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  • 肝豆汤对Wilson病模型TX小鼠肝细胞内铜代谢通路的分子调控机制

    作者:董健健;韩咏竹;程楠

    目的:探讨肝豆汤调控毒牛奶(TX)小鼠肝细胞内铜转运通路的分子靶点并观察其相应的调控机制.方法:20只家兔适应性喂养3d后,随机分为空白组(生理盐水)和肝豆汤组(4.5 g·kg-1·d-1),每日2次ig,连续10 d,制得含药血清;采用2步灌注法分离提取DL,TX小鼠肝细胞,采用原子吸收法检测加含不同百分含量(5%,10%,15%,20%)含肝豆汤兔血清作用24 h后,对TX小鼠肝细胞内微量元素的影响,另设空白组;蛋白质免疫印迹(Western blot)法检测经含肝豆汤兔血清作用后腺嘌呤核苷三磷酸7b(adenosine triphosphate7b,ATP7b),抗氧化蛋白1(anti-oxidant1,ATOX1),铜转运体1(coppertransporter1,CTR1),金属巯蛋白(metallothionein,MT),超氧化剂物歧化酶铜伴侣蛋白(copper chaperone of superoxide dismutase,CCS),细胞色素氧化酶17(cytochrome-coxidase17,COX17)蛋白的表达.结果:与空白组比较,模型组TX小鼠肝细胞内铜含量升高,锌含量降低,铁含量升高,ATP7b,ATOX1,CCS,COX17蛋白表达明显降低,CTR1,MT蛋白表达显著升高(P<0.01);与模型组比较,含肝豆汤兔血清可显著降低TX小鼠肝细胞内铜含量,增加锌含量,降低铁含量(P <0.05,P<0.01);Western blot检测结果显示,含肝豆汤兔血清可明显增加ATP7b,ATOX1,CCS,COX17蛋白表达(P <0.05,P<0.01),降低CTR1,MT蛋白表达(P<0.01).结论:肝豆汤可能是通过调控细胞内铜代谢相关蛋白,上调ATP7b,ATOX1,CCS,COX17蛋白表达,抑制CTR1,MT表达,从而发挥细胞内排铜作用.肝豆汤可通过多靶点、多途径调控铜代谢通路达到降低肝细胞内铜含量的治疗效果.

  • 肝豆汤改良方对TX小鼠脑组织ASM、Cer及p38MAPK mRNA和蛋白表达的影响

    作者:徐陈陈;董健健;陈雪燕;王训;程楠;韩咏竹;胡文彬

    目的:探讨肝豆汤改良方(MGDD)对TX小鼠脑组织酸性鞘磷脂水解酶(ASM)、神经酰胺(Cer)及p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK) mRNA和蛋白表达的影响.方法:将140只TX小鼠随机分成1、3、5月龄模型组,3、5月龄MGDD组及3、5月龄丁苯酞组,每组20只,同时选用相同月龄60只DL小鼠分别为1、3、5月龄正常对照组,每组20只,饲养环境及喂食食物相同,均从入组时开始给药,MGDD治疗组按24.5g·kg-1·d-1灌胃,丁苯酞组给以丁苯酞混悬液0.156g·kg-1·d-1灌胃,正常对照组及模型组灌胃100mL·kg-1·d-10.9%氯化钠溶液,1次/d,收集处理标本,采用RT-PCR、免疫组织化学法及Wcstern blot技术检测脑组织内ASM、Cer及p38 MAPKmRNA及蛋白表达水平.结果:模型组小鼠脑组织ASM、Cer及p38 MAPK mRNA及蛋白表达程度伴随着月龄的增加,表达有增多趋势,MGDD治疗组较模型组可显著降低小鼠脑内ASM、Cer及p38 MAPK mRNA及蛋白表达水平(P<0.05,P<0.01),且随着疗程的延长,抑制更加显著.结论:MGDD可能通过下调小鼠脑组织神经酰胺信号通路中ASM、Cer、p38 MAPK mRNA及蛋白的表达水平,改善铜负荷引起的神经元损伤.

