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不同水源中GⅡ型诺如病毒实时荧光逆转录聚合酶链式反应检测方法建立及应用
目的 建立不同水源中GⅡ型诺如病毒(NoV GⅡ)实时荧光逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测方法,对某市疾病预防控制中心送检的10份疑似引起诺如病毒中毒的水样进行NoV GⅡ检测.方法 以瓶装水、河水和生活污水为研究对象,采用硝酸纤维素膜-聚乙二醇(PEG)沉淀法富集病毒,对取样体积、病毒洗脱条件、PEG终浓度及PEG沉淀条件等进行了优化,提取病毒RNA、建立实时荧光RT-PCR检测方法;通过外加MS2计算方法的回收率,评价所建方法对水样中诺如病毒的回收效果.结果 建立的方法对瓶装水、河水和生活污水中NoV GⅡ的平均回收率分别为(60.1±8.0)％、(22.0±6.5)％和(35.7±8.1)％,10份送检水样中3份检出NoV GⅡ.结论 建立的实时荧光RT-PCR方法适用于瓶装水、河水和生活污水中NoV GⅡ的检测,饮用水被NoV GⅡ是引发某市人员中毒的原因之一.
关键词： 实时荧光逆转录聚合酶链式反应 GⅡ型诺如病毒 水 检测方法 -
检测鲜草莓中GⅡ型诺如病毒的两种富集方法比较
目的 建立鲜草莓中GⅡ型诺如病毒(NoV GⅡ)的实时荧光RT-PCR检测方法,评价磁珠富集法和PEG(聚乙二醇)沉淀法对检测草莓中NoV GⅡ的适用性,对北京地区采集的18份草莓样品进行检测.方法 参照ISO/TS 15216-1《实对荧光RT-PCR方法测定食品中甲型肝炎病毒和诺如病毒水平方法》合成检测NoV GⅡ的特异性引物和探针,分别采用磁珠富集法和PEG沉淀法富集病毒,然后提取RNA,建立实时荧光RT-PCR检测方法,并对提取条件进行优化.结果 磁珠富集法的高回收率为1.730％(PBS缓冲液),PEG沉淀法的高回收率为1.682％(TGBE缓冲液),18份草莓样品均未捡出NoV GⅡ.结论 通过磁珠富集法和PEG沉淀法建立的病毒检测的富集方法均适用于鲜草莓中NoV GⅡ的检测.
关键词： 实时荧光RT-PCR 鲜草莓 GⅡ型诺如病毒 磁珠富集法 聚乙二醇沉淀法 -
环境水体中GⅡ型诺如病毒浓缩研究
自行设计一种适合野外现场采样的病毒采集浓缩仪,采用一种新型阳离子膜NanoCeram,进行环境水体中GⅡ型诺如病毒浓缩研究.通过预实验,考察了预处理膜、不同的二次浓缩方法、不同洗脱液对病毒回收率的影响,随后优化整个浓缩过程并确定佳的病毒浓缩方法.结果显示,预处理膜对病毒回收影响较大,PEG-NaCl沉淀、硅藻土吸附这两种二次浓缩方法的效果相当.选择0.15mol/L Na2HPO4作为硅藻土洗脱液.确定了NanoCeram阳离子膜的病毒回收率为3.02%.后对北京市丰台区洋桥生活污水进行现场采样,成功检测到GⅡ型诺如病毒,证明该方法有效可行,适合于环境水体中诺如病毒的浓缩分离和检测.
关键词： NanoCeram滤膜 浓缩 GⅡ型诺如病毒 病毒采集浓缩仪 -
基于颜色判定的逆转录环介导等温扩增技术检测GⅡ型诺如病毒基因
建立了一种基于颜色判定的简单、快速和灵敏的逆转录环介导等温扩增(Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)方法应用于GⅡ型诺如病毒基因检测.针对诺如病毒RNA依赖的RNA聚合酶和衣壳蛋白基因序列(RNA-dependant RNA polymerase and eapsid protein gene)设计出6条特异引物,在等温条件下(65℃)进行扩增反应60min.在扩增前加入染料羟基萘酚蓝(HNB)作为反应指示剂,以其颜色变化作为结果判断标准,并经琼脂糖凝胶电泳验证.本文利用此技术对不同腹泻病毒进行了特异性分析,对体外转录的GⅡ型诺如病毒RNA的梯度稀释进行了灵敏度分析,同时与逆转录PCR (RT-PCR)方法进行比较,并对93份腹泻患者粪便中的病毒核酸进行了检测.结果显示,本研究建立的RT-LAMP方法特异性高,灵敏度达到1 000拷贝/μLRNA分子水平,与常规检测RT-PCR方法相当.对临床标本的阳性检出率也与常规RT-PCR相当.由于此方法特异性强,灵敏度较高,耗时短,结果直观,因此有望用于GⅡ型诺如病毒的现场快速检测.
关键词： 逆转录环介导等温扩增 GⅡ型诺如病毒 -
牡蛎中GⅡ型诺如病毒快速检测方法研究
目的 建立牡蛎中GⅡ型诺如病毒快速有效的检测方法,为食源性疾患疫情暴发的溯源提供可靠的实验室依据.方法 梯度稀释含有GⅡ型诺如病毒的便悬液分别加入牡蛎消化道组织匀浆中,用蛋白酶K消化-PEG6000沉淀方法富集后,实时荧光RT-PCR进行终端检测,评估灵敏度及回收率. 结果 该方法的灵敏度为3.91×103 copies/g,病毒平均回收率为6.64％. 结论 蛋白酶K消化-PEG沉淀法操作简单、快速,有望进一步优化后应用于不同贝类中病毒的检测.
关键词： GⅡ型诺如病毒 牡蛎 蛋白酶K PEG6000沉淀 荧光定量RT-PCR
