定心方通过上调CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞表达对PM2.5所致动脉粥样硬化的影响

目的:观察定心方 (DXR) 在小鼠吸入PM2.5所致动脉粥样硬化 (AS) 过程中对CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞 (CD4+CD25+Foxp3+Tregs) 表达调控的影响.方法:50只载脂蛋白E基因敲除 (Apo E-/-) 小鼠喂食高脂饲料并吸入严重污染的自然空气, 随机分为5组, DXR低、中、高剂量组分别灌胃DXR 9.29, 18.59, 37.18 g·kg-1·d-1;辛伐他汀组灌胃辛伐他汀5 mg·kg-1·d-1;模型组灌胃等剂量生理盐水;10只C57BL/6J小鼠喂食普通饲料吸入过滤空气设为正常组.16周后检测小鼠血清脂质、酶联免疫吸附测定测定 (ELISA) 检测白细胞介素-6 (IL-6), 肿瘤坏死因子-α (TNF-α), 白细胞介素-10 (IL-10) 及转化生长因子-β (TGF-β) 水平;流式细胞法检测脾脏CD4+CD25+Foxp3+Tregs数量;苏木素-伊红 (HE) 染色观察主动脉AS斑块形态学变化;蛋白免疫印迹法 (Western blot) 检测主动脉AS斑块Foxp3蛋白表达.结果:与正常组比较, 模型组小鼠主动脉AS斑块形成, 血清脂质, IL-6及TNF-α水平明显升高, IL-10及TGF-β水平明显降低, CD4+CD25+Foxp3+Tregs数量明显减少, Foxp3蛋白表达明显降低 (P＜0.05);与模型组比较, 辛伐他汀组, DXR中、高剂量组小鼠AS斑块面积明显减小, 血清脂质, IL-6及TNF-α水平明显降低, IL-10及TGF-β水平明显升高, CD4+CD25+Foxp3+Tregs数量明显增加, Foxp3蛋白表达明显增加 (P＜0.05) .结论:DXR可通过上调CD4+CD25+Foxp3+Tregs表达发挥抗PM2.5所致AS功效.

定心方上调ApoE-/-小鼠PTEN表达抑制动脉粥样硬化形成的分析

目的:探讨定心方(DXR)对ApoE基因敲除(ApoE-/-)小鼠人第十号染色体缺失磷酸酶及张力蛋白同系物(PTEN)的影响,以及DXR抗AS的可能机制.方法:将50只ApoE-/-小鼠随机分为模型组,辛伐他汀组,DXR低、中、高剂量组,另取10只C57/BL6J小鼠作为正常组.分别给予DXR低、中、高组按剂量9.25,18.59,37.18 g·kg-1 ·d-1DXR药液ig,辛伐他汀组按剂量0.005 g·kg-1 ·d-1ig辛伐他汀,高脂饲料喂养16周后处死,苏木素-伊红(HE)染色观察主动脉斑块面积,检测小鼠血脂以及血清中丙二醛(MDA),总超氧化物歧化酶(T-SOD),谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px),总抗氧化能力(T-AOC)水平.蛋白质免疫印迹(Western blot)法检测胸主动脉PTEN蛋白表达.结果:与正常组比较,模型组小鼠血脂及MDA明显升高(P＜0.05),T-SOD,GSH-Px,T-AOC水平降低,胸主动脉PTEN蛋白表达明显降低(P＜0.05);与模型组比较,DXR中、高剂量组能明显降低ApoE-/-小鼠血脂水平,升高T-SOD,GSH-Px,T-AOC水平,并降低MDA水平(P＜0.05),且能上调ApoE-/-小鼠主动脉PTEN蛋白表达水平(P＜0.05).DXR各剂量组斑块面积较模型组明显缩小(P＜0.05).结论:DXR可通过调节ApoE--小鼠血脂代谢,抑制氧化应激,上调PTEN蛋白表达,进而抑制ApoE--小鼠AS的发生发展.

