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  • 规律成簇的间隔短回文重复序列中间隔序列的噬菌体来源研究

    作者:侯雪新;杜鹏程;李振军

    目的 发现在现有的全基因组测序完成的原核生物中规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR)系统中间隔序列分布规律以及间隔序列中噬菌体来源情况.方法 整理现有CRISPR数据库中2762株细菌基因组中的CRISPR系统和其中的间隔序列数据,整理GenBank数据库中发表的1444个噬菌体基因组数据.利用BLASTN软件对间隔序列数据与噬菌体基因组进行相似性比较,计数资料比较使用x2检验.结果 在2762个细菌基因组中整理出1940个基因组存在确定或可能的CRISPR结构和90 096条间隔序列,多数基因组具有1~ 50条间隔序列(1414/1940,72.9%),间隔序列数量>250条的仅有58个基因组(58/1940,3.0%).其中古细菌13株(13/150,8.6%),真细菌45株(45/2612,1.7%),差异有统计学意义(x2=29.98,P<0.01).相似性比较结果共发现245个细菌基因组的1055条间隔序列,成功比对上363个噬菌体,比对成功率仅为0.12%.结论 细菌基因组中的CRISPR系统中间隔序列数量存在较大差异,古细菌基因组中CRISPR系统存在更多的间隔序列.相似性比较中噬菌体来源的间隔序列所占比例低,提示与细菌和噬菌体基因组发现较少相关,进一步深入研究可以大幅度提高成功率.

  • CRISPR/Cas系统间隔序列同源质粒耐药信息与志贺菌耐药的关系

    作者:张冰;王鹏飞;段广才;梁文娟;洪丽娟;王琳琳;郭向娇;杨海燕;郗园林

    目的 比较志贺菌耐药信息与其spacer同源质粒或噬菌体耐药信息的关系.方法 应用CRISPR Target和BLAST寻找spacer同源质粒和噬菌体,根据登记号在NCBI或GenBank中寻找目标质粒或噬菌体上的耐药信息;应用Bioedit软件寻找GenBank中志贺菌的的耐药信息.结果 数据库及临床分离株志贺菌共52条spacer中有7个spacer与4个携带耐药基因的质粒同源;间隔序列CRISPR2-mel-3同源质粒pUMNF18_IncFV及携带该间隔序列的志贺菌mel-ss1998011/zz、mel-ss1998024/zz、mel-sf2005082/sx、mel-sf2013004/bj均含有相同耐药基因blaTEM、aadA2和dfrA12,间隔序列CRISPR-Q1-S1、CRISPR-Q4-S1同源的质粒pM5A24P及该间隔序列所在志贺菌sd1012均携带耐药基因ampC和tetB;间隔序列CRISPR3-mel-33同源质粒plasmid:5与该间隔序列所在志贺菌mel-sf2000102/zz均携带相同耐药基因ampH、mrdA,且二者均携带毒力相关基因yafO、yafN、virK、ldrB、ychO.该质粒上还存在I-F型CRISPR/Cas系统.结论 志贺菌spacer同源质粒与该菌耐药信息分布存在相似性;CRISPR可能对志贺菌的耐药和毒力实现共调控.因此推测在初前间隔序列整合到CRISPR基因座形成一个新的间隔序列的过程中,志贺菌可能将携带前间隔序列外源遗传物质的其他基因片段如耐药基因和毒力基因也整合到志贺菌基因组中,影响其生存及性状.

  • Ⅱ型成簇恒间隔短回文序列及相关蛋白系统(CRISPR/Cas)研究近况

    作者:王蕾;马丽俐;孙桂芹;李蒙;策力木格;陈力

    1987年在大肠杆菌K12的碱性磷酸酶( iap)基因的3′侧翼区首先发现了一类具有短回文特质的DNA重复序列[1]。2002年,这类结构被正式命名为成簇恒间隔短回文重复序列(CRISPR),CRISPR关联蛋白也同时得以命名[2]。2005年,3个研究课题组同时发现间隔序列可能源自于细菌染色体外的其他遗传物质,如噬菌体和接合质粒,并推论CRISPR/Cas系统可以抵制入侵的外源 DNA[3-5]。2007年,来源于侵染噬菌体的新的整合间隔序列得到实验验证;研究同时建立了新获得的间隔序列与细菌抵抗该噬菌体侵袭的直接关联关系,证明了CRISPR/Cas系统是抵抗噬菌体的获得性免疫系统[6]。 Marraffini和Sontheimer[7]证实CRISPR/Cas系统对于接合现象和质粒转化的干扰作用。近基于CRISPR/Cas作用机制的研究,发现了其在细菌毒力、致病性以及如何逃避宿主免疫系统等方面的相关作用[8]。

  • RAG蛋白在V(D)J重组中的作用

    作者:詹曦菁;秦尧勇

    在淋巴细胞发育过程中成熟的免疫球蛋白和T细胞抗原受体基因是由彼此分离的编码基因片段组装而成的,这个过程被称为V(D)J重组,是由位于每个编码基因片段两端的重组信号序列(recombination signal sequences,RSS)介导的.该序列是由高度保守的具有回文结构的七聚体和富含A+T的九聚体及它们中间相对不保守的间隔序列(12或23bp)组成.正常体内重组过程遵循着12/23规则[1].

