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补肾活血法对膝骨关节炎兔的TGF-β/BMPs信号通路的影响
目的:探讨补肾活血法对兔膝骨关节炎模型(KOA)中转化生长因子(TGF-β)/骨形态发生蛋白(BMPs)信号通路的影响.方法:健康清洁级新西兰兔36只,雌雄各半,按随机数字表法分为6组,即正常组、模型组、西药组和中药低、中、高剂量组.建立KOA模型,药物干预4周,利用RT-PCR、Western Blot和ELISA法检测膝关节胫骨平台软骨及关节液中的BMP-4、BMP-7、TGF-β1的mRNA和蛋白水平.结果:模型组BMP-4、BMP-7和TGF-β1的mRNA和蛋白水平明显下降,与正常组比较差异有统计学意义(P＜0.05),通过药物干预后,补肾通络方能够提高KOA兔的BMP-4、BMP-7和TGF-β1的mRNA与蛋白的表达含量.结论:本法对TGF-β/BMPs信号通路发挥调控作用,可以间接抑制软骨细胞被破坏,调节TGF-β1、BMP-4和BMP-7的分泌以保护受损的软骨细胞,进而缓解KOA进展,改善预后.
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胎儿肺Ⅱ型肺泡细胞发育中相关活性物质的表达及其意义
目的探讨诸细胞因子对肺泡Ⅱ型细胞发育、分化和成熟的调控作用.方法12～35周胎儿肺组织共13例,常规石蜡包埋、切片,用免疫组织化学技术检测FGFR、Ras-p21蛋白、BMP-4、SP-B和TTF-1的表达特征.结果FGFR率先在发育早期近端支气管上皮表达.Ras蛋白于16周在近端和远端的支气管上皮有较弱表达,18周时与FGFR一样达到表达的高峰.随着FGFR表达的增强,BMP-4开始表达.发育后期,这三者均不表达.TTF-1因子自16周起定位于上皮细胞核内,远端支气管的反应总是较近端者强.SP-B蛋白在18周胎儿肺Ⅱ型肺泡细胞内出现,伴随着TTF-1的表达,其反应由呼吸道近端逐渐往远端迁移.发育末期至成肺中,TTF-1和SP-B阳性反应均在肺泡Ⅱ型细胞中稳定表达.结论FGF-10、Ras蛋白和BMP-4对Ⅱ型肺泡细胞的作用,是通过细胞外间质的途径促使Ⅱ型肺泡细胞正常增殖分化和达到形态结构的成熟;而TTF-1因子和SP-B的表达,则为Ⅱ型肺泡细胞在胎肺发育晚期已逐渐达到功能成熟的标志,与胎儿一出生即具有自主呼吸的功能相适应.
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塞来昔布防治大鼠创伤性骨化性肌炎的研究
目的 研究塞来昔布防治大鼠创伤性骨化性肌炎(TMO)的疗效及其可能的相关分子机制.方法 制备TMO SD大鼠模型,将40只模型大鼠随机分为对照组和实验组,每组各20只.实验组予以10 mg· kg-1·d-1塞来昔布灌胃给药,qd;对照组予以等量0.9％ NaCl灌胃给药,qd.2组大鼠均给药10周.用X线片检查新骨形成情况,用免疫酶联反应法检测血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)以及跟腱组织中骨形态发生蛋白-4(BMP-4)的表达情况.结果 术后第5周,实验组和对照组的新骨形成率分别为35.00％(7只/20只)和70.00％(14只/20只),TNF-α水平分别为(73.6±15.9)和(101.5±17.3) ng·L-1,IL-6水平分别为(33.6±5.8)和(52.8±7.2)ng·L-1,差异均有统计学意义(均P＜0.05).术后第10周,实验组和对照组的新骨形成率分别为65.00％(13 只/20只)和95.00％(19只/20只),TNF-α水平分别为(55.8±12.7)和(81.7±15.6) ng·L-1,BMP-4分别为(4.5±0.3)和(5.3±0.2)μg·L-1,差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 塞来昔布对TMO有较好的防治作用,其机制可能与抑制炎症水平及下调BMP-4表达有关.
