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二甲双胍改善高脂喂养大鼠肝脏脂肪变性和促进Mfn2mRNA表达的实验研究
目的 研究二甲双胍对高脂喂养Wistar大鼠肝脏脂肪变性、胰岛素敏感性和线粒体功能的影响.方法 24只雄性Wistar大鼠分为对照组(NC)、高脂组(HF)和二甲双胍组(MF),每组8只,喂养8周后,以高胰岛素-正常葡萄糖钳夹测定大鼠胰岛素敏感性,取空腹血清测定大鼠天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、甘油三酯(TG)、空腹血糖(FBS),空腹胰岛素(FINS)的水平;将大鼠肝脏组织进行HE染色,观察肝脏组织学变化;取肝脏组织,测定肝糖原含量;提取、分离肝细胞线粒体超氧化物歧化酶,测定线粒体超氧化物歧化酶活性,以及提取肝组织总RNA,应用RT-PCR测定肝脏组织Mfn2mRNA的表达.结果 与NC组大鼠比较,HF组大鼠肝脏指数、TG、FBS、ALT、AST、INS明显升高,MF组大鼠上述各指标差异无统计学意义(P＞0.05),HF组大鼠GIR、SOD活性及肝脏组织Mfn2mRNA表达显著降低(P＜0.05).与NC组和HF组大鼠分别比较,MF组大鼠GIR (8.40±0.50,7.29±0.40 vs 12.92±8.33)、肝糖原含量(1.73±0.01,1.82±0.31 vs 12.92±8.33)、SOD活性(13.71±2.67,9.08±3.12 vs 16.72±4.80)显著增加(P＜0.05).NC和HF两组间,肝糖原含量差异无统计学意义(P＞0.05).肝组织HE染色,结果显示,HF组大鼠肝细胞体积增大,胞质中有脂滴空泡;MF组大鼠肝细胞显微结构无显著变化.结论 二甲双胍可以改善高脂诱导的肝脏脂肪变性、增加胰岛素敏感性,这一作用可能是通过促进肝细胞线粒体融合基因2 (Mfn2)表达、改善线粒体功能实现的.
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tMfn2基因抑制血管平滑肌细胞增殖的作用与机制
目的 比较线粒体融合素基因2(Mfn2)和去除穿膜区序列的大鼠线粒体融合素基因2(tMfn2)对大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖的作用,探讨tMfn2基因对VSMCs增殖的影响及其相关的信号通路.方法 用携带tMfn2基因和Mfn2基因的重组腺病毒(Adv-tMfn2和Adv-Mfn2)感染VSMCs,检测tMfn2蛋白和Mfn2蛋白在细胞中的表达水平;细胞计数法、四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测VSMCs的增殖;流式细胞术检测tMfn2基因对VSMCs周期的影响;Western blot分析各组磷酸化ERK1/2和磷酸化Raf-1蛋白表达水平的变化;采用方差分析对数据进行统计学处理.结果 Adv-tMfn2和Adv-Mfn2感染VSMCs后能有效表达出相应蛋白;细胞计数和MTT结果显示,tMfn2和Mfn2均使VSMCs增殖受到明显抑制(P<0.01),且前者较后者抑制效果更明显(P<0.01);流式细胞术结果表明tMfn2和Mfn2使多数VSMCs停滞于G0/G1期,细胞比例为(88.01±4.38)%和(67.43±6.21)%,可见tMfn2基因对细胞剧期的影响更明显(P<0.01).进一步研究表明tMfn2比Mfn2更能降低磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)和磷酸化Raf-1(p-Raf-1)的表达水平(P<0.01).结论 与Mfn2基因相比,tMfn2基因更能显著抑制VSMCs增殖,使细胞周期停滞于G0/G1期.这一作用主要通过抑制Ras-Raf-ERK1/2信号通路,下调磷酸化Raf-1蛋白表达,进而抑制ERK1/2的磷酸化而实现.
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去除蛋白激酶A磷酸化位点的线粒体融合素2基因对血管平滑肌细胞凋亡的影响
目的 研究大鼠线粒体融合素2基因在去除蛋白激酶A磷酸化位点后对大鼠血管平滑肌细胞凋亡的影响及其相关的信号通路.方法 构建携带去除蛋白激酶A磷酸化位点的线粒体融合素2基因重组腺病毒和携带线粒体融合素2基因的重组腺病毒并感染血管平滑肌细胞.Western blot分析两种基因表达产物;激光共聚焦显微镜观察其亚细胞定位;细胞凋亡ELISA法比较其对细胞凋亡的影响;Western blot分析磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)表达变化.结果 外源基因转染后可表达特异性蛋白产物,都主要分布于线粒体外膜;细胞凋亡ELISA表明,去除蛋白激酶A磷酸化位点的线粒体融合素2基因诱导血管平滑肌细胞凋亡的作用显著减弱(P＜0.01),与对照组无显著差异;Western blot检测表明,血管平滑肌细胞感染去除蛋白激酶A磷酸化位点的线粒体融合素2基因后,p-Akt表达较感染线粒体融合素2基因组显著升高(P＜0.01),与对照组无显著差异.结论 去除蛋白激酶A磷酸化位点后,线粒体融合素2基因表达产物亚细胞定位未发生改变,主要分布于线粒体外膜,但诱导血管平滑肌细胞凋亡的作用丧失,对蛋白激酶B信号通路也无抑制作用.表明蛋白激酶A磷酸化位点是调控线粒体融合素2基因诱导血管平滑肌细胞凋亡的重要功能位点.
