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左归丸及右归丸对骨髓间充质干细胞成骨及成脂分化后凋亡的影响
目的:研究左归丸及右归丸对去卵巢大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨、成脂后凋亡的影响.方法:体外分离BMSCs,采用流式细胞仪鉴定BMSCs,分别加成骨、成脂诱导剂干预并在成骨、成脂后通过地塞米松诱导凋亡,通过细胞流式仪分别检测经地塞米松诱导后成骨及成脂分化后的凋亡率.结果:流式鉴定CD29、CD90均显示为阳性,CDl lb/c为阴性;BMSCs成骨、成脂分化后,与模型组比较,左归丸及右归丸组显著降低(P＜0.05,P＜0.01),且成脂分化后右归丸的效果优于左归丸(P＜0.05).结论:左归丸及右归丸均能抑制去卵巢大鼠BMSCs成骨、成脂分化后的凋亡,且左归丸益于成骨分化,右归丸益于成脂分化.
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补肾活血汤含药血清骨髓间充质干细胞成骨-成脂分化的影响
目的:通过观察补肾活血汤含药血清对兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨-成脂分化的影响,阐明补肾活血汤在抑制兔BMSCs成脂分化、促进其成骨分化方面的作用.方法:对兔BMSCs进行成脂诱导,诱导成功后分别用补肾活血汤含药血清、通络生骨胶囊含药血清进行干预,通过油红O染色、碱性磷酸酶染色后光镜观察,细胞中甘油三酯(TG)、碱性磷酸酶(ALP)含量定量检测,观察BMSCs成骨成脂分化情况.结果:空白对照组、模型组和血清组碱性磷酸酶染色为阴性;而补肾活血汤高、中、低剂量组均呈阳性,阳性结果随剂量增加而逐渐增强;阳性药物组碱性磷酸酶染色成强阳性,且强于其他各组.空白对照组未发现红染的脂肪颗粒,而其他各组均可见明显被红染的脂肪颗粒;补肾活血汤高、中、低剂量组均有红染的脂肪颗粒分布,但这3组红染脂肪颗粒明显少于模型组,其中,补肾活血汤高剂量组和阳性药物组红染结果近似,均少于补肾活血汤中、低剂量组.与模型组相比,补肾活血汤低、中、高剂量组和阳性药物组TG含量均明显下降(P＜0.01),且随着补肾活血汤剂量的增大呈下降趋势;而补肾活血汤组和阳性药物组ALP含量均明显升高(P＜0.05,P＜0.01),且随着补肾活血汤剂量的增大呈上升趋势.结论:补肾活血汤含药血清可以抑制兔BMSCs成脂分化,同时还可以促进其成骨分化.
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左、右归丸对大鼠骨髓间充质干细胞成骨及成脂诱导的研究
目的:研究体外左、右归丸诱导大鼠骨髓充质干细胞(bone marrow stromal stem cells,BMSCs)成骨及成脂的影响.方法:以左、右归丸水煎液和阳性对照药补佳乐、蒸馏水分别给予SD大鼠灌胃取血制备含药血清,分别加成骨和成脂诱导剂干预BMSCs,成骨诱导后采用改良钙钴法检测碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)表达,成脂诱导第10天油红O染色.结果:左、右归丸组与空白组比较,可显著提高细胞中ALP活性,促进钙化结节形成;左、右归丸可减少脂滴形成,降低细胞中甘油三酯含量.结论:左、右归丸对BMSCs分化的调节具有双向性,既促进BMSCs成骨分化同时又抑制BMSCs成脂分化.
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人骨髓间充质干细胞体外扩增的生物学评估
本研究旨在对骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)进行移植前增殖分化能力测定,病毒学检查,核型分析,PCR-STR和HLA的检测,以便为临床应用提供安全、可靠的移植细胞.采用贴壁法分离骨髓MSC,在相同条件下分别考察各代细胞形态、生长、表面标记、成骨、成脂分化能力的变化情况,并进行不同生长时期的核型分析,利用HLA-SBT技术检测4个不同供者来源的MSC的HLA-Ⅰ和HLA-Ⅱ位点的高分辨分型;应用PCR-STR技术检测4个不同供者来源的MSC基因遗传标记.并且利用ELISA方法检测HIV,HBV,HCV和TP,使用PCR方法检测支原体污染.结果表明:随着传代次数增加,MSC的增殖能力、成骨能力均有所下降.在扩增过程中,MSC始终保持较高的纯度,CD29、CD44、CD105、CD166、CD73均表达阳性,CD14、CD34、CD45、CD80和CD86均表达阴性.在8代以前未发现核型变异.4个不同供者来源的MSC的HLA高分辨分型和STR基因分型结果为MSC3的TP表达阳性,MSC2在5代出现支原体污染.结论:在体外培养过程中MSC干细胞特性逐渐丢失,其中向成骨方向的分化潜能降低.MSC在8代以前可作为实验研究及临床应用的良好对象.