To elucidate the molecular mechanism on anti-arrhythmic function of Dingxin Recipe (DXR). Methods: Cardiac myocytes isolated by trypsin method were cultured and labeled with various fluorescence stains. DXR contained serum induced changes of cellular calcium concentration 〔Ca2＋〕i, cell membrane potential (MP) and mitochondria membrane potential (MMP) were determined with laser confocal microscopy. Results: Hypoxia caused increase of 〔Ca2＋〕i and MMP, and decrease of MP, while DXR contained serum lowered the 〔Ca2＋〕i in normal or hypoxic myocytes, improved hypoxia induced MP reduction and maintain MMP at baseline level under hypoxia circumstances. Conclusion: Through inhibiting the hypoxia caused 〔Ca2＋〕i and MMP elevation and MP lowering, DXR displays its action in protecting myocardial cells to prevent and treat arrhythmia.

定心方对缺血再灌注心律失常大鼠心肌细胞凋亡的影响

定心方(Dingxin Recipe,DXR)是我校附属南方医院心律失常专科经验方,临床研究表明其对多种心律失常有显著疗效[1].心肌缺血再灌注损伤(Ischemia reperfusion injury,IRI)后发生的严重心律失常是阻碍缺血心肌从再灌注疗法中获得佳疗效的主要原因,心肌细胞的凋亡参与了心肌IRI病理生理过程.细胞凋亡(apoptosis)是不同于细胞坏死的另一种细胞死亡形式,近年来研究发现凋亡是心肌缺血再灌注损伤后心肌细胞死亡的主要原因之一,干预凋亡的发生发展可能会成为防治心肌IRI的有效策略[2,3].本实验采用整体大鼠心肌缺血及再灌注心律失常模型,研究DXR抗心肌缺血再灌注心律失常的作用,并探讨DXR对心肌细胞凋亡的影响及其机制.

定心方对大鼠缺氧及正常心肌细胞内钙、膜电位和线粒体膜电位的影响

目的：探讨定心方(DXR)抗心律失常的分子机理。方法：采用胰蛋白酶法分离培养心肌细胞，用不同荧光染料分别标记细胞，在激光共聚焦显微镜上测定DXR血清对心肌细胞内钙〔Ca2＋〕i、膜电位(MP)和线粒体膜电位(MMP)的变化。结果：缺氧使心肌细胞〔Ca2＋〕i和MMP升高，而使MP降低，DXR血清降低了正常和缺氧心肌细胞〔Ca2＋〕i，改善了缺氧引起的MP降低，使缺氧状态下MMP保持在基线水平。结论：DXR能通过抑制缺氧引起的〔Ca2＋〕i和MMP升高，及拮抗缺氧所致的MP降低，从而发挥保护心肌细胞，防治心律失常的作用。

定心方治疗南方地区冠心病心绞痛患者148例

我国对40岁以上人群调查表明,冠心病发病率为2%～4%,且有逐年增加趋势.定心方是广州南方医院的协定处方,经多年的临床观察和动物实验研究表明,其对心肌缺血再灌注损伤心律失常具有良好的防治作用.将定心方用于南方地区冠心病心绞痛患者的治疗也取得了满意的临床疗效,现将结果报告如下.

定心方和丹参酮ⅡA对心律失常大鼠血小板膜粘附分子表达的影响

目的:研究定心方(DXR)和丹参酮ⅡA(Tan)对心律失常大鼠血小板膜粘附分子表达的影响.方法:冠状动脉结扎再通制作心律失常模型,流式细胞仪测定血小板膜粘附分子表达.结果:DXR和Tan能明显降低CD41和CD62P的表达(P＜0.01),减少心律失常发生(P＜0.05);L-N-硝基精氨酸甲酯(L-NAME)能抑制丹参酮的减少血小板膜粘附分子表达以防治心律失常的作用(P＜0.05),但不能抑制DXR的该种作用.结论:DXR和Tan通过减少血小板膜粘附分子的表达防治心律失常.

