤情况,活性氧(reactive oxygen species,ROS)检测试剂盒检测干扰EgRad9基因表达后细粒棘球蚴原头节体内ROS的含量,采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析. 结果 自然状态下细粒棘球蚴原头节体外耐受H2O2的大浓度为0.4 mmol/L,干预时间为1h;电穿孔法可将绿色荧光干扰序列有效的导入原头节体内,实验组和阴性对照组的原头节体内均有明亮的绿色荧光斑点;而空白对照组原头节体内无绿色荧光斑点.EgRad9-siRNA-354、-614、-971干扰组原头节的存活率分别为(42.99±4.03)%、(29.86±5.87)%和(56.48±4.64)%,初步筛选有效干扰序列为EgRad9-siRNA-614.siRNA-354、-614、-971干扰组碱性磷酸酶活性分别为0.024±0.001、0.004±0.001、0.039±0.002,其中EgRad9-siRNA-614组碱性磷酸酶活性与阴性对照组(0.095±0.001)和空白对照组(0.099±0.001)相比,差异均有统计学意义(t=10.227、10.934,均P<0.01),表明该组原头节EgRad9基因经干扰后对其活性影响大,有效干扰序列为EgRad9-siRNA-614.EgRad9-siRNA-354、614、971干扰组EgRad9 mRNA表达量分别为0.432±0.055、0.291±0.079、0.612±0.032,其中经EgRad9-siRNA-614序列干扰后,EgRad9 mRNA表达量与阴性对照组(1.001±0.020)和空白对照组(1.001±0.012)相比均显著下调(t=7.874、7.663,均P<0.01),可确定有效干扰序列为EgRad9-siRNA-614.相同电泳条件下,EgRad9-siRNA-614干扰组原头节DNA碎片离开核向阳极迁移,形成拖尾;EgRad9-siRNA-614干扰组彗星尾距OTM值为13.901±2.263,与阴性对照组(0.074±0.020)和空白对照组(0.047±0.034)相比,差异有统计学意义(t=12.845、13.251,均P<0.01).经EgRad9-siRNA-614序列干扰后,原头节体内ROS含量为13.024±0.154,与阴性对照组(2.728±0.083)和空白对照组(2.555±0.007)相比,差异有统计学意义(t=9.296、10.134,均P<0.01). 结论 EgRad9基因在细粒棘球蚴原头节DNA氧化损伤过程中发挥重要作用,EgRad9-siRNA-614干扰片段可特异性干扰EgRad9基因的表达,并降低原头节修复DNA氧化损伤的能力.

  • 氯舒隆和奥硝唑体外抗细粒棘球蚴原头节和多房棘球蚴的效果评价

    作者:辛奇;高海军;宋晓霞;孙旭东;吕薇;Nabil PERVAIZ;鲁俊;景涛

    目的 研究氯舒隆和奥硝唑体外抗细粒棘球蚴原头节和多房棘球蚴的效果. 方法 从感染细粒棘球蚴绵羊肝脏中收集原头节;从感染长爪沙鼠腹腔中分离多房棘球蚴,加入预先接种人肝癌细胞的DMEM培养基中培养2个月后,收集直径为1~5 mm囊泡.实验分氯舒隆组(实验组)、奥硝唑组(实验组)、阿苯达唑组(阳性对照)和0.2%二甲基亚砜(DMSO)组(溶剂对照组).每种药物设2个平行孔,终浓度均为40 μmol/L,重复2次.每孔加细粒棘球蚴原头节约100个或多房棘球蚴囊泡25~35个.药物处理细粒棘球蚴原头节24、48、72、96、120、l44和168 h后,显微镜下观察原头节形态,用台盼蓝染色,计算原头节存活率,组间存活率的比较采用方差分析.药物处理多房棘球蚴囊泡36 h和120 h后,显微镜下观察囊泡的形态学改变,测定培养上清液中碱性磷酸酶的活性,组间酶活性的比较采用卡方分析. 结果 氯舒隆、奥硝唑和阿苯达唑作用于原头节后,原头节颜色变深、钙颗粒减少、头钩脱落、头节外翻并伸长,0.2% DMSO对原头节形态无影响.氯舒隆、臭硝唑和阿苯达唑作用24、48、72、96、120、144和168 h后,原头节存活率分别为79%、70%、56%、42%、33%、16%、15%,86%、67%、63%、48%、32%、28%、21%和85%、71%、45%、36%、21%、15%、8%;0.2% DMSO组原头节存活率为100%.氯舒隆、奥硝唑和阿苯达唑组原头节存活率与0.2% DMSO组相比差异均有统计学意义(X2=147.83、130.58、170.37,P< 0.05).氯舒隆、奥硝唑和阿苯达唑作用后,多房棘球蚴囊泡均塌陷、皱缩,0.2% DMSO对多房棘球蚴囊泡形态无影响.作用36 h后氯舒隆、奥硝唑、阿苯达唑和0.2% DMSO组培养上清液碱性磷酸酶的吸光度(A405)值分别为0.196±0.030、0.186±0.004、0.244±0.049和0.131±0.020,作用120 h后分别为0.431±0.006、0.271±0.004、0.423±0.007和0.116±0.004.氯舒隆、奥硝唑和阿苯达唑组与0.2% DMSO组相比差异均有统计学意义(t=0.006、0.004、0.007,P< 0.05). 结论 氯舒隆和奥硝唑对体外培养的细粒棘球蚴原头节和多房棘球蚴均具有较强的作用,是潜在的抗棘球蚴药物.

  • γ-射线对细粒棘球蚴原头节在小鼠体内生长的抑制作用

    作者:袁庆;李波;姜世平;罗兰云;李耿;赵强;张利勇

    目的 探讨γ-射线对细粒棘球蚴原头节生长的抑制作用.方法 在体外培养的基础上,利用不同剂量的γ-射线对细粒棘球蚴原头节进行照射,并将照射后的原头节种植于小白鼠腹腔,4个月后进行剖腹观察,对不同照射剂量组(分别为10 Gy、20 Gy、40 Gy、80 Gy)原头节种植后所形成棘球蚴的发生情况、重量、组织结构进行分析,并与不照射(对照组)作对比.结果 经过照射后,原头节种植于小白鼠腹腔后其棘球蚴发生率逐步降低,对照组为100%,10Gy组为80.0%,20 Gy组为33.3%,40 Gy组为33.3%,80 Gy组为26.7%.剖腹称重后,各组棘球蚴重量中位数比较,10 Gy组(35.80 mg)、20 Gy组(0.00 mg)、40 Gy组(0.00 mg)及80 Gy组(0.00 mg)与对照组(157.80mg)相比,均明显下降,差异有统计学意义(P<0.001).实验组所形成的棘球蚴发生钙化.结论 γ-射线的照射可以抑制原头节形成棘球蚴,并可以导致所形成的棘球蚴结构破坏,加快棘球蚴坏死、钙化的转归过程.

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