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胡椒碱对HepG2细胞胰岛素抵抗模型糖代谢AMPK信号通路上游靶点干预机制的研究
探讨胡椒碱对胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)细胞模型糖代谢紊乱的作用及干预AMPK信号通路上游靶点的分子机制.通过脂肪乳诱导HepG2细胞构建胰岛素抵抗模型.葡萄糖氧化酶(GOD-POD)法检测各组葡萄糖消耗量;酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测上清液中脂联素(adiponectin,APN)、瘦素(leptin,LEP)的水平;荧光定量PCR法检测APN,LEP mR-NA的表达水平,Western blotting法检测AMPKα,р-AMPKα,瘦素受体(LepR),脂联素受体1(AdipoR1)和脂联素受体2(Adi-poR2)蛋白的表达.结果显示,胡椒碱与降糖药罗格列酮、AMPK激动剂AICAR均能明显提高胰岛素抵抗细胞模型的葡萄糖消耗量,升高脂联素水平、增加脂联素mRNA、脂联素受体1蛋白的表达,也增加AMPKαmRNA和 р-AMPKα蛋白表达;同时降低瘦素mRNA和瘦素受体蛋白的表达.结果表明,胡椒碱能显著改善胰岛素抵抗细胞模型糖代谢紊乱,其作用机制可能通过调控上游脂联素和瘦素的表达,从而激活AMPK信号通路.
关键词： 胡椒碱 磷酸腺苷激活的蛋白激酶 胰岛素抵抗 瘦素 脂联素 -
AMPKα信号途径参与吡格列酮对人肝癌细胞的凋亡诱导作用
目的 观察吡格列酮干预对体外培养的HepG2细胞凋亡和细胞周期的影响,并探讨其药理作用机制.方法 以不同浓度的吡格列酮干预体外培养HepG2细胞,采用流式细胞术检测细胞凋亡、细胞周期以及激活的胱天蛋白酶(Caspase)3蛋白表达,RT-PCR检测PPARγ mRNA的表达,Western印迹检测PPARγ蛋白、磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMPKα)蛋白和磷酸化AMPKα(p-AMPKα)蛋白的表达；并将PPARγ小干扰RNA(pGCsi-PPARγ)表达质粒转染HepG2细胞,观察PPARγ基因沉默后吡格列酮对细胞凋亡作用的影响.结果 不同浓度的吡格列酮干预HepG2细胞后,诱导细胞的凋亡,在此过程中G0/G1期细胞比例明显增加,S期细胞比例明显减少,并呈一定的剂量依赖关系；但在上述过程中,PPARγmRNA和蛋白的表达没有显著变化；吡格列酮在高浓度(20 μmol/L)时对pGCsi-PPARγ表达质粒转染的HepG2细胞仍表现出凋亡诱导作用.不同浓度的吡格列酮干预后未见激活的caspase 3表达峰,对NF-KB的DNA结合活性也无明显影响,但其在高浓度(20 μmol/L)时明显增加对照组和pGCsi-PPARγ转染组p-AMPKα的表达,而总AMPKα则无明显变化.结论 吡格列酮能够干扰细胞周期、诱导其凋亡,这种作用不是完全通过PPARγ依赖途径实现的,AMPKα信号途径参与上述过程.
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磷酸腺苷激活的蛋白激酶参与调节细胞外信号调节激酶1/2活化发挥对血管平滑肌细胞胰岛素样生长因子-1信号的抑制作用
目的 进一步证实在猪主动脉平滑肌细胞中磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)抑制胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)刺激引起的细胞增生,以及探讨其可能的机制.方法 使用AMPK活化剂二甲双胍增强细胞内AMPK的活化(表现为AMPK第172位苏氨酸磷酸化增高);采用定点突变获得组成性激活型AMPK突变体,设计短发卡RNA (short hairpin,shRNA)序列构建AMPK干扰载体,并分别包装产生组成性激活型AMPK和AMPK敲低慢病毒.分别采用AMPK活化剂二甲双胍处理、组成性激活型AMPK慢病毒感染和AMPK敲低慢病毒感染猪主动脉平滑肌细胞,观察AMPK活性对猪主动脉平滑肌细胞中IGF-1刺激引起的细胞外信号调节激酶1/2(extraeellular signal-regulated kinases 1/2,ERK1/2)活性(表现为202位苏氨酸和204位酪氨酸的磷酸化)及其下游细胞增生的影响.结果 二甲双胍明显增强AMPK的活性(表现为172位苏氨酸磷酸化增高),并明显抑制IGF-1刺激引起的ERK1/2活化(表现为202位苏氨酸和204位酪氨酸的磷酸化受到抑制);组成性激活型AMPK表达能明显抑制IGF-1刺激引起的ERK1/2活化以及下游的细胞增生;在AMPK敲低细胞中,IGF-1能引起更强的ERKI/2活化.结论 AMPK能通过抑制ERK1/2活化抑制血管平滑肌细胞IGF-1信号,并能抑制IGF-1刺激引起的血管平滑肌细胞增生.
