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  • 流式微球技术在小分子物质高通量快速检测中的应用

    作者:肖昌彬;孔维军;刘秋桃;杨美华;万丽

    流式微球技术是一种仅需少量样品即可实现多种待测目标成分实时、快速检测的新型分析技术,具有高通量、高特异性、高灵敏性、操作简便、低成本、重复性好、快速检测等优势,已被广泛用于食品、农产品、环境等领域内各种目标成分的检测研究,近年来尤其在小分子物质检测方面取得较快进展.该文介绍了流式微球技术的原理,总结了其在真菌毒素、农药残留、贝类毒素等小分子物质检测中的应用,并展望了流式微球技术在中药复杂基质中痕量小分子物质检测的应用及其发展趋势.

  • 流式微球技术检测血小板特异性抗体的研究进展

    作者:凌云;孔欣;陈宝安

    血小板特异性抗体的产生是引起特发性血小板减少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura,ITP)病人血小扳减少及巨核细胞成熟障碍的重要原因,其诊断缺乏特异性的临床表现,主要依靠血小板特异性抗体的检测.单克隆抗体特异性血小板抗原固定术(MAIPA)是检测血小板特异性抗体的“金标准”,具有高特异性、低敏感性等特点,但由于操作繁琐、耗时等原因未在临床实验室推广使用.近年来,基于流式细胞术检测血小板特异性抗体的技术研究报道,其敏感性高于MAIPA,解决了部分操作及耗时的问题,并具有利用微球编码进行联立血小板抗体检测等优点.本文就近年来该检测方法的研究进展作一综述.

  • 流式微球法检测vWF活性及其在评估脑卒中预后中的应用

    作者:闫彬;何杨;陆士奇;徐梦乔;王琪;赵益明;阮长耿

    目的:建立流式微球技术(FCIA)检测血浆血管性血友病因子活性(vWF∶GPⅠbR)的方法,及其在缺血性脑卒中(IS)预后评估的应用.方法:包被抗人血小板糖蛋白Ⅰbα(GPⅠbα)单克隆抗体SZ151 IgG的微球与重组GPⅠbα孵育,加入待检血浆和瑞斯托霉素,终与FITC标记的绵羊抗人vWF IgG多抗反应,上流式细胞仪检测.联合应用vWF抗原(vWF∶Ag)、vWF∶GPⅠbR活性和vWF胶原结合活性(vWF∶CB)检测,分析脑卒中患者的vWF状态.结果:流式微球法批内差异和批间差异分别为7.7%和13.5%;其与经典的ELISA法有较好的相关性(r=0.813,P<0.001),两种方法的偏倚为9.95%.与ELISA法相比,流式微球法有更高的特异度和准确度(P<0.05).脑卒中患者vWF∶Ag、vWF∶GPⅠbR和vWF:CB水平显著高于正常对照组(H值分别为7.8、6.4、6.2)(P<0.001).脑卒中患者vWF∶GPⅠbR与vWF∶Ag、超敏CRP、Autar评分和住院天数呈较好的正相关.结论:流式微球技术检测血浆vWF∶GPⅠbR简单可靠,特异度高,准确性好.vWF∶GPⅠbR参与了脑卒中的发生,并能够用于预测脑卒中患者的血栓形成风险,评估预后.