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人骨髓基质干细胞体外诱导成脂过程形态学变化的观察
目的了解骨髓基质干细胞(MSC)诱导成脂分化过程的形态变化,为诱导分化阶段的识别提供部分实验依据.方法由健康成年女性骨髓组织分离而得的MSC体外培养、扩增后,使用成脂诱导复合培养液诱导6-30 d,每日在Olympus相差显微镜下观察细胞形态变化或油红-O染色.结果 MSC在诱导分化前呈长梭形,随着分化的进程,逐渐趋于椭圆、类圆、直至圆形,胞体也逐渐变大.细胞在分化过程中特征性的形态学变化是细胞内脂滴的变化(相当于不成熟脂肪细胞和成熟脂肪细胞阶段),从无到有,从胞膜下脂肪小颗粒到脂滴、脂泡,经历脂滴的增多和融合过程,直至整个细胞充满大脂泡,细胞分化进入终末阶段.结论 MSC成脂诱导的过程中,分化进入不成熟及成熟脂肪细胞阶段因有特征性的脂滴变化而易识别,但从MSC分化到前脂肪细胞阶段并无明显的形态学特征,可能需通过特异性表达产物来鉴定.
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褪黑素对大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化的影响
目的 探讨褪黑素(MT)对骨髓间充质干细胞(BMSCs)成脂分化的影响,以及MT的作用机制.方法 取大鼠骨髓分离培养BMSCs,经传代脂向分化,分组进行干预.对照组为单纯脂向分化(模型)组;实验A组用MT进行干预:实验B组用MT和其受体拮抗剂2-苯基-N-乙酰色胺(LZD)共同干预.检测脂肪细胞的比例来比较各组的脂化程度,并应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测各组细胞中成脂转录因子过氧化物酶体增殖体激活受体γ(PPARγ)mRNA的表达.结果 实验A组脂化程度明显低于对照组和实验B组(P<0.05).结论 MT能抑制BMSCs向成脂方向分化,并通过其受体机制起作用.这可能与骨质疏松的病因学有关.
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鞣花酸通过Wnt/β-catenin信号途径调节成骨代谢
目的 探索鞣花酸是否能够通过Wnt/β-catenin信号通路调节BMSCs成骨代谢.方法 CCK-8实验观察鞣花酸对BMSCs增殖的影响.碱性磷酸酶染色和油红O染色检测鞣花酸对BMSCs成骨分化和成脂分化的调节作用.通过Western blot和real time PCR分析鞣花酸对BMSCs中RUNX2、ALP、Col1、PPARγ、Adipoq和β-catenin的调节作用.结果 与对照组相比,鞣花酸可以在一定程度上抑制BMSCs的增殖;通过促进BMSCs中RUNX2、ALP和Col1的表达,促进BMSCs的成骨分化;通过抑制BMSCs中PPARγ和Adipoq的表达,抑制BMSCs的成脂分化.鞣花酸可以上调BMSCs中的β-catenin,发挥促进Wnt通路的作用.结论 鞣花酸能够通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进成骨代谢.
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Notch信号在人脂肪源间充质干细胞成脂中的作用
目的 通过研究Notch在hADSCs成脂中的作用,为肥胖提供新的药物靶点.方法 分离脂肪抽吸液中的hADSCs并进行成脂诱导.RT-qPCR分析成脂中Notch1、Notch2、DLL1和DLL3的表达;DAPT抑制Notch信号,Western-blot检测NICD、p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt、PPARγ的表达.结果 所分离的细胞可成功诱导成脂.Notchl、Notch2、DLL1和DLL3表达水平在成脂过程中逐渐降低;l0μM DAPT可显著降低NICD的表达水平,PPARy表达水平升高,p-PI3K/PI3K与p-Akt/Akt表达水平均降低.同时使用PI3K/Akt激活剂IGF-1后,PPARγ表达水平下降.结论 Notch信号抑制可通过降低PI3K/Akt通路的活性促进hADSCs成脂.