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瑞舒伐他汀对内皮细胞中组织因子途径抑制物表达的影响
目的 探讨瑞舒伐他汀对组织因子途径抑制物(TFPI)表达的调节作用及机制.方法 培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs),给予多种剂量的瑞舒伐他汀和(或)肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMPK)抑制剂与激活剂处理细胞,利用实时定量PCR、Western blot技术检测内皮细胞中TFPI表达的变化.结果 TNF-α下调内皮细胞中TFPI的的表达水平,而这一作用被瑞舒伐他汀所阻断.而且,瑞舒伐他汀呈时间及剂量依赖性上调TFPI的mRNA与蛋白水平.AMPK抑制剂--Compoud C则可逆转瑞舒伐他汀对TFPI表达的上调作用,而AMPK激动剂--Aicar则具有与瑞舒伐他汀相似的上调TFPI的作用.结论 瑞舒伐他汀通过激活AMPK途径上调血管内皮细胞中TFPI的表达.
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二甲双胍调节内皮细胞组织因子途径抑制物的表达
组织因子途径抑制物(tissue factor pathway inhibitor, glycosylation end productsTFPI)高表达于血管内皮细胞表面,特异性抑制外源性凝血途径,是一种控制凝血启动的抗凝蛋白[1].血栓形成是糖尿病的主要并发症之一.糖尿病患者血糖持续升高,导致糖基化终末产物(advanced lycosylation end products, AGEs)的生成[2].AGEs水平可上调组织因子,促进血栓形成.作为控制糖尿病的一线用药,二甲双胍明显缓解糖尿病并发症[3],但目前尚无其调节糖尿病血栓及TFPI表达的报道.本研究检测了二甲双胍对TFPI表达的影响,并初步探讨了其中机制,为糖尿病血栓的干预提供了新的靶点.
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磷酸腺苷激活的蛋白激酶对抵抗素诱导内皮细胞凋亡的保护作用研究
目的 研究抵抗素对内皮细胞功能的影响和磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMPK)在抵抗素影响内皮功能中的作用.方法 原代培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC),不同浓度人抵抗素(0、50和100ng/mL)培养24 h.TUNEL和Annexin V-FITC分别检测其对内皮细胞凋亡的影响,H2DCFDA染色检测细胞内活性氧簇(ROS)生成,Western-blot检测内皮细胞AMPK-α(Thr172)磷酸化水平.抵抗素干预后,采用AMPK激动剂AICAR干预观察AMPK在抵抗素影响内皮细胞中的作用.结果 抵抗素干预内皮细胞并不能增加其凋亡和ROS生成,但可抑制内皮细胞AMPK的磷酸化激活,且AMPK的激活能够抑制抵抗素作用的内皮细胞凋亡和ROS生成. 结论抵抗素对内皮细胞的作用机制中AMPK可能占重要地位,抵抗素可抑制内皮AMPK磷酸化.而AICAR激活AMPK后对内皮细胞损伤起保护作用.
关键词： 抵抗素 内皮细胞 凋亡 活性氧簇 磷酸腺苷激活的蛋白激酶 -
酸预处理提高水蚤在严重低氧环境中的耐受
在生理条件下,pH的稳定是细胞生长、增殖和凋亡的一个重要影响因素.一旦pH平衡被打破,细胞的功能和生存将会受到影响.然而,适度的酸中毒能提高细胞对有害应激的耐受,从而增加细胞在有害环境中的生存能力.在本研究中,我们用一种无脊椎动物水蚤作为模式动物,发现酸预处理能提高水蚤在严重缺氧条件下的耐受,同时,酸预处理明显地增加了低氧诱导因子(HIF)的表达.HIF拮抗剂echinomycin和磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMPK)拮抗剂Compound C能有效的抑制酸预处理引起的水蚤对低氧的耐受和酸预处理介导的HIF的表达增高；而哺乳动物的雷帕霉素靶蛋白(mTOR)拮抗剂temsirolimus虽然抑制了酸预处理介导的HIF的表达增高,但却提高了酸预处理所引起的水蚤对低氧的耐受.因此,酸预处理对水蚤的保护作用不仅依赖于HIF的表达上调,也与AMPK和mTOR信号途径有关.