  • 中药肝豆汤含药血清对Wilson病模型TX小鼠肝细胞内ATP7b蛋白亚细胞定位和功能表达的影响

    作者:徐陈陈;董健健;程楠;韩咏竹;王训

    目的:观察肝豆汤调控TX小鼠肝细胞内铜转运通路的分子靶点,研究其调控机制.方法:免疫荧光双标记经激光共聚焦显微镜观察由含肝豆汤兔血清孵育后TX小鼠肝细胞内ATP7b蛋白的亚细胞定位变化.结果:ATP7b蛋白在DL小鼠肝细胞内定位于反面高尔基体管网状结构(TGN),位于高铜环境中则转运至顶端膜区,去除高铜环境则重新定位于TGN;ATP7b蛋白在TX小鼠肝细胞内不能定位于TGN及顶端膜区域,去除高铜环境也不能促使ATP7b蛋白重新定位于TGN.中药肝豆汤可促使ATP7b蛋白逐步重新定位于TGN.结论:肝豆汤可以通过诱-ATP7b蛋白重新定位于TGN,进而发挥细胞内排铜作用,改善Wilson病的临床症状.

  • 肝豆扶木汤对TX小鼠肝纤维化的保护作用及机制研究

    作者:唐露露;刘丹青;李睿;董婷;陈永华;江海林;杨文明

    目的 探讨肝豆扶木汤(Gandou Fumu Decoction,GDFMD)对Wilson病肝纤维化模型TX(toxic milk)小鼠TGF-β1/Sm ad信号通路表达的影响.方法 60只TX小鼠随机分为模型组、GDFMD高、中、低剂量组和青霉胺组,每组12只,另设正常组12只.GDFMD高、中、低剂量组按31.2、15.6、7.8g生药/kg进行灌胃,青霉胺组按0.1 g/kg(0.2 mL/10 g)灌胃,模型组和正常组给予等容积生理盐水,每天1次,连续灌胃4周.采用赖氏法检测血清谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)活力,溴甲酚绿法检测血清白蛋白(album in,ALB)含量;采用HE染色、Masson染色观察肝组织病理变化;采用RT-PCR和Western blot检测肝组织中TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7 mRNA和蛋白的表达.结果 (1)与正常组比较,模型组血清ALT、AST活力升高,ALB含量降低(P<0.01),与模型组比较,GDFMD高、中剂量组和青霉胺组ALT、AST活力降低,ALB含量升高(P<0.01),GDFMD低剂量组AST活力降低,ALB含量升高(P<0.05).(2)模型组可见肝纤维化特征性病理表现,备用药组均有不同程度改善.(3)与正常组比较,模型组TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA和蛋白表达升高,Smad7 mRNA和蛋白表达降低(P<0.01),与模型组比较,GDFMD高、中剂量组和青霉胺组TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA和蛋白表达降低,Smad7 mRNA和蛋白表达升高(P <0.05,P<0.01),GDFMD低剂量组TGF-β31 mRNA和蛋白、Smad2蛋白表达降低,Smad7蛋白升高(P <0.05,P<0.01).结论 GDFMD具有抗肝纤维化作用,其作用机制可能与调控TGF-β1/Smad信号通路相关因子的基因与蛋白表达有关.