  • 志贺菌中成簇的规律间隔短回文重复序列的特点及其关联性分析

    作者:王颖芳;王鹏飞;段广才;郗园林;张晓萌;詹煜慧

    目的:利用数据库和临床分离的志贺菌菌株分析志贺菌中成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)的特点,探讨CRISPR-Q1的特性及CRISPR间的关联性.方法:根据志贺菌基因组数据库利用引物序列和PCR扩增获得志贺菌的CRISPR序列信息,采用多序列比对等方法获得每个菌株中CRISPR的分布、间隔序列数及序列特点;利用BLAST分析CRISPR-Q1中重复序列和间隔序列,检测重复序列和间隔序列在菌株中的分布特点以及CRISPR-Q1在菌株中的位置及特征;分析数据库和实验室中志贺菌CRISPR-Q1中间隔序列数与CRISPR1或CRISPR2的关系.结果:在数据库107株志贺菌中,106株志贺菌含有CRISPR1或CRISPR2,8株志贺菌的CRISPR1或CRISPR2含有多个间隔序列;106株志贺菌含有CRISPR-Q1,其中有13株志贺菌的CRISPR-Q1中有多个间隔序列.在实验室12株志贺菌中,有6株含有CRISPR1或CRISPR2,12株均含有CRISPR-Q1;CRISPR-Q1间隔序列中的一部分(约35 bp)在同一个菌株的染色体基因组上分布广泛,重复序列同样如此,CRISPR-Q1中还存在基因外重复序列(REP)元素.数据库志贺菌中的CRISPR-Q1间隔序列数与CRISPR1和CRISPR2有关联(χ2=61.6,P<0.01),实验室志贺菌中的CRISPR-Q1间隔序列数与CRISPR1和CRISPR2有关联(P=0.015).结论:CRISPR-Q1在志贺菌中广泛分布,其序列中存在REP元素;志贺菌的CRISPR1和CRISPR2与CRISPR-Q1有关联.

  • 结核分枝杆菌的间隔寡核苷酸分型法(Spoligotyping)

    作者:邹佩原;蒋伟利

    结核分枝杆菌是引起结核病的主要病原体.近年来,针对结核分枝杆菌的分子生物学研究方法日臻成熟,Spoligotyping分型就是其中的一种.它是指针对多种不同的间隔序列(位于结核分枝杆菌染色体上DR序列之间),设计各自特异的寡核苷酸探针,并固定在尼龙膜上,引物标记后的扩增产物与膜上的探针进行反向杂交.由于不同菌株的间隔序列不同,因此导致杂交的探针数量和种类也不同而产生多态性.这种方法在流行病学研究中可以用来调查结核病暴发流行,追踪和寻觅传染源,确定结核病及耐药结核病的传播机制,鉴定实验室交叉污染或院内感染和阐述结核分枝杆菌菌株分布及优势株的情况.

  • 胰蛋白酶原基因与T淋巴受体Vβ7.2片段之间的间隔序列分析

    作者:郑宗富;谢仁伟;刘永平;徐国焱;陈少华

    目的 鉴定人类T淋巴细胞受体β链基因(T cell receptor beta-chain,TCRβ)上两个毗邻基因,即胰蛋白酶原基因(cationic trypsinogen,PRSS1)与TCR V137.2片段之间的间隔序列在胰腺炎和健康人群中的分布情况.方法 对来自3位胰腺炎患者及2位健康体检者的DNA样本利用特异引物进行聚合酶链反应(PCR)扩增,产物经电泳、纯化后直接测序,并分析该序列的碱基在胰腺炎组和正常人群中的组成情况.结果 利用自行设计的引物在2份胰腺炎患者外周血DNA样本中扩增出片段长度约为2.6 kb的条带,DNA测序结果显示两个毗邻基因之间的片段存健康人群和胰腺炎人群中均不是稳定组成.结论 TCRβ序列中胰蛋白酶原基因(PRSS1)与TCR Vβ7.2基因之间间隔序列存在不稳定性.

  • 志贺菌成簇的规律间隔的短回文重复序列系统结构特征的生物信息学分析

    作者:王鹏飞;王颖芳;段广才;薛泽润;王琳琳;郭向娇;杨海燕;郗园林

    利用生物信息学方法探索志贺菌成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)系统结构的特征.本文通过BLAST、序列比对、RNA二级结构预测等方法对志贺菌CRISPR进行研究.结果显示:志贺菌的4个群中均发现有CRISPR结构,其侧翼上、下游序列可分为相同组群,在leader序列中存在具有回文性质、相对保守的motif;侧翼序列与重复序列具有相同的分组,重复序列有一定的保守性,可以形成以“茎”为主和以“环”为主两类不同的RNA二级结构;间隔序列与质粒或噬菌体有一定的同源性.本研究表明重复序列与侧翼序列间存在相关性,重复序列可能作为一种识别机制来介导外源元素与Cas蛋白间的相互作用.

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