关键词： 人脂肪源间充质干细胞 成脂 Notch -
杜仲叶提取物诱导羊骨髓间充质干细胞成骨及抑制其成脂肪分化
节骨代谢功能的药效作用,可促进成骨细胞增殖和碱性磷酸酶分泌.目的:探讨杜仲叶提取物诱导羊骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的同时,是否具有抑制成脂肪分化的作用.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-02/10在南昌大学第二附属医院分子中心实验室完成.材料:健康12月龄羊6只,由南昌大学提供.杜仲叶提取物由江两师大生物技术公司制备.方法:采用全骨髓法体外分离培养羊骨髓间充质干细胞,取第3代细胞,设立6组;空白对照组,加入DMEM+胎牛血清;传统成骨诱导剂组,加入含地塞米松、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸的DMEM高糖培养基;传统成骨诱导剂+杜仲叶提取物组,在传统诱导剂组基础上加入10-5g/mL杜仲叶提取物;10-4,10-5,10-6g,mL杜仲叶提取物组分别加入对应质量浓度的杜仲叶提取物.同时另取第3代细胞行成脂肪诱导,分组同上,仅将传统成骨诱导剂更换为传统成脂诱导剂.主要观察指标:成骨诱导后,钙钻法检测碱性磷酸酶活性,Yon Kossa法观察矿化结节的形成,RT-PCR法检测成骨细胞中Cbfal mRNA基因的表达:成脂诱导后,油红O染色观察骨髓间充质干细胞成脂分化情况.结果:与窄白对照组比较,各成骨诱导组细胞内碱性磷酸酶合成增多,形成矿化结节,且传统成骨诱导剂+杜仲叶提取物组、10-4,10-5g/mL杜仲叶提取物组诱导成骨情况优于传统成骨诱导剂组、10-6g/mL杜仲叶提取物组;RT-PCR显示各成骨诱导组均能高效扩增出171 bp的Cbfa1基因转录片段,且成骨细胞中Cbfa1 mRNA表达水平差异无显著性意义(P＞0.05).油红O染色结果显示,加入杜仲叶提取物的各成脂诱导组,其脂滴数量明显少于传统成脂诱导剂组.结论:杜仲叶提取物能诱导体外分离纯化培养的羊骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向分化增殖,同时抑制其向脂肪细胞分化,实现双向调节作用.
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调节骨髓间充质干细胞成骨成脂分化的因素
背景:骨髓间充质干细胞作为一类具有多向分化潜能的细胞群体,在一定诱导条件下可进行成骨或成脂分化.目的:就骨髓间充质干细胞成骨成脂分化的双向调控影响因素研究进展作一综述.方法:以"骨髓间充质干细胞,成骨,成脂"为中文检索词,以"bone marrow mesenchymal stem cells,osteogenic differentiation,adipocyte differentiation"为英文检索词,在中国知网期刊全文数据库和PubMed数据库检索(2006年1月至2016年8月)有关骨髓间充质干细胞成骨成脂分化的文献.结果与结论:转录因子、信号通路、小分子化合物等是调控骨髓间充质干细胞分化方向的关键因素,这些因素不是单独发挥作用的,而是相互作用,共同调控骨髓间充质干细胞的分化方向.所以基于这些关键分子来干预骨髓间充质干细胞成骨成脂分化方向的技术,可能是将来进行细胞治疗的重要手段,进而运用于组织工程和再生医学.此外,生物钟也可通过调控相关信号通路或转录因子对其成骨成脂分化产生影响.
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绿色荧光蛋白标记兔骨髓间充质干细胞的成骨及成脂潜能
背景:为便于进一步追踪骨髓间充质干细胞,常需对其进行标记.目的:采用绿色荧光蛋白标记兔骨髓间充质干细胞,观察标记后其诱导成骨及成脂能力.设计、时间及地点:细胞观察实验,于2007-12/2008-10在华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科实验室进行.材料:4月龄健康新西兰大耳白兔6只,购自华中科技大学同济医学院动物实验中心.方法:无菌条件下取兔双侧股骨,应用密度梯度离心法及贴壁法分离纯化骨髓间充质干细胞.取传至第3代细胞,用脂质体介导法将绿色荧光蛋白质粒转入,经G418筛选得到稳定转染的细胞,分别进行成骨、成脂诱导.主要观察指标:骨髓间充质干细胞的形态、表面标志表达、绿色荧光蛋白标记情况,骨髓间充质干细胞成骨、成脂分化潜能.结果:经原代及传代培养的骨髓间充质干细胞多呈纺锤形或梭形,成纤维细胞样,流式细胞仪分析骨髓间充质干细胞CD44呈阳性表达,CD34呈阴性.经G418筛选后,镜下可见大量发出绿色荧光的骨髓间充质干细胞.骨髓间充质干细胞成骨诱导21 d后有较多的钙盐沉积,茜素红染色呈红色;成脂诱导3 d后,细胞内有小脂滴出现,2周后油红O染色示有大量脂质沉积.结论:绿色荧光蛋白标记的兔骨髓间充质干细胞经诱导培养后具有多向分化潜能.