定心方对大鼠缺血及再灌注心律失常的保护作用及对核因子κB活化的影响

目的 研究定心方对大鼠缺血及再灌注心律失常的保护作用及对心肌组织核因子(NF)κB活化的影响.方法 用冠状动脉结扎及再松开的方法制备缺血及再灌注心律失常动物模型;记录Ⅱ导联心电图,对心律失常进行评分;常规HE染色观察心肌组织的病理改变;免疫组化法检测心肌组织NF-κB的表达.结果 定心方干预后缺血及再灌注心律失常明显减轻(P＜0.01),心肌组织病理改变减轻,心肌组织NF-κB的表达明显减少(P＜0.01).结论 定心方对大鼠缺血及再灌注心律失常具有良好的保护作用,抑制NF-κB的活化是其机制之一.

中医药防治心肌缺血-再灌注损伤的研究进展

缺血一定时间的心肌在重新恢复血液供应后,心肌不一定都会恢复其正常功能和结构,反而出现心肌细胞损伤加重的表现,如心律失常、心功能低下等现象,即所谓心肌缺血再灌注损伤[1].这也是目前临床冠状动脉(冠脉)搭桥术、经皮冠脉腔内成形术(PTCA)及溶栓术等心脏介入性治疗常见的严重并发症.近年来,国内对中药保护心肌缺血-再灌注损伤进行了大量研究,取得一定进展,现综述如下.1 实验研究1.1 复方制剂:胡因铭等[2]在Langendorff装置上观察了炙甘草汤注射剂对大鼠离体心脏冠脉前降支结扎再灌注损伤的影响.结果表明炙甘草(8 g/L)能显著降低结扎期室性心动过速(VT)、再灌注期心室纤颤(VF)和心律失常总发生率,抑制心肌细胞肌酸磷酸激酶(CPK)和乳酸脱氢酶(LDH)的释放.炙甘草汤2、4和8 g/L均能显著降低再灌注心肌组织中的脂质过氧化物丙二醛(MDA)含量,增加超氧化物歧化酶(SOD)活性.其以上作用与钙拮抗剂维拉帕米(0.5 μmol/L)作用相似.张昱等[3]观察了保心丸(黄芪、党参、麦冬、五味子、丹参、川芎、赤芍等)对在体和离体大鼠心肌缺血-再灌注损伤的作用,证明保心丸对心肌缺血-再灌注所致心律失常和心功能低下有保护作用,并能提高心肌SOD活性,降低MDA含量,降低缺血心肌LDH释放和减轻钙超负荷,从而提示其对心肌缺血-再灌注损伤的保护作用与抑制脂质过氧化反应和拮抗钙超负荷有关.许惠琴等[4]报道心脉宁(丹参、人参、蒲黄)能缩小在体大鼠冠状动脉结扎再通后心肌梗死范围,促进离体大鼠心肌缺血-再灌注后心率(HR)、冠脉流量(CF)、心肌收缩力的恢复,改善在体和离体大鼠心肌缺血-再灌注后引起的SOD活力降低和MDA含量的升高.覃仁安等[5]在结扎大鼠冠脉左前降支45分钟再灌注后复制出的大鼠心肌缺血-再灌注损伤模型上,证实米槁心乐滴丸(由米槁挥发油、冰片、薤白醇提取物和阿魏酸钠等中药有效成分的提取物制成)能显著保护大鼠心肌组织SOD活性,降低心肌组织中MDA含量和减少心肌细胞肌酸激酶(CK)的释放,能显著缩小梗死面积,降低LDH活性并能增加血清一氧化氮(NO)浓度.张志雄等[6]发现,小白鼠结扎冠脉左室支前给予益心饮(当归、黄芪、党参、麦冬、炙甘草)可使心肌缺血-再灌注后心律失常减少,死亡率降低,左室内压(LVP)、左室压大上升及下降速率(±dp/dtmax)均显著高于生理盐水对照组(P<0.05或P<0.01),表明益心饮对心肌缺血-再灌注损伤有明显保护作用.贾钰华等[7]研究表明,定心方(苦参、黄连、酸枣仁、三七、赤芍、丹参等)对兔心肌梗死后心律失常有拮抗作用,对缺血-再灌注心律失常也有拮抗作用,定心方大、小剂量组与对照组心得安比较均有显著性差异(P均<0.01),对上述状态的心电图ST-T抬高有改善作用.定心方能提高血清SOD活性,而使腺苷酸环化酶(cAMP)、去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羟色胺(5-HT)浓度和全血黏度降低.提示定心方能拮抗心肌缺血及再灌注损伤和心律失常,其机制可能通过清除氧自由基、调节细胞第二信使、抑制交感神经系统、改善局部循环、抑制溶酶体活化使心肌细胞免受损伤而实现.赵明中等[8]观察了通心络胶囊对大鼠心肌缺血-再灌注损伤的干预作用.结果表明通心络胶囊干预后心肌梗死范围缩小,血浆CK活性下降,心肌坏死程度减轻.