  • 流式微球技术检测血小板微粒的方法建立及其评价

    作者:李传保;王建中;吴煦;袁家颖;汪润;张爱玉;赵燕君;屈晨雪;王新华

    目的建立血小板微粒(platelet derived microparticles,PMPs)的流式微球技术(cytometric bead array,CBA)检测方法并对其进行方法学评价.方法采用包被针对血小板膜糖蛋白Ⅲa(CD61)单克隆抗体的检测微球捕获PMPs,用CD41 PE结合捕获的PMPs,利用流式细胞仪对微球-PMPs-CD41 PE复合物进行检测.通过试验优化检测条件;并对方法的重复性和检测线性进行评价.对45例健康人PMPs水平进行检测.结果检测微球在4℃可以稳定保存90 d以上,变异系数0.65%,基本可以满足临床检测的要求.应用CTAD抗凝管采集标本可以有效的抑制PMPs的体外释放;室温反应4h可以达到PMPs大的结合;利用PBS洗涤可以去除检测微球对PMPs的非特异性吸附.该方法批内变异系数6.8%;批间变异系数10.4%,有较好的重复性;利用该方法检测血小板活化上清中的PMPs,在0~200 μl之间有较好的线性(r=0.9962).45例正常健康成人血液PMPs参考范围为1.031~1.766(相对荧光强度).结论流式微球技术可以简便、快捷、准确地检测PMPs,对于临床出血、血栓性疾病的诊治具有重要意义.

  • 流式微球技术检测糖蛋白Ⅱb/Ⅲ a自身抗体在特发性血小板减少性紫癜诊断中的应用

    作者:刘新光;王燕铭;侯明;张锑;朱媛媛;彭军

    目的 建立流式微球技术检测血小板膜表面糖蛋白Ⅱ b/Ⅲa(GPⅡb/Ⅲa)特异性自身抗体的方法,比较该方法和改良间接单克隆抗体俘获血小板抗原技术(MAIPA)在特发性血小板减少性紫癜(ITP)与非免疫性血小板减少性紫癜鉴别诊断中的价值.方法 应用抗人血小板GPⅡb/Ⅲa单抗(CD41a)包被微球.分离血小板,将血小板裂解后与包被过的微球孵育,再加入PE标记的羊抗人IgG多克隆抗体,流式细胞术分析.分别用该方法和改良间接MAIPA检测血小板表面和血浆中的糖蛋白特异性自身抗体,并将检测结果进行比较.结果 将样本的平均荧光强度值(MFI)与正常对照MFI的均值比较,计算比率.该比率均值及范围在ITP组为3.36(0.84~22.94),非免疫性血小板减少组为1.16(0.67~5.59),正常对照组为1.08(0.72~1.76).非参数检验得ITP组荧光强度比率与非免疫性血小板减少组及正常对照组存在显著差异(P《0.01).若将正常对照组上限作为界值,比率大于1.76定为阳性,则流式微球技术诊断ITP的敏感性为71.43%,特异性为94.28%,阳性预测值为95.24%,其敏感性高于改良间接MAIPA的测定值(51.79%)(χx2=4.57,P<0.05)。由ROC曲线得流式微球法区分ITP患者与正常人的鉴别效度为0.916。结论 流式微球技术检测血小板膜表面糖蛋白特异性自身抗体,耗时短、重复性好,敏感性高于改良间接MAIPA,对提高ITP的实验诊断水平及指导临床治疗有一定的价值。

  • 应用流式微球技术检测人泪液表皮生长因子

    作者:张艳莉;马璇;黄强;李兵;吴开力

    目的 将xMAP(flexible multi-analyte profiling)技术和ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)应用到人泪液中的表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)检测中,探讨xMAP技术在泪液检测中的应用前景.方法 选取24例正常人(年龄18~33岁),在裂隙灯下取无刺激性泪液,用xMAP法检测泪液中EGF的浓度,与ELISA测定的结果比较,进行统计学分析.结果 xMAP法检测泪液中EGF浓度为(4.32±2.57)ng/ml(范围0.96~9.76ng/ml),同一批样本经ELISA检测为(8.78±5.35)ng/ml(范围2.45~20.39ng/ml),两种方法的结果相关系数R2=0.8508(p=0.000).结论 xMAP法与ELISA法相关性良好,可以用于泪液中多种微量蛋白的检测.