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BMP-4在肝大部切除大鼠肝再生过程中的作用
目的 通过外源性Noggin的干预,探讨BMP-4在肝大部切除大鼠肝再生过程中的作用.方法 将80只健康雄性Wistar大鼠随机分为四组,取8只作为正常对照组(NC)即0h组,余72只建立肝大部切除(partial hepatectomy,PH)模型,并随机分为生理盐水组(NS,n=24)、Noggin低剂量组(NL,n=24) 和Noggin高剂量组(NH,n=24),检测模型鼠各组在PH后12h、48h、72h肝再生率及再生肝组织中BMP-4的表达.结果 三组模型鼠肝再生率在PH术后12～72h间均呈逐渐增高的趋势,NS组与NL组和NH组在12h时间点组间差异有统计学意义(F=18.976,P<0.01),而NL组和NH组组间差异无统计学意义;48h、72h时间点三组间差异均无统计学意义.BMP-4的表达在12h时间点有所降低,三组间差异有统计学意义(F=251.423,P<0.01);在48h时间点降至低后开始回升,三组间差异有统计学意义(F=241.995,P<0.01);72h时间点BMP-4的表达增多但仍小于正常对照组的表达,三组间差异有统计学意义(F=318.637,P<0.01).结论 BMP-4的表达在外源性Noggin模型大鼠肝再生过程中的某一时间点急剧下降后逐渐回升,BMP-4在肝再生过程中起调节作用,可能参与肝非实质细胞、肝索形成及完成肝脏塑形的过程.
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富血小板纤维蛋白对兔下颌骨牵引成骨区骨形态发生蛋白-4表达的影响
目的:探讨富血小板纤维蛋白(PRF)对牵引成骨区骨形态发生蛋白-4(BMP-4)表达的影响.方法:25只大耳白兔随机分2组,分别行双侧下颌骨皮质骨切开术,一侧下颌骨牵引间隙放置PRF膜作为实验组,对侧作为对照组,分别于稳定期第3、7、14、21、28天处死一组动物,切取牵引间隙处骨痂行H-E染色和BMP-4免疫组织化学显色,细胞图像分析仪测量牵引间隙处骨痂BMP-4表达情况.结果:下颌牵引延长后牵引间隙均有新骨形成,免疫组织化学显色显示BMP-4主要定位于成骨细胞的细胞质中.实验组在稳定期3、7、14、21d BMP-4表达的阳性细胞率和阳性面积百分比均显著高于对照组,稳定期28d BMP-4表达的阳性细胞率和阳性面积百分比与对照组比较差异均无统计学意义.结论:PRF能促进兔下颌骨牵引成骨区新骨的生成,BMP-4可能在牵引成骨过程中调控组织细胞应力信号传递,发挥成骨作用.
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骨形态发生蛋白-4基因重组腺病毒载体的构建
目的:通过Cre/LoxP位点特异性重组系统构建携带人骨形态发生蛋白-4基因的重组腺病毒载体(Ad.BMP4).方法:根据GenBank获得BMP4的基因序列合成引物,经PCR扩增获得长度为1230bp的BMP4基因片断,经酶切、测序鉴定后,与腺病毒穿梭质粒pSuCMV连接,随后与5'缺陷型腺病毒右臂的质粒pBGHloxP△E1E3通过脂质体Lipofectamine2000共转染至293细胞,获得重组腺病毒Ad.BMP4,并予以扩增、纯化、鉴定.结果:经酶切电泳和测序证明获得的BMP4基因片断序列、大小和方向正确,目的基因插入的位置、方向正确,经重组、扩增和纯化后获得病毒滴度为2.9×109pfu/mi的重组腺病毒Ad.BMP4,以PCR扩增和测序的方法证实了所构建病毒含有目的基因的片断,安全性检测证明所构建的腺病毒无野生性腺病毒的存在.结论:通过Cre/LoxP位点特异性重组系统构建了腺病毒Ad.BMP4.采用的腺病毒载体点特异性重组的方法极大地提高了包装成功率,且包装成功的病毒颗粒均为含有目的基因的重组病毒,从而保证了重组过程的快速和高效.