定心方对高血脂症大鼠低密度脂蛋白受体的影响

目的 探讨定心方的降脂作用机制,为中药新药的研究提供科学依据.方法 将大鼠随机分为正常对照组,模型组,定心方大剂量组、中剂量组、小剂量组以及血脂康组.采用ELISA法测定各组大鼠肝脏低密度脂蛋白受体(LDLR)的表达情况.结果 与模型组相比,定心方各组和血脂康组LDLR的表达增强,其中定心方大剂量组效果佳.结论 定心方可以增强高血脂症大鼠肝脏LDLR的含量,从而增强肝脏对血脂的代谢功能,起到调控血脂水平的作用.

定心方经PI3K/Akt通路抑制人脐静脉内皮细胞迁移的研究

目的:探讨定心方(DXR)对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)迁移的分子机制.方法:将HUVEC分为空白组、模型组、DXR低、中、高剂量组和LY294002阻制剂组.除正常对照组外,其他组采用ox-LDL(终浓度为100 mg/L)造成HUVEC损伤模型,用不同浓度定心方含药血清(终浓度为0％,5％,10％,20％)和PI3K特异性抑制剂LY294002(浓度为4μmol/L)干预培养24 h.采用MTT法检测细胞增殖;细胞划痕实验和迁移实验检测各组细胞迁移情况;Western blotting法检测各组细胞中MMP9、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达情况.结果:与空白组比较,模型组可显著促进HUVEC增殖和细胞迁移,上调HUVEC内p-PI3K、p-Akt、MMP9蛋白的表达(P＜0.05);与模型组比较,DXR高、中剂量组和LY294002阻制剂组可显著抑制HUVEC增殖,降低细胞迁移数目,抑制HU-VEC内p-PI3K、p-Akt、MMP9蛋白的表达(P＜0.05).结论:体外实验表明,DXR可抑制ox-LDL诱导的HUVEC迁移,其机制可能与下调PI3 K/Akt通路抑制MMP9表达有关.

定心方防治心肌缺血再灌注心律失常大鼠的心肌蛋白质组初步研究

目的:观察心肌缺血再灌注心律失常大鼠心肌蛋白质组表达谱及定心方对其的干预作用.方法:采用冠脉结扎再松开的方法制备动物模型,采用双向凝胶电泳及计算机图像分析系统对心肌总蛋白进行分离分析.结果:模型组动物发生各种心律失常,多个蛋白质的表达发生了变化,定心方作用后,心律失常有所减轻,蛋白质表达谱也发生变化.结论:缺血再灌注心律失常的发生及定心方的干预作用可能与心肌某些蛋白质表达的变化有关.