  • 慢性乙肝、肝硬化和肝癌患者Th1/Th2细胞因子检测及临床应用

    作者:钱留喜;张宏宇;王永忠

    目的:应用流式微球技术(cytometric bead array,CBA)技术检测慢性乙肝、肝硬化及肝细胞性肝癌(hepatic cellular cancer,HCC)患者血浆中Th1/Th2细胞因子水平,探讨其临床应用.方法:选择慢性HBV感染者71例,HBV阳性肝硬化患者33例,HBV阳性肝癌患者25例,用CBA方法检测其血清中Th1类细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-2,Th2类细胞因子IL-4、IL-5、IL-10的表达情况.结果:肝癌患者血清中Th1类细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-2,Th2类细胞因子IL-5表达显著高于慢性乙肝和肝硬化患者,而IL-4、IL-10在三组患者中的表达无显著性差异.结论:肝癌患者机体强势分泌Th1类细胞因子,处于高免疫反应状态.检测乙肝患者Th1/Th2类细胞因子对于肝病慢性化的进展成为一项新的临床预测指标.

  • Th17细胞和Th1/Th2/Th17相关细胞因子水平在良性前列腺增生患者中的意义

    作者:李云祥;李进铭;张宗平;伍季;王安果;夏中友;魏强

    目的 探讨在良性前列腺增生(BPH)患者中辅助性T细胞(Th)17和Th1/Th2/Th17相关细胞因子的表达及意义.方法 收集2013至2014年住院手术且有完整病历资料的80例行尿道前列腺电切术(TURP)的BPH患者的术前外周血及术中前列腺组织标本,根据病理学检查是否合并组织学炎症分为单纯组和炎症组.另选取20例健康男性作为对照组.采用流式微球技术检测血浆Th17细胞相关细胞因子(IL-17、IL-23)、Th1细胞相关细胞因子(IFN-γ、IL-2)和Th2细胞相关细胞因子(IL4、IL-6)的水平;流式细胞术检测外周血单个核细胞(PBMC)中Th17细胞的比例;免疫组化法检测IL-17蛋白在前列腺组织中的表达.结果 (1) 80例TURP切除的前列腺组织标本中,有60例(75%)患者前列腺组织中存在组织学炎症,依据组织学炎症情况分为BPH轻度(n=31)、中度(n=18)和重度炎症组(n=11);另20例不存在组织学炎症(单纯组).(2) BPH炎症各亚组患者血浆IL-17含量明显高于对照组和单纯组患者(P均<0.05),但轻、中、重度炎症亚组间比较无统计学差异(P均>0.05).其他细胞因子(IL-23、IFN-γ、IL-6、IL-4、IL-2)含量在不同组别之间比较水平相近(P均>0.05).(3)流式细胞术检测结果,BPH炎症各亚组PBMC中Th17细胞百分比均较单纯组有升高的倾向,但差异无统计学意义(P均>0.05).(4)在前列腺组织中,BPH轻、中、重炎症组IL-17蛋白表达水平分别高于对照组和BPH单纯组(P均<0.05),IL-17蛋白表达水平与BPH的组织学炎症程度呈正相关(r=0.501,P=0.014).结论 Th1和Th2细胞对BPH的影响可能不大;而Th17细胞存在升高趋势,其相关细胞因子IL-17在血浆中的含量和前列腺组织中的表达水平明显增高.推测Th17可能经前列腺组织中的炎症因子作用迁移至前列腺组织中而促进前列腺增生.