  • 肝豆扶木汤对TX小鼠肝纤维化TGFβ1/Smad信号通路的影响

    作者:杨文明;唐露露;谢文婷;刘丹青;董婷

    目的 观察肝豆扶木汤(GDFMT)对 TX小鼠肝纤维化转化生长因子-β1(TGF-β1)/Smad信号通路的影响,探讨其抗肝纤维化的作用机制.方法 将24只雄性 TX小鼠随机分为模型组、青霉胺组、GDFMT组,另设正常对照组.采用竞争性放免分析法检测血清肝纤维化透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PC-Ⅲ)、Ⅳ型胶原(C-Ⅳ)含量,免疫组化法观察肝组织 TGF-β1、Smad2和 Smad7蛋白的表达.结果 血清肝纤维化指标结果:与正常对照组比较,模型组血清肝纤维化 HA、LN、PC-Ⅲ、C-Ⅳ含量均明显升高(P<0.01);与模型组比较,青霉胺组和 GDFMT组血清肝纤维化 HA、LN、PC-Ⅲ、C-Ⅳ含量均降低(P<0.05或P<0.01);与青霉胺组比较,GDFMT组血清肝纤维化 HA、LN、PC-Ⅲ、C-Ⅳ含量均降低(P<0.05).免疫组化法观察结果:与正常对照组比较,模型组 TGF-β1和 Smad2蛋白表达明显升高,Smad7蛋白表达明显降低(P<0.01);与模型组比较,青霉胺组和 GDFMT组 TGF-β1和 Smad2蛋白表达明显降低(P<0.05),Smad7蛋白表达明显升高(P<0.01);与青霉胺组比较,GDFMT组 TGF-β1和 Smad2蛋白表达明显降低(P<0.05),Smad7蛋白表达明显升高(P<0.05).结论 GDFMT可以能降低 TX小鼠肝纤维化血清学指标,具有良好的抗肝纤维化的作用,其作用机制可能是抑制 TGF-β1和 Smad2蛋白的表达,上调 Smad7蛋白的表达.

  • TX小鼠研究进展

    作者:张薇;唐彬;黎福荣

    TX小鼠(toxic milk mouse)是由DL近交系小鼠繁殖到第68代所产生的自然突变品系.主要表现为低色素化、生长迟缓、震颤和运动功能障碍等,其与Wilson病的共同点包括:遗传方式属于常染色体隐性遗传、成年小鼠体内铜大量沉积使血清铜和血清铜蓝蛋白水平降低等特点.文章从TX小鼠的病理生理学、致病机理、病理治疗学等多个方面综述了TX小鼠的研究现状.

  • 肝豆汤对tx小鼠肝脏微量元素含量及ATP7B蛋白表达的影响

    作者:陈林;艾文龙;程楠;吴君霞;胡文彬;韩咏竹

    目的 探讨中药肝豆汤对肝豆状核变性(WD)动物模型tx小鼠肝脏微量元素铜、锌、铁代谢及ATP7B蛋白表达水平的影响.方法 选择60只tx小鼠随机分为肝豆汤治疗组(n=25)和模型组(n=35),24只正常野生型DL小鼠为对照组.治疗组给予肝豆汤灌胃,模型组给予生理盐水灌胃,对照组仅常规饲养.检测各组小鼠不同月龄肝脏铜、锌、铁微量元素含量及肝组织ATP7B蛋白表达水平.微量元素检测采用原子吸收分光光度法;ATP7B蛋白表达水平分别采用免疫组化、Western blot法.结果 模型组和治疗组较同月龄对照组肝脏铜含量明显升高(P均<0.01),但治疗组铜含量显著低于同月龄模型组(P均<0.01),模型组和治疗组在5月龄内均表现出随月龄增加铜含量增加(P均< 0.01).模型组锌含量较同月龄对照组升高,但与治疗组差异无统计学意义,同时治疗组较模型组锌含量升高与铜含量降低表现出方向一致性,但并不呈现线性相关.模型组铁含量较对照组偏高,治疗组较同月龄模型组铁含量下降(P<0.01,P<0.05).ATP7B蛋白主要表达在细胞质.模型组ATP7B蛋白表达水平随月龄增加而上调,治疗组较同月龄模型组表达上调(P均<0.05).结论 肝豆汤可以降低tx小鼠肝脏细胞内铜含量,同时升高锌含量,降低铁含量;肝豆汤可上调ATP7B蛋白的表达,从而促进过量铜离子从胆汁中排出,减少铜的蓄积.