定心方氧化苦参碱治疗大鼠缺血再灌注心律失常及对ICAM-1表达的影响

目的:研究定心方(DXR)及氧化苦参碱(OMT)对大鼠缺血再灌注心律失常的保护作用及对细胞间黏附分子1(ICAM-1)表达的影响.方法:用冠脉结扎及再松开的方法制备缺血再灌注心律失常动物模型;记录Ⅱ导联心电图,对心律失常进行评分;双抗体夹心ABC-ELISA法检测血清中ICAM-1的表达.结果:定心方及氧化苦参碱干预后,缺血再灌注心律失常明显减轻(P＜0.01),血清中ICAM-1表达明显降低(P＜0.01).结论:定心方及氧化苦参碱降低再灌注大鼠血清ICAM-1的表达,可能是其抗心律失常的机制之一.

定心方及丹参酮防治大鼠缺血再灌注性心律失常的NO机制研究

目的:研究定心方和丹参酮防治大鼠缺血再灌注性心律失常的一氧化氮(NO)机制.方法:大鼠冠状动脉结扎造成心肌缺血,松开结扎线造成缺血再灌注模型,观测定心方及丹参酮对NO及心律失常的影响.结果:NO升高时,心律失常的发生减少,定心方和丹参酮均能增加心脏血中NO含量,减少心律失常的发生.结论:定心方和丹参酮能通过增加血中NO含量而防治心律失常.

定心方对大鼠缺氧及正常心肌细胞内[Ca2+]i、细胞膜电位和线粒体膜电位的影响

目的:探讨定心方抗心律失常的分子机制.方法:大鼠击晕后取心脏,用链酶蛋白酶消化分离单个心肌细胞,再用不同荧光染料分别标记细胞,在激光共聚焦显微镜上测定定心方血清对心肌细胞内[Ca2+]i、细胞膜电位和线粒体膜电位的影响.结果:缺氧使心肌细胞内钙浓度和线粒体膜电位升高,而使细胞膜电位降低,定心方血清降低了正常和缺氧心肌细胞内[Ca2+]i,改善了缺氧引起的膜电位降低,使缺氧状态下细胞线粒体膜电位保持在基线水平.结论:定心方使细胞内[Ca2+]i降低,维持细胞膜电位和线粒体膜电位接近于正常水平.

定心方及丹参酮对血小板膜粘附分子表达的影响

应用流式细胞仪研究了定心方及丹参酮对心律失常大鼠全血血小板膜粘附分子表达的影响。结果表明，定心方能明显降低CD41和CD62P的表达(P＜0.01)，减少心律失常的发生(P＜0.05)。丹参酮也能减少CD41和CD62P的表达(P＜0.05)，减少心律失常大鼠的死亡率(P＜0.05)，表明定心方能通过降低小血板膜粘附分子的表达降低心律失常的发生。

定心方降低脂质运载蛋白-2表达抑制ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化形成的研究

目的 探讨定心方对动脉粥样硬化(AS)小鼠的防治作用及其机制.方法 50只载脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠喂食高脂饲料并随机分为5组:定心方低、中、高剂量组分别给予定心方(DXR) 9.375,18.75,37.5 g/(kg·d)灌胃;辛伐他汀组予辛伐他汀5 mg/(kg·d)灌胃;模型组予等剂量生理盐水.另设10只C57BL/6J小鼠喂食普通饲料为对照组.14周后测小鼠血清脂质运载蛋白-2(LCN-2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)及白细胞介素-6(IL-6)水平;HE染色观察主动脉组织病理形态学改变;Western blot检测主动脉LCN-2蛋白表达.结果 DXR中、高剂量组及辛伐他汀组小鼠血清LCN-2、TNF-α、MCP-1及IL-6水平、主动脉LCN-2蛋白表达及主动脉AS斑块面积均显著低于模型组(P＜0.05或P＜0.01).结论 DXR可能通过降低LCN-2表达,抑制炎症反应,显著减轻ApoE-/-小鼠AS病变.