  • 量子点流式微球技术定量检测血清胃癌相关抗原MG7的方法学建立及评价

    作者:胡晓璐;段荣;柯江维;王占科

    目的 建立一种基于量子点流式微球技术检测胃癌相关抗原MG7的方法,并对该方法进行评价.方法 将兔抗人MG7多克隆抗体与5 μm聚苯乙烯微球耦联,与MG7结合,加入鼠抗人MG7单克隆抗体,后加入生物素化羊抗鼠IgG和链霉亲合素化量子点,通过流式细胞仪检测量子点平均荧光强度(mean fluorescent intensity,MFI).对该方法的灵敏度、线性范围、精密度、干扰实验、阳性临界值等指标进行初步评价,并检测19例胃癌、23例胃溃疡、25例浅表性胃炎、21例萎缩性胃炎/增生患者和25例体检健康者血清MG7水平.结果 聚苯乙烯微球粒径均一性好,2h为佳耦联时间,耦联率为67.43%.方法检测灵敏度为0.21 ng/mL,线性范围为0.39 ~ 100 ng/mL.体检健康者混合血清及胃癌组混合血清的变异系数分别为10.43%和7.87%.低浓度胆固醇(6.50 mmol/L)、胆红素(0.15 mmol/L)和三酰甘油(18.00 mmol/L)对检测干扰较小.ROC曲线下面积(AUCRoC)为0.922,佳临界值为15.00 ng/mL.胃癌组血清MG7浓度显著高于体检健康组、浅表性胃炎组、胃溃疡组、萎缩性胃炎/增生组(P均<0.01);萎缩性胃炎/增生组MG7浓度显著高于体检健康组、浅表性胃炎组、胃溃疡组(P均<0.01);胃溃疡组MG7浓度高于体检健康组(P<0.05);以15.00 ng/mL为临界值时,胃癌阳性检出率为73.68%.结论 本实验建立的量子点流式微球技术可用于血清胃癌相关抗原MG7的定量测定,其检测性能良好,检测结果与临床疾病发展规律相符合.

  • 流式微球技术检测血小板特异性抗体

    作者:李锦霞;杨炳华;何杨;赵益明;朱明清;阮长耿

    目的 建立流式微球技术检测血小板特异性自身抗体方法,并对方法学及临床应用进行初步探讨.方法 用包被抗血小板膜糖蛋白(GP)Ⅰ b、Ⅱb、Ⅲa、Ⅱ b/Ⅲa单克隆抗体的微球捕获与血小板GP结合的特异性抗体,加入FITC标记的羊抗人IgG抗体后用流式细胞仪检测分析.结果 特发性血小板减少性紫癜(ITP)组4种单抗荧光强度比值与非ITP血小板减少组和正常对照组有显著性差异(P<0.01);若将ITP组患者4种单抗荧光强度比值分别大于正常对照组上限1.37、1.24、1.48和1.19判断为阳性,则流式微球技术检测血小板特异性自身抗体的敏感性为73.2%,特异性为94.3%;4种单抗联合检测总体敏感性明显高于改良间接单抗特异的血小板抗原固定试验(MAIPA)(P<0.05),且大于各单个抗体检测敏感性.结论 流式微球技术可以简便、快捷地检测血小板膜糖蛋白特异性抗体,联合检测多种自身抗体可以提高检测阳性率,对于ITP的诊治具有一定的临床价值.

  • 应用流式微球技术检测慢性特发性血小板减少性紫癜患者的血小板特异性抗体

    作者:孟美丽;黄瑞滨

    目的 应用流式微球技术(CBA)检测血小板特异性抗体,评价其在慢性特发性血小板减少性紫癜(CITP)诊断中的价值.方法 对40例CITP患者(GITP组)、20例非免疫性血小板减少症(NITP)患者(NITP组)及20例健康体检者(健康体检组)的血液标本进行分离提取血小板,将血小板裂解后与包被过的微球孵育,之后加入FITC标记的山羊抗人IgG多克隆抗体,流式细胞仪分析.对3组标本的平均荧光强度值与阴性对照的荧光强度值比较,计算比率.结果 CITP组、NITP组及健康体检组荧光强度比率均值及上下限分别为5.50(0.59~22.89)、1.15(0.67~3.76)及1.05(0.39~1.59);非参数检验CITP组荧光强度比率均高于NITP组及健康体检组(均P<0.05),NITP组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05).若将健康体检组上限作为界值,比率大于1.59为阳性,则CHA诊断的敏感性为92.5%,特异性为90.0%.结论 应用流式微球技术检测血小板特异性抗体对CITP的诊断有应用价值.

