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从鼠类中检出博卡样病毒及其系统发育分析
目的 对我国啮齿类动物博卡病毒的感染情况展开调查.方法 2011-2015年,分别从辽宁大连、丹东、东港,内蒙古满洲里,西藏樟木和新疆哈密境内采集鼠类样本,采用巢氏PCR方法扩增博卡病毒NS1片段和鼠类样本的Cytb片段.结果 分别从黑家鼠、褐家鼠、黑线姬鼠、黑线仓鼠、小家鼠、黄胸鼠以及大沙鼠体内检测出博卡病毒65份.系统进化分析表明,鼠博卡病毒同已发现的其他博卡病毒属于不同的进化分支.通过对65个NS1蛋白序列分析,发现其中2个进化支氨基酸一致性小于85％.结论 可能存在2个不同的病毒种类,揭示在啮齿动物中博卡病毒有较高的多样性.
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首次从阿拉山口口岸地区沙鼠中检测到博卡病毒
目的 掌握中国-哈萨克斯坦边境阿拉山口口岸地区鼠类携带博卡病毒情况,为中哈边境口岸鼠传疾病的防控提供技术支持.方法 2016年3-11月,采用夹夜法、弓形夹法在中哈边境铁路沿线区域开展鼠类监测,利用巢式PCR法对95份鼠类样本进行博卡病毒检测.结果 共捕获鼠类300只,隶属8属12种,其中大沙鼠为优势鼠种.首次从1只大沙鼠和1只红尾沙鼠的肺脏样本中检测到博卡病毒核酸,阳性率为2.11％;2个博卡病毒NS1基因序列同源性为99.5％,在遗传进化树中单独聚为一支.结论 中哈边境阿拉山口铁路沿线区域鼠类存在博卡病毒感染,应加强该区域鼠类监测,保障口岸公共卫生安全.
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2016年集安公路桥口岸鼠类及其携带病原体调查
目的 了解集安公路桥口岸鼠类的种群构成、季节消长及其携带病原体情况,为口岸鼠传疾病监测及防控提供科学依据.方法 2016年1-12月,采用夹夜法捕鼠,用PCR和RT-PCR法检测汉坦病毒、鼠疫耶尔森菌、斑点热群立克次体、博卡病毒等6种病原体.结果 共捕获鼠类101只,隶属2目3科5属6种,平均鼠密度为2.81％,优势鼠种为褐家鼠、黑线姬鼠.在褐家鼠和大麝鼩中检测到汉坦病毒11份,阳性率12.36％;检测到博卡病毒8份,阳性率8.99％.首次在吉林省大麝鼩中检出博卡病毒.结论 集安公路桥口岸鼠密度高于无鼠害口岸的标准(1％),应大力开展防鼠工作,预防控制口岸鼠传疾病的发生和流行.
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2010-2011年苏州地区腹泻婴幼儿感染人博卡病毒的分子特征研究
目的 明确苏州地区腹泻婴幼儿博卡病毒感染情况、病毒主要基因型别及其流行病学特征.方法 收集2010-2011年苏州市儿童医院疑似病毒性腹泻患儿粪便标本832例(份),采用荧光定量PCR方法检测粪便中博卡病毒DNA,并对部分阳性标本测序明确病毒基因型.结果 832份粪便标本检出博卡病毒阳性51份,阳性率为6.1％.7-9月为博卡病毒感染高峰;96％的患儿为＜2岁,其中7～12月龄为高发年龄段;男性患儿多于女性;36例合并其他腹泻病毒感染.对35份博卡病毒阳性标本进行测序,其中28份为HBoV-1型,5份为HBoV-2型,2份型别未确定,未发现HBoV-3型及HBoV-4型.结论 苏州地区婴幼儿腹泻标本中博卡病毒以HBoV-l型为主,同时存在HBoV-2型感染.