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分化抑制因子2在先天性肾盂输尿管连接部梗阻患儿肾盂输尿管连接部组织中的表达
目的 探讨先天性肾盂输尿管连接部梗阻(PUJO)患儿肾盂输尿管连接部组织中分化抑制因子2 (Id2) mRNA的表达情况.方法 收集20例接受肾盂成形术的PUJO患儿的肾盂输尿管连接部组织,10例对照组标本来自肾母细胞瘤患儿无肿瘤转移的肾盂输尿管组织.按照部位不同将PUJO组分为扩张肾盂、狭窄段及狭窄段下正常输尿管;对照组分为肾盂和输尿管.用半定量反转录-PCR检测Id2 mRNA在不同组间表达水平.结果 PUJO组:Id2 mRNA在扩张肾盂、狭窄段输尿管间表达差异无统计学意义(P>0.05),而此2组与狭窄段下正常输尿管比较均有降低(Pa<0.05);对照组:肾盂和输尿管Id2 mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05);PUJO组扩张肾盂、狭窄段输尿管中Id2 mRNA的表达与对照组中肾盂、输尿管表达比较均显著降低(Pa<0.05),而PUJO 组狭窄段下正常输尿管Id2 mRNA表达与对照组肾盂和输尿管比较差异均无统计学意义(Pa>0.05).结论 Id2基因可能在PUJO的发病机制中发挥重要作用.
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骨形态发生蛋白-4对肝干细胞增殖与分化的影响
目的:探讨骨形态发生蛋白-4(BMP-4)对大鼠肝干细胞系WB-F344的增殖及分化的影响.方法:采用50 ng/mL的基因重组BMP-4作用于WB-F344细胞,以BMP-4拮抗剂Noggin(200 ng/mL)阻断BMP-4的作用为对照.在实验不同时间点,通过四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测BMP-4对WB-F344增殖的影响,透射电镜下观察细胞的超微结构特征,RT-PCR检测各试验组中WB-F344细胞可能分化表型特异性分子标志物的mRNA表达.结果:细胞增殖实验显示:在不同作用时间点,BMP-4干预组的细胞吸光值均高于Noggin处理组和空白对照组.透射电镜下可观察到BMP-4干预后的WB-F344细胞具有分化良好的上皮细胞的超微结构特征.RT-PCR显示BMP-4诱导WB-F344分化后,肝干细胞的肝细胞特异性分子标志物的mRNA显著表达.结论:BMP-4可促进肝干细胞WB-F344的增殖,并诱导其向肝细胞定向分化.
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龟板对脊髓损伤后大鼠功能和骨形态发生蛋白4表达的影响
目的观察龟板对大鼠损伤脊髓骨形态发生蛋白4(BMP4)表达和后肢功能恢复的影响.方法应用改良Allen脊髓损伤模型,于术后1、7、14、21、28 d分别对大鼠进行Tarlov评分和斜板试验检查后肢功能.应用免疫组织化学技术检测BMP4的表达,观察龟板对脊髓损伤后BMP4的影响.结果脊髓损伤后第1 d,在两组受损伤脊髓灰质中都可见到BMP4的表达.第14 d时达到高峰,龟板组为37.24±5.73,损伤组21.48±6.83(P＜0.05).龟板组可使损伤的脊髓BMP4持续高表达至术后第28 d,而损伤组仅持续表达至术后21 d.增加的BMP4阳性细胞数与神经功能的改善平行.结论龟板可减轻神经损伤症状和促进脊髓损伤后BMP4表达.