  • 流式微球技术及量子点在实验室诊断中的应用进展

    作者:胡晓璐;王占科

    实验室诊断是医学诊断的重要内容.随着生物化学、分子生物学、基因组学及蛋白组学的飞速发展,大量未知生物大分子不断被发现,实验室诊断面临着巨大的挑战.

  • 糜烂型OLP患者唾液Th1、Th2、Th17相关细胞因子及β防御素的表达

    作者:冯豆豆;蒋兰岚;林小洁;梅国城;曾启新;陶人川

    目的:检测Th1、Th2、Th17相关细胞因子和HBD-2,-3在糜烂型口腔扁平苔藓(EOLP)患者唾液中的表达,探讨其在EOLP发生发展中的作用。方法:分别纳入EOLP患者30例及按年龄和性别匹配的健康者20例作为实验组和对照组,采用流式微球技术(Cytometric Bead Array,CBA)检测唾液中IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-17、IFN-γ、IL-4、IL-10的表达水平,并采用酶联免疫吸附测试法(ELISA)检测唾液中HBD-2和HBD-3。结果:EOLP患者唾液中IL-1β、IL-6、HBD-2、HBD-3水平显著高于对照组(P<0.05),TNF-α、IL-17、IFN-γ、IL-4、IL-10与对照组比较差异无显著性(P>0.05)。患者唾液HBD-2的表达与IFN-γ呈正相关、与IL-17呈负相关,HBD-3的表达与IL-17和IL-10均呈负相关。结论:唾液中IL-1β、IL-6、HBD-2和HBD-3的高表达可能与EOLP的发生发展密切相关。

  • 原发免疫性血小板减少症GPIIb/IIIa抗体检测的临床意义

    作者:潘歆;陈志刚;张恒;吴广胜

    目的:检测原发免疫性血小板减少症(ITP)患者GPIIb/IIIa抗体水平并探讨其临床意义。方法:应用流式微球技术(CBA)检测血小板GPⅡb/Ⅲa自身抗体,记录各个样本的平均荧光强度(MFI),计算样本的MFI与正常对照MFI均值的比率。结果:ITP组、非免疫性血小板减少组和正常对照组的MFI比率分别为(2.61±1.09)、(1.32±0.59)和(0.95±0.40),非参数检验得ITP组MFI比率高于非免疫性血小板减少组和正常对照组(P <0.01),而后两者MFI比率差异无统计学意义(P >0.05)。经统计学处理,CBA对ITP诊断的敏感性为71.88%,特异性为84.62%,由ROC曲线得CBA区分ITP患者与非免疫性血小板减少患者的能力为0.848。结论:CBA检测血小板GPIIb/IIIa抗体敏感性、特异性均较高,且操作简便,重复性好,对ITP的辅助诊断具有一定的实用价值。

  • 血小板膜糖蛋白自身抗体检测新方法--流式微球技术

    作者:张琼丽;李金霖;史敦云;李明;杜新

    目的 建立流式微球技术检测血小板膜表面糖蛋白特异性自身抗体(GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb/IX),探讨其在特发性血小板减少性紫癜(ITP)患者体内表达情况及其与激素治疗效果之间的关系.方法 取67例ITP患者及30例健康对照组的外周血,分离、裂解血小板与单抗包被微球共同孵育后加入PE标记多克隆抗体,流式细胞仪分析,评价ITP患者激素治疗效果.结果 ITP患者血小板GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb/IX自身抗体荧光强度为4.58(0.22~30.20)、4.78(0.56~22.00),对照组为0.92(0.23~2.28)、0.87(0.22~2.13).以微球荧光强度比率(测定/对照)CD41a>0.025%、CD42>2.12%定为阳性,用流式微球技术同时检测两种抗血小板抗体,诊断ITP敏感性为95.5%(64/67)、特异性为90.9%,阳性预测值为96.7%.ITP患者激素治疗效果与抗体检测结果呈负相关(r=-0.318).结论 流式微球技术检测血小板膜糖蛋白自身抗体对ITP诊断的敏感性、特异性较高,对治疗及预后也有一定临床指导意义.