  • 肝豆汤改良方对TX小鼠脑组织XIAP、Caspase-9和Caspase-3蛋白及其mRNA表达的影响

    作者:赵雯;马艳红;韩咏竹;程楠;饶娆;王训

    目的 探究肝豆汤改良方抑制肝豆状核变性(Wilson's disease,WD)脑神经细胞凋亡的分子机制.方法 选取1月龄TX小鼠120只,随机分为TX模型组(40只)、肝豆汤改良方组(40只)、丁苯酞组(20只),另选DL小鼠40只作为正常组;每组再分成2组,各20只,分别予以生理盐水、肝豆汤改良方、丁苯酞灌胃2个月和4个月.分别采用免疫组织化学法和Western blot法检测小鼠脑组织中X-连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis,XIAP)、胱冬肽酶-9(Caspase-9)及胱冬肽酶-3(Caspase-3)蛋白表达水平,采用RT-PCR技术检测小鼠脑组织中XIAP、Caspase-9及Caspase-3 mRNA表达水平.结果 免疫组织化学检测显示,肝豆汤改良方组XIAP表达水平较同月龄模型组明显增多,Caspase-9和Caspase-3表达水平较同月龄模型组下降,5月龄和3月龄肝豆汤改良方组XIAP和Caspase-3表达水平有所差异.Western blot检测结果显示,月龄因素对脑组织XIAP、Caspase-9、Caspase-3蛋白表达水平的主效应均无统计学意义(P>0.05);月龄因素和分组因素对3种蛋白表达水平的交互作用均无统计学意义(P>0.05);对于同月龄小鼠,模型组脑组织XIAP表达水平显著低于正常组(P<0.05),Caspase-9和Caspase-3蛋白表达水平显著高于正常组(P<0.05);肝豆汤改良方组XIAP表达水平显著高于模型组(P<0.05),Caspase-9和Caspase-3蛋白表达水平显著低于模型组(P<0.05).RT-PCR检测结果显示,月龄因素对小鼠脑组织XIAP mRNA表达水平的主效应无统计学意义(P>0.05),但对Caspase-9、Caspase-3 mRNA表达水平的主效应具有统计学意义(P<0.05);月龄因素和分组因素对XIAP、Caspase-9、Caspase-3 mRNA表达水平的交互作用均无统计学意义(P>0.05).对于相同月龄小鼠,模型组脑组织XIAP mRNA表达水平显著低于正常组(P<0.05),而Caspase-9、Caspase-3 mRNA表达水平显著高于正常组(P<0.05);与模型组比较,丁苯酞组和肝豆汤改良方组XIAP mRNA表达水平显著升高(P<0.05),Caspase-9和Caspase-3 mRNA表达水平显著降低(P<0.05).结论 肝豆汤改良方通过上调XIAP蛋白及其mRNA的表达,下调Caspase-9、Caspase-3蛋白及其mRNA在脑组织中的表达,减轻铜沉积对神经细胞的氧化应激损伤,从而抑制神经细胞的凋亡.

  • Wilson病的动物模型研究进展

    作者:赵雯;程楠;韩咏竹

    Wilson病( Wilson’ s disease,WD)又称肝豆状核变性,是一种常染色体隐性遗传病,系染色体13q14.3区的ATP7B基因突变致肝细胞铜转运障碍[1],造成铜大量沉积于肝、脑、肾等组织,可出现肝硬化、神经/精神症状、肾损害、角膜K-F环等临床表现,严重者可危及生命。目前国内对于Wilson病的相关研究主要集中于分子水平的ATP7B基因和蛋白分析研究,整体水平的疾病动物模型研究和临床病理研究。