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人骨形态发生蛋白-4成熟肽cDNA的克隆
目的:克隆人骨形态发生蛋白-4完整成熟肽的基因.方法:根据Genebank人骨形态发生蛋白-4的基因序列化学合成两条引物,从人胎盘组织中提取得到总RNA,用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术扩增出长0.34 kb编码人骨形态发生蛋白-4(BMP-4)成熟肽的基因序列.将所得的基因片段插入克隆载体PBluescript Ⅱ SK质粒中并转化大肠杆菌TG-1,提取重组质粒,酶切鉴定并测序.结果:RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳显示一长约370bp的条带,阳性克隆质粒经双酶切可切出约350bp的片段,全自动DNA测序结果表明和Genebank中的序列完全相符.结论:通过反转录聚合酶链式反应可从人胎盘组织中成功克隆出人BMP-4成熟肽基因.
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骨形态发生蛋白-4对人始基卵泡的作用
[目的]观察骨形态发生蛋白-4(BMP-4)对人卵巢组织体外培养中始基卵泡存活和生长发育的影响.[方法]34例卵巢组织切成2 mm×2 mm×1 mm皮质片.每例标本的皮质片均随机分成3组:研究组(BMP-4组)、对照组和非培养组,培养15 d后行组织学检查、雌孕激素测定和凋亡分析.[结果]培养结束后对照组和研究组始基卵泡比例分别为58%±35%和48%±40%,低于非培养组(91%±9%),P<0.05;窦前卵泡比例分别为52%±40%和42%±35%,高于非培养组(9%±9%),P<0.05.研究组间质细胞凋亡指数和培养液孕激素浓度分别为(O.16±0.08)μg/L和(3.6±2.O)μg/L,低于对照组,对照组分别为(0.41±0.16)μg/L和(6±4)μg/L(P<0.05).[结论]BMP-4可以促进始基卵泡向窦前卵泡转化,降低细胞凋亡率,抑制孕激素分泌.是卵泡生长发育过程中的促进因子.
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BMP-4对人卵巢组织玻璃化冷冻卵泡的作用
目的 将人卵巢组织进行玻璃化冷冻和冷冻后体外培养,在培养中加入骨形态发生蛋白-4(BMP-4),探讨其在玻璃化冷冻后人卵泡的生长、转化和存活方面的作用.方法 32例人卵巢组织标本分为新鲜组,玻璃化冷冻复温后卵巢组织随机分为未培养组、基本培养液组和BMP-4培养液组,前两组直接行组织学检查,后两组体外培养15 d后行组织学检查、雌孕激素测定,评估卵泡存活和生长发育情况.结果 玻璃化冷冻后未培养组与新鲜组比较,原始卵泡、生长期卵泡占总卵泡的比率及形态正常的原始和初级卵泡百分率均差异无显著性(P>0.05);培养结束后基本培养液组和BMP-4组原始卵泡比例显著降低,生长卵泡比例显著升高,BMP-4组孕激素浓度显著低于基本培养液组(P<0.01).结论 BMP-4有助于冷冻后人卵巢组织体外培养中原始卵泡向初级卵泡的转化,可降低体外培养中颗粒细胞孕激素的基础分泌,有利于卵泡体外存活,可能是玻璃化冷冻卵泡生长发育过程中的促进因子.
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骨形态发生蛋白-4在乳腺癌侵袭及转移中作用的研究进展
骨形态发生蛋白-4(BMP-4),又名BMP-2B,是转化生长因子-β(TGF-β)超家族成员之一,不但有促进人体胚胎发育及细胞增殖、分化、凋亡的能力,而且在肿瘤增殖、侵袭及转移中起有重要作用.该文结合新研究进展,分析BMP-4和BMP-4受体在乳腺癌中的表达及其信号通路的影响因素和作用,为了解乳腺癌的发生发展,提供可能的分子机制.