  • 血小板特异性抗体联合检测在免疫性血小板减少症鉴别诊断中的价值

    作者:李芳;朴文花;李芹;白洁;杜宗孝

    目的:通过检测血小板减少症患者外周血B淋巴细胞血小板膜糖蛋白特异性抗体的变化,探讨其表达水平变化对血小板减少症鉴别诊断的临床意义。方法应用流式微球技术检测血小板减少症患者及健康对照者外周血GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb/ⅠX的表达水平。结果原发IT P与继发IT P患者血小板特异性抗体GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb/ⅠX与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);血小板特异性抗体GPⅠb/ⅠX诊断原发ITP的敏感度43%,特异度89%;GPⅡb/Ⅲa诊断原发ITP的敏感度86%,特异度83%。两者联合诊断敏感度90%,特异度83%。结论联合检测两种血小板抗体,提高原发ITP和SLE的诊断阳性率;GPⅠb/ⅠX在IT P中的诊断优势不如GPⅡb/Ⅲa。

  • 流式微球技术定量检测血小板膜糖蛋白在IT P中的应用价值探讨

    作者:郭亮;宋艳萍;王浩;贾学友;郭晓波

    目的:应用流式细胞技术检测血小板表面膜糖蛋白,评价其在血小板减少性紫癜(ITP)诊断中的价值。方法选取2013年1月至2015年2月门诊及住院部收治的77例ITP患者(ITP组)、43例非免疫性血小板减少症患者(NITP组)及同期进行健康体检的健康者30例(健康对照组)为研究对象。应用鼠抗人GPⅡb/Ⅲa单抗、GPIa/Ⅱa单抗、GP Ib/Ⅸ单抗包被微球,采集空腹静脉血分离血样中血小板,将血小板裂解后与包被过的微球共同孵育,应用流式细胞仪结合间接荧光免疫法检测并比较三组血小板表面膜糖蛋白。分析流式微球技术诊断ITP的敏感度与特异度。结果 ITP组患者血小板表面GPⅡb/Ⅲa、GPIa/Ⅱa、GP Ib/Ⅸ的水平均明显高于NITP组及健康对照组,差异具有统计学意义(P<0.05),NITP组患者高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。流式微球技术对ITP的诊断敏感度为92.2%(71/77),特异度为89.0%(65/73),准确度为90.7%(136/150)。结论应用流式微球技术定量检测血小板膜糖蛋白对诊断IT P有应用价值。

  • 量子点流式微球技术检测抗胰岛素抗体方法学建立

    作者:胡晓璐;王占科;李剑

    目的 将量子点荧光探针应用于流式微球技术,创建出量子点流式微球技术检测人抗胰岛素抗体的方法并对其偶联率、精密度、线性范围、灵敏度进行初步评价.方法 将胰岛素与羧基化微球偶联制备免疫诊断微球,与血清或标准品中人抗胰岛素抗体结合后,加入兔抗人IgG抗体,后加入生物素化的羊抗兔IgG抗体和链霉亲和素化的量子点,使微球表面呈现荧光,并通过流式细胞仪检测平均荧光强度(mean fluorescent intensity,MFI)并记录.结果 羧基化微球偶联胰岛素的性能显著强于空白微球,偶联0.5~3 h为佳偶联反应时间,偶联成功的免疫诊断微球放置4℃冰箱至少可稳定50 d.微球偶联微球表面所携带荧光MFI与所测抗胰岛素抗体浓度成正比,量子点流式微球技术检测同一标本的灵敏度(3.74 pg/ml)、精密度(8.24%)、线性范围(3.74~5 000 pg/ml)都优于酶联免疫吸附试验所测得灵敏度(24.53 pg/ml)、精密度(12.31%)、线性范围(24.53~2 500 pg/ml).结论 本实验创建的量子点流式微球技术可用于人血清抗胰岛素抗体测定,其检测性能良好.

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