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成纤维细胞生长因子处理多次传代培养骨髓间充质干细胞的增殖与分化
背景:骨髓间充质干细胞来源有限,而且在多次体外传代培养过程中,其细胞形态、增殖及多向分化能力会发生改变.目的:探讨成纤维细胞生长因子对经过多次传代、细胞形态发生改变的骨髓间充质干细胞形态、增殖及多向分化能力的影响.方法:①体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,连续传代培养6次,观察其细胞形态变化;②将第6代细胞接种于96孔板中,随机分为对照组和成纤维细胞生长因子处理组,相应培养1,2,3,4,5,6,7 d后,用CCK-8试剂盒检测细胞增殖状况;③将第6代细胞接种于6孔板中,随机分为对照组和成纤维细胞生长因子处理组,分别用普通培养基和含成纤维细胞生长因子培养基培养7 d,换成骨、成脂、成软骨诱导培养基继续培养7 d,应用荧光定量PCR法检测成骨(RUNX2、ALP、OCN)、成脂(PPARγ2、AP2、ADIPOQ)、成软骨(SOX9、Col agen II、aggrecan)相关基因的表达,应用蛋白印记法检测RUNX2、PPARγ2、SOX9蛋白的表达;④将第6代细胞接种到6孔细胞培养板中,随机分为对照组及成纤维细胞生长因子处理组,分别用普通生长培养基及含成纤维细胞生长因子的生长培养基培养7 d,换用成骨、成脂、成软骨诱导培养基继续培养14 d,进行茜素红染色、油红O染色和阿利新蓝染色.结果与结论:①经过连续6次传代培养,骨髓间充质干细胞形态发生明显变化,成纤维细胞生长因子处理7 d后其形态逐渐恢复原代特性;②与对照组相比,培养第3-7天成纤维细胞生长因子处理组的细胞增殖速度明显加快,差异有显著性意义(P<0.05);③与对照组相比,成纤维细胞生长因子处理组细胞成骨相关基因(RUNX2,ALP,OCN)、成脂相关基因(PPARγ2,AP2,ADIPOQ)、成软骨相关基因(SOX9,colagen 2,aggrecan)表达明显升高,差异有显著性意义(P<0.05);④成纤维细胞生长因子处理组RUNX2、PPARγ2、SOX9蛋白表达明显高于对照组(P<0.05);⑤与对照组相比,成纤维细胞生长因子预处理组细胞产生胞外钙结节的数量、细胞内脂滴的数量、细胞酸性黏多糖的表达明显增加;⑥结果表明,成纤维细胞生长因子可以维持多次传代骨髓间充质干细胞的干细胞特性.
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大鼠来源滑膜间充质干细胞的成软骨分化
背景：相比其他组织来源的间充质干细胞，滑膜间充质干细胞有着较强的成软骨特性和克隆能力，因此将是软骨组织工程中有前景的种子细胞之一。
目的：培养及体外扩增 SD 大鼠滑膜间充质干细胞，鉴定其多向分化潜能及在添加生长因子后三维立体培养条件下的成软骨能力。
方法：无菌条件下获取SD大鼠滑膜组织，Ⅰ型胶原酶消化法分离大鼠滑膜间充质干细胞。体外扩增、培养，取第3代滑膜间充质干细胞进行吉姆萨、生长曲线测定、成脂诱导、成骨诱导和三维条件下成软骨诱导，成软骨诱导21 d后通过甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色及RT-PCR对成软骨诱导后产物进行检测。
结果与结论：获取的大鼠滑膜细胞具有间充质干细胞的特性，滑膜间充质干细胞在体外培养呈成纤维样形态，并维持着多向分化的能力。使用生长因子诱导软骨细胞21 d后，可见软骨样组织，蛋白聚糖和Ⅱ型胶原可以在甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色后被检测到。RT-PCR 检测结果显示软骨诱导分化后细胞中Ⅱ型胶原和蛋白聚糖mRNA呈阳性表达。提示大鼠来源的滑膜间充质干细胞具有成软骨能力。 -
左、右归丸对去卵巢大鼠BMSCs成骨、成脂分化后Caspase-3/Bcl-2的影响
目的 观察左、右归丸对去卵巢大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖及成骨、成脂分化后凋亡蛋白表达的影响.方法 60只雌性SD大鼠,取40只切除双侧卵巢制备模型,随机均分为模型组(1.0 g/kg蒸馏水)、左归丸组(9.45 g/kg左归丸)、右归丸组(10.26 g/kg右归丸)和补佳乐组(0.09 mg/kg戊酸雌二醇),另取10只作为空白组(1.0 g/kg蒸馏水),10只双侧切除卵巢周围少量脂肪作为假手术组(1.0g/kg蒸馏水),各组灌胃给药12周后,处死大鼠,取股骨和胫骨体外培养BMSCs,采用MTT法检测细胞增殖,Western blot法观察半胱天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)和B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)的蛋白表达.结果 MTT法显示,左、右归丸对BMSCs增殖有促进作用,左归丸效果更佳.成骨分化后,与空白组相比,模型组Caspase-3蛋白表达上调(P ＜0.05,P＜0.01),Bcl-2蛋白表达下调(P＜0.01);与模型组相比,左归丸组、右归丸组Caspase-3蛋白表达下调而Bcl-2蛋白上调(P ＜0.05,P＜0.01).成脂分化后,与空白组比较,模型组、左归丸组和右归丸组Caspase-3蛋白表达显著上调,Bcl-2蛋白下调(P＜0.05),成骨、成脂分化后左归丸组与右归丸组比较均有显著性差异(P＜0.05).结论 左、右归丸均能抑制去卵巢大鼠BMSCs成骨、成脂分化后的凋亡,且左归丸有益于成骨分化,右归丸有益于成脂分化.