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BMP-4基因单核苷酸多态性与腰椎后纵韧带骨化症关联性实验研究
目的 探讨骨形态发生蛋白-4(BMP-4)与腰椎后纵韧带骨化症(OPLL)的遗传关联性.方法 OPLL病例组和健康对照组各30例,利用聚合酶链反应(PCR)和直接测序法分析BMP-4上4个单核苷酸多态性位点6 007C＞T(rs17563)、-5 826G＞A(rs1957860)、3 564C＞T(rs2855532)和IVS -160C＞T(rs2071047)基因型及等位基因型的分布.结果 两组间位点rs17563,rs2855532基因型与等位基因型差异有统计学意义(P＜0.05).余两位点比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 BMP-4上的2个单核酸多态性位点rs17563,rs2855532等位基因型突变与OPLL的发生有关.
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过表达骨形态发生蛋白-4对小鼠诱导性多能干细胞生物学活性的影响
目的 构建过表达骨形态发生蛋白-4(BMP4)基因的慢病毒载体,探讨其过表达后对小鼠诱导性多能干细胞(iPS)生物学活性的影响.方法 采用慢病毒转染建立稳定过表达BMP4的iPS细胞株(BMP4过表达组),未作任何转染的细胞为空白组,转染慢病毒阴性对照组的细胞为空载体组.CCK8检测各组细胞增殖活性,碱性磷酸酶(ALP)活性检测细胞分化程度,荧光定量聚合酶链反应检测BMP4、成釉细胞蛋白(AMBN)、细胞角蛋白(CK)14、牙本质涎磷蛋白(DSPP)、骨唾液酸蛋白(BSP)及骨细胞特异转录因子Runx2的mRNA表达.结果与空白组及空载体组相比,BMP4过表达组的细胞增殖活性及ALP活性升高(P<0.05),Runx2、AMBN、CK14、DSPP、BSP mRNA的表达增加(P<0.05).结论 BMP4基因能够促进iPS的牙向分化.
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骨形态发生蛋白-4在高糖环境下静脉桥增殖重构进程中的作用研究
目的 观察糖尿病大鼠自体静脉桥的形态学变化以及骨形态发生蛋白-4 (bone morphogenic protein-4,BMP4)和增殖细胞抗原Ki-67在其管壁中的表达与分布情况,初步探讨BMP4在高糖环境下静脉桥增殖重构进程中的潜在作用.方法 选用8周龄的48只雄性Sprague-Dawley大鼠,随机分配为非糖尿病组(即血糖正常组,n=24)及糖尿病组(n=24),采用高脂高糖饮食联合链脲佐菌素的诱导方法构建糖尿病大鼠模型.两组大鼠均建立单侧颈外静脉-颈总动脉桥接模型,每组分别于术前,术后1周、2周和4周获取大鼠静脉桥(n=6).应用HE染色切片测算大鼠静脉桥血管壁的形态学参数,免疫组化观察Ki-67及BMP4在管壁中的表达及分布情况,逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和免疫印迹法(Western blot)检测BMP4基因和蛋白在静脉桥中的表达量.结果 在大鼠静脉桥增殖重构进程中,管壁随时间进展不断增厚,而糖尿病大鼠术后内膜和中膜厚度均高于同期的正常大鼠(P＜0.05).免疫组化提示Ki-67表达于大鼠静脉桥管壁平滑肌细胞的胞核,Ki-67的阳性表达随桥血管增殖重构进程逐渐增高,而术后糖尿病大鼠静脉桥内Ki-67的阳性细胞数高于同期的正常大鼠(P＜0.05).免疫组化提示BMP4表达于大鼠静脉桥管壁平滑肌细胞的胞浆,结合RT-PCR及Western blot检测发现,正常大鼠术后静脉桥中仅有少量BMP4的表达,而糖尿病大鼠静脉桥管壁内BMP4的阳性细胞数以及在基因和蛋白水平的表达量均随时间进展逐渐增高,并高于术后同期的正常大鼠(P＜0.05).结论 糖尿病大鼠静脉移植术后桥血管增殖性重构改变与管壁内BMP4的高表达密切相关,而BMP4可能在高糖环境下静脉桥加速失效进程中发挥了重要的促进作用.