  • ATP7B基因治疗对Wilson病小鼠模型肝功能的影响

    作者:汤其强;梁秀龄;陈曦;徐评议

    目的:探讨重组真核表达质粒pcDNA3.0/ATP7B基因治疗对TX小鼠肝功能的影响.方法:TX小鼠18只,随机分为6组.采用质粒和脂质体混合后进行尾静脉注射的方式,分别给予pcDNA3.0/APTTB 0、10、20、50、100、150ìg,治疗3 d后测定其肝铜含量,确定佳治疗剂量.然后选择36只TX小鼠,随机分为生理盐水(NS)组、pcDNA3.0组和pcDNA3.0/ATP7B组,分别以NS、PCDNA3.0、pcDNA3.0/ATP7B进行治疗,于治疗后第0、3、7、14天抽血检测ALT.结果:取100 ìg为治疗剂量;pcDNA3.0/APT7B组与NS组及pcDNA3.0组比较,于治疗后第3、7、14天ALT显著下降(P<0.05),以第3天下降明显.结论:ATP7B基因重组真核表达质粒pcDNA3.0/ATP7B对TX小鼠肝功能有改善作用.

  • 骨髓干细胞移植治疗对肝豆状核变性早期TX小鼠脑肾铜代谢的影响

    作者:陈曦;丰岩清;许轶;汤其强;朱小霞;栾烁;梁秀龄

    [目的]探讨骨髓干细胞移植对于疾病早期肝豆状核变性模型鼠—TX小鼠脑、肾组织铜代谢的影响.[方法]4~5周龄的雄性DL小鼠50只为供体;2月龄的TX小鼠50只为受体(雌∶雄=3∶2),随机分为移植组和对照组各25只(雌∶雄=3∶2).分离供体小鼠骨髓干细胞并标记CM-DiI荧光,经尾静脉注入移植组TX小鼠体内,每只小鼠0.2 mL(1.2×107个细胞),对照组动物注入等量平衡盐液体.移植后的1、2、4、8、12周处死动物检测脑、肾铜含量情况,并以CM-DiI荧光示踪技术考察干细胞在受体鼠脑、肾组织的分布情况.[结果]移植治疗后脑和肾脏铜含量(脑铜平均28.7 mg/kg,肾铜平均31.7mg/kg)较对照组(脑铜平均34.5 mg/kg,肾铜平均36.9 mg/kg)均有下降趋势,达到对照组铜含量的70%~98%;移植后第4周时治疗组脑铜含量(28.4±5.5) mg/kg,仅为对照组(40.1±6.9) mg/kg的70%,改变有统计学意义(P<0.05).示踪研究在移植后各时间点均可于脑内检测到供体细胞,肾脏未检测到供体细胞.[结论]疾病早期TX小鼠接受骨髓干细胞移植治疗,对脑内铜代谢有一定改善作用,对肾脏铜代谢无明显改善作用.

  • pcDNA3.1(+)/ATP7B对TX小鼠成纤维细胞铜代谢的影响

    作者:汤其强;梁秀龄;陈曦;徐评议;王莹;徐琳

    [目的]研究Wilson病野生型基因ATP7B cDNA真核表达载体pcDNA3.1(+)/ATP7B对TX小鼠成纤维细胞铜代谢的影响.[方法]构建人Wilson病野生型基因ATP7B cDNA的真核表达载体pcDNA3.1(+)/ATP7B.随机选取TX小鼠20只构建TX小鼠的成纤维细胞模型,平行分成3组,一组未加质粒,另两组分别加入等量pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1(+)/ATP7B,观察对细胞模型铜代谢的影响.并进行免疫组化实验以观察表达是否增强.[结果]实验前未加质粒组,加入pcDNA3.1(+)组与加入pcDNA3.1(+)/ATP7B组细胞内铜含量分别为(78±20),(77±17),(75±13)ng/mg;实验后分别为(76±20),(74±13),(40±10)ng/mg.与未加质粒组和加入pcDNA3.1(+)相比,加入pcDNA3.1(+)/ATP7B组的细胞内铜含量显著下降(P皆<0.01),其细胞内ATP7B蛋白的表达明显增强.[结论]Wilson病真核表达载体pcDNA3.1(+)/ATP7B在TX小鼠成纤维细胞水平上确有排铜作用.

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