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SD大鼠骨骼肌卫星细胞系的建立及诱导其向成肌、成脂和成骨分化
目的:建立SD大鼠骨骼肌卫星细胞的细胞系,为组织工程学提供种子细胞和研究资料.方法:采用两步酶消化法结合差速贴壁技术,获得较高纯度的骨骼肌卫星细胞.MTT法观察骨骼肌卫星细胞的体外增殖特性并绘制生长曲线图,流式细胞仪检测细胞周期.观察不同诱导条件下骨骼肌卫星细胞的成肌、成脂、成骨的分化特性.结果:骨骼肌卫星细胞可传50代以上,第7代时,倍增时间约为60 h,80.7%的细胞处于G1期,在特定诱导作用下骨骼肌卫星细胞可以向成肌、成脂、成骨方向分化,显示了骨骼肌卫星细胞的多向分化潜能,成功建立了骨骼肌卫星细胞的细胞系.结论:建立了SD大鼠骨骼肌卫星细胞系,为组织工程学提供种子细胞.
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microRNAs在骨代谢中的研究进展
microRNAs(miRNAs)是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA,参与了各种重要的细胞生物学过程.研究表明miRNAs能够调控成骨细胞,破骨细胞,软骨细胞和成脂分化,维持骨形成和骨吸收的平衡,是生物器官发育和某些骨代谢疾病的重要调控因子,该文就在这些方面的研究进展作一综述.
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胎儿骨髓间充质干细胞生物学特性的研究
目的:分离培养胎儿骨髓间充质干细胞(fetus mesenchymal stem cells,fMSCs),分析其基本的生物学特征,如形态特征、增殖特性、细胞表型和多向分化潜能以及核型分析等,为其临床应用提供理论依据.方法:淋巴细胞分离液分离胎儿骨髓MSCs,在相同条件下分别考察各代细胞形态、生长、表面标记的变化情况,并进行不同生长时期的核型分析、细胞周期检测等.结果:在扩增过程中,MSCs的增殖能力随着代数增加而降低.在扩增至第3代时,MSCs表现出较高的纯度,表达CD29、CD44、CD105、CD166,不表达CD34、CD45.10代之前核型未发生变异,仍具成骨成脂分化能力,细胞周期分析显示其仍具有干细胞特性.结论:在体外培养条件下,10代以前的细胞生长性状稳定,可作为组织工程等临床应用的良好对象.
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人绒毛膜来源的间充质干细胞成骨成脂分化潜能
目的:探讨人绒毛膜来源的间充质干细胞(hCDMSC)体外生长特性和成骨成脂分化潜能,证实人绒毛膜来源的间充质干细胞作为组织工程种子细胞的可行性.方法:取胎盘组织基蜕膜面用胶原酶和胰蛋白酶法分离培养,通过传代扩增观察细胞形态,MTT法检测细胞增殖曲线,体外向成骨、成脂诱导分化,茜素红和油红O染色鉴定细胞分化能力,RT-PCR测定骨细胞和脂肪细胞特异性基因表达.结果:hCDMSC细胞具有间充质干细胞特性,茜素红和油红O染色呈阳性反应,成骨和成脂标志性基因表达阳性.结论:人绒毛膜来源的间充质干细胞在体外诱导条件下可以向成骨细胞和脂肪细胞诱导分化,可以作为组织工程的种子细胞.