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BMP4在合并糖尿病的冠状动脉旁路移植术患者原位静脉桥病变中的作用
目的 观察合并糖尿病的冠状动脉旁路移植术(CABG)患者大隐静脉的形态学变化以及骨形态发生蛋白-4(BMP4)在其管壁中的表达与分布情况,初步探讨BMP4在合并糖尿病患者CABG术后静脉桥病变进展中的潜在作用.方法 前瞻性配对纳入2013年1月至2014年12月于我院接受CABG的40例血糖正常患者和40例合并2型糖尿病的患者,并根据糖尿病患者是否需胰岛素治疗分为非胰岛素依赖组(n=24)和胰岛素依赖组(n=16).应用HE染色测算各组患者静脉桥血管壁的形态学参数,Western blot和免疫组化技术观察BMP4在各组患者静脉管壁中的表达及分布情况.结果 糖尿病患者大隐静脉内膜和中膜增生较非糖尿病患者显著.免疫组化显示BMP4主要表达于静脉中膜平滑肌细胞,而BMP4表达量在糖尿病患者大隐静脉管壁内较非糖尿病患者增高(P＜0.05).糖尿病患者静脉桥中BMP4的表达量与其内膜厚度(r=0.655,P＜0.01)、内膜面积(r=0.684,P＜0.01)、中膜厚度(r=0.642,P＜0.01)、中膜面积(r=0.692,P＜0.01)均呈明显正相关.结论 合并糖尿病的CABG患者大隐静脉内膜和中膜增生程度与管壁内BMP4高表达中度相关,而BMP4可能在此类患者静脉桥加速失效进程中发挥了重要的促进作用.以BMP4为靶点的治疗策略是否有助于改善糖尿病患者CABG术后静脉桥通畅率值得深入研究.
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人骨形态发生蛋白- 4cDNA的克隆和序列测定
骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)是由Urist[1]在1965年对脱钙骨基质的成骨研究中发现的.他们将脱钙骨基质移植于动物的皮下和肌肉内,可诱导软骨化骨,随后从骨中分离出了一种小分子的糖蛋白,这种糖蛋白可诱导异位宿主区间充质细胞向成骨和成软骨细胞的方向分化.BMP在组织中含量甚微,每1 000 g皮质骨仅含1～2μg[2],因而利用基因工程生产重组BMP成为必须.赵明[4]、崔有宏[5]和刘礼初[6]均在大肠杆菌中表达有活性的BMP,但多为人BMP-2成熟肽的不同长短的片段,尚未见有克隆BMP-4基因的报道,所以,本实验研究利用RT-PCR技术,从成熟人的胎盘组织中扩增出长0.34kb编码人胎盘BMP-4短肽的基因序列,为进一步在大肠杆菌中表达打下了基础.
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BMP-4基因/TGF-β1对兔火器性股骨缺损的治疗作用
目的 观察BMP-4基因联合TGF-β1对火器性股骨缺损的修复作用. 方法 用火器性钢珠造成兔股骨中段缺损,伤后2周于骨缺损上、下端和中部注射经体外鉴定的BMP-4基因和TGF-β1.用RT-PCR和Western blot检测BMP-4 mRNA与蛋白在体内的表达,用碱性磷酸酶(ALP)活性和钙含量检测局部组织的成骨能力,用病理学和X线检查成骨过程和质量. 结果 注射后BMP-4 mRNA和蛋白可在体内表达6周.实验组ALP活性伤后8周时增加到(13.17±0.51)U/100 ml,显著高于对照组的(8.77±0.44)U/100 ml,提示实验组的成骨能力增强,钙含量检测与此相符.病理学和X线检查证明实验组成骨过程加快,成骨质量提高. 结论 BMP-4基因/TGF-β1对火器性骨缺损有明显的促修复作用.