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tMfn2基因诱导血管平滑肌细胞的凋亡
背景:线粒体融合素2蛋白,主要通过磷脂酰肌醇3激酶,蛋白激酶B诱导血管平滑肌细胞凋亡.去除穿膜区序列的线粒体融合素2蛋白,相对分子质量减小41%,诱导凋亡作用可能更强.目的:观察比较去除穿膜区序列的大鼠线粒体融合素基因2对大鼠血管平滑肌细胞凋亡的影响及其相关的信号通路.设计、时间及地点:基因水平的对比观察实验.于2008-01/10在华中科技大学同济医学院附属同济医院分子心脏病中心实验室完成.材料:大鼠血管平滑肌细胞及携带半乳糖甘酶基因、携带线粒体融合素2基因和携带去除穿膜区序列线粒体融合素2基因的重组腺病毒均由陈光慧教授惠赠.方法:将大鼠血管平滑肌细胞传代培养3～10代后随机分为4组,①空白对照组:不加干预.②携带半乳糖甘酶基因的对照组:感染携带半乳糖甘酶基因的重组腺病毒.③携带线粒体融合素2基因的实验组:感染携带线粒体融合素2基因的重组腺病毒.④携带去除穿膜区序列线粒体融合素2基因的实验组:感染携带去除穿膜区序列线粒体融合素2基因的重组腺病毒.主要观察指标:①重组腺病毒感染血管平滑肌细胞24 h后观察完整的和去除穿膜区序列的线粒体融合素2基因的表达情况.②感染后24,48和72 h采用流式细胞术、酶联免疫吸附法观察细胞凋亡情况.③免疫印迹分析病毒感染血管平滑肌细胞24 h后磷酸化蛋白激酶B表达变化.结果:①感染后完整的和去除穿膜区序列的线粒体融合素2基因在血管平滑肌细胞中均有表达.②去除穿膜区序列的线粒体融合素2基因诱导血管平滑肌细胞凋亡的作用显著增强,且呈时间依赖性(P<0.01).③两个实验组中磷酸化蛋白激酶B水平均明显降低,但去除穿膜区序列的线粒体融合素2基因实验组更显著(P<0.01).结论:去除穿膜区序列的线粒体融合素基因2诱导血管平滑肌细胞凋亡的作用更强,其机制与抑制蛋白激酶B磷酸化有关.
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阿司匹林增加高脂喂养Wistar大鼠胰岛素敏感性和Mfn2mRNA的表达
目的 研究阿司匹林对高脂喂养Wistar大鼠胰岛素敏感性和线粒体功能的影响.方法 24只Wistar大鼠,♂,分为对照组(NC)、高脂组(HF)和阿司匹林组(AF)(n=8),喂养8周后,以高胰岛素-正常葡萄糖钳夹测定大鼠胰岛素敏感性,取空腹血清测定大鼠谷草转氨酶(ALT)、谷丙转氨酶(AST)、高密度脂蛋白(HDL-C)、甘油三酯(TG)、空腹血糖(FBS),空腹胰岛素(FINS)的水平;将大鼠肝脏组织进行固定、包埋、切片和HE染色,观察肝脏组织学变化;取肝脏组织,测定肝糖原含量;提取肝细胞线粒体并分离线粒体超氧化物歧化酶,测定线粒体超氧化物歧化酶活性(SOD),以及提取肝组织总RNA,应用RT-PCR测定肝脏组织Mfn2 mRNA的表达.结果 与NC组大鼠比较,HF组大鼠肝脏指数、TG、FBS、ALT、AST、INS明显升高(P＜0.05),GIR和SOD显著降低(P＜0.05),肝脏组织Mfn2 mRNA表达显著降低,肝细胞体积增大,胞质中有脂滴空泡;AF组大鼠上述各指标差异无统计学意义,显微结构无显著变化.结论 阿司匹林可以改善高脂诱导的胰岛素抵抗及抑制脂肪肝的形成,这一作用可能是部分通过促进肝细胞Mfn2表达、改善线粒体功能实现的.
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Mfn2基因shRNA质粒的构建及其流体力学转染技术的实验研究
构建线粒体融合素基因2(Mfn2)短发卡RNA(Mfn2shRNA)表达质粒,观察流体力学注射法对绿色荧光蛋白器官靶向性.根据Mfn2基因序列,挑选1条目标基因序列和1条非特异性基因序列,构建质粒重组体并测序及鉴定.将24只BALB/c小鼠随机分为正常对照组、阴性对照组和转染组(n=8),阴性对照组和转染组分别通过尾静脉快速注入阴性对照质粒(HK)和Mfn2shRNA质粒溶液1.5 ml.24 h后采集肝脏、心脏、肌肉、肾脏组织冰冻切片,荧光显微镜下观察,并取血清测定谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)浓度.结果表明:质粒HK和Mfn2shRNA构建成功;流体力学注射后,肝脏、心肌及肾脏可见绿色荧光蛋白的表达;与正常对照组比较,阴性对照组血清ALT、AST有明显差异,转染组血清ALT、AST较正常对照组及阴性对照组明显升高.Mfn2shRNA质粒载体的成功构建,流体力学肝脏靶向性的基因转染方法,为活体内研究Mfn2功能提供了可靠的材料和方法.