定心方经Ang1-Tie2通路干预人脐静脉内皮细胞血管生成的实验研究

目的 探讨定心方(DXR)含药血清对氧化低密度脂蛋白(OX-LDL)诱导损伤的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)Angiopietin/Tie2(Ang1-Tie2)通路及血管形成的影响,研究DXR防治动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的机制.方法 体外培养人脐静脉内皮细胞,采用OX-LDL 100 mg·mL-1损伤人脐静脉内皮细胞24 h,分别观察DXR含药血清对其迁移及其小管形成的影响.采用免疫印迹法(Western Blot)检测血管内皮细胞生长因子(VEGF)和血管紧张素(Angiotensin1,Ang1)以及Ang1受体Tie2的表达.采用鸡胚尿囊膜实验观察(Chick embryo chorioallantoic membrane)DXR对体外血管生成的影响.结果 经DXR作用24 h后,DXR高剂量组(DXR1,30%浓度)、 中剂量组(DXR2,15%浓度)、 低剂量组(DXR3,5%浓度)、 空白组HUVEC细胞迁移数目与模型组相比,DXR1和DXR2组与Model组相比迁移细胞数量减少,差异具有统计学意义(P<0.05),DXR3、DXR2、DXR1、 空白组鸡胚尿囊膜实验中形成的一级和二级血管数目与Model组一、 二级血管数目相比,DXR3、DXR2、DXR1与Model组相比,一级血管数量明显降低(P<0.05),二级血管数量明显降低(P<0.05).Western Blot实验显示,与Model组比较,受DXR干预的HUVEC细胞中的Ang1蛋白和Tie2蛋白表达量上调,VEGF蛋白表达量下降.受DXR干预的HUVEC细胞形成小管密集程度明显低于Model组.结论 体外实验结果表明,DXR具有抑制血管生成的作用,这种效应与其可以调控HUVEC细胞内与血管生成密切相关的Ang1,Tie2,VEGF有关联.

定心方对缺血再灌注大鼠心肌PDCD5的表达的作用

目的:研究PDCD5在大鼠IRI心肌中的表达及定心方的干预作用.方法:将48只Wistar大鼠随机分为假手术组、模型组、定心方低剂量组和定心方高剂量组,采用冠脉结扎再松开的方法复制动物模型,计算心律失常评分和心肌梗死面积,荧光定量PCR法检测大鼠心肌PDCD5 mRNA水平,Western blotting法检测心肌PDCD5与p-ERK蛋白表达情况.结果:与假手术组相比,模型组PDCD5 mRNA与蛋白表达明显增高;定心方干预后两者的表达显著降低,而p-ERK的表达进一步增强,尤其是高荆量组(37.5 g/kg)变化更为明显.结论:IRI能诱导心肌p-ERK应激性增高,定心方可促进p-ERK水平进一步增高,降低PDCD5表达,其机制可能与激活ERK通路有关.

定心方下调ApoE基因敲除小鼠内脏脂肪素表达的研究

目的:观察定心方对ApoE基因敲除小鼠(ApoE-/-小鼠)主动脉粥样硬化病变的影响,并初步探讨血清内脏脂肪素(visfatin)在其中的作用.方法:将40只8周龄ApoE-/-小鼠随机分为5组.模型组灌服等剂量生理盐水；定心方低、中、高剂量组灌服定心方药液9.295g/( kg·d)、18.59g/(kg·d)、37.18g/(kg·d)；辛伐他汀组灌服辛伐他汀5mg/( kg·d).另设相同基因背景和周龄的C57/ BL/6J小鼠为空白对照组.12周后测定小鼠体质量、血清生化指标及visfatin、hs-CRP、TNF-a水平；对主动脉粥样硬化病变进行病理学检查.结果:与模型组相比,定心方低、中、高剂量组小鼠体重增加值明显降低(P＜0.05),定心方高剂量组血脂水平及血清visfatin、hs-CRP、TNF-α含量显著低于模型组(P＜0.01).定心方低、中、高组斑块面积分别较模型组减少39.3％、75.0％、86.5％ (P ＜0.01).结论:定心方可降低ApoE-/-小鼠血脂水平,抑制动脉粥样硬化的形成,其作用机制可能与降低血清visfatin水平有关.