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猪博卡病毒环状附加体的发现与鉴定
为了证实博卡病毒可以环状附加体形式存在于宿主体内,本研究利用半巢式PCR方法在健康猪粪便标本中筛查出2株猪博卡病毒环状附加体PBoV_G2-episome和PBoV_G3-episome.通过反复测序和序列拼接得到其末端非编码区序列(405nt和511nt).经过对其进行序列分析及二级结构的预测,发现PBoV_G2-episome与人博卡病毒3附加体(HBoV3-episome)结构相似,而PBoV_G3-episome与博卡病毒属其他成员的末端二级结构存在较大差别.猪博卡病毒环状附加体的发现证实了有些博卡病毒与其他细小病毒的复制方式存在一定差异,也为今后博卡病毒感染性克隆的构建提供了一条研究思路.
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儿童急性呼吸道博卡病毒感染
了解博卡病毒(Human Bocavirus, HBoV)在我国儿童急性呼吸道疾病中的感染情况.采用PCR扩增的方法对2005年10月～2006年1月收集的72例急性呼吸道感染的住院儿童鼻咽抽吸物(nasopharyngeal aspirates,NPA)进行了HBoV 基因检测.将PCR阳性产物进行TA克隆,测序,并将所测序列与GenBank中HBoV序列进行比较分析.72份标本中共检测到6份HBoV 阳性扩增产物,阳性率为8.3% (6/72),该6例HBoV阳性患儿临床均有肺炎或支气管肺炎症状.由此可以初步看出HBoV可能也是儿童急性呼吸道感染中较为重要的一个病原,且可能与儿童急性下呼吸道感染存在相关性.
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博卡病毒的检测方法概述
自2005年博卡病毒发现以来,先后在呼吸道和肠道标本中检出博卡病毒1～4型.博卡病毒1主要与呼吸道感染相关,博卡病毒2～4型主要与肠道感染相关.博卡病毒感染具有典型的咳嗽、喘息、肺炎和腹泻等临床症状,然而由于博卡病毒缺乏合适的宿主细胞而难以培养限制其致病机理等相关研究.立体上皮细胞培养平台、反向遗传学和病毒宏基因组学作为新一代技术有望成为研究博卡病毒致病机理和发现新病毒的有力工具.本文针对博卡病毒已有的电镜、细胞培养、PCR和免疫学检测方法进行综述,以期为博卡病毒的深入研究提供方法参考.
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博卡病毒2基因突变对蛋白三级结构及其进化关系的影响
目的 了解人类博卡病毒2(HBoV2)基因突变对重要功能蛋白三级结够及其进化关系的影响.方法 对瑞安地区205份小儿腹泻患者粪便标本进行HBoV2基因筛选.选取阳性样本,采用巢式PCR方法对HBoV2全基因组扩增.通过Swiss-PdbViewer对预测蛋白结构进行分析,并采用MEGA5.1软件进行进化树分析.结果 瑞安地区HBoV2阳性检出率为5.36％ (11/205).HBoV2全基因组经过拼接后为5196 bases,与参考基因组同源性达到99.79％.其中,NP1基因未发生突变,NS1、VP1和VP2基因存在有义突变.NS1测序组和对照组蛋白表面突变氨基酸疏水性质发生变化;VP1测序组和对照组蛋白空间结构和分子内部氢键分布发生变化.系统进化树分析显示,HBoV2中NSl突变造成亲缘关系变化,突变后NS1有向HBoV4演化趋势.结论 研究证明瑞安地区小儿腹泻患者存在HBoV2感染,且阳性样本中HBoV2基因发生突变.有义突变造成重要蛋白空间结构和亲缘关系变化.这些结果对研究HBoV2病毒突变后的进化方向奠定基础.
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人博卡病毒1型的近似全基因组扩增及HBoV1-4重组分析
目的 扩增人博卡病毒1型的近似全基因组序列,分析HBoV1-4之间的基因重组关系.方法 以检出HBoV1单阳性的鼻咽抽吸物为原始标本,采用PCR的方法扩增HBoV1的5个片段并测序,Blast比对确定是HBoV1片段后用DNAMAN进行序列拼接,拼接序列与已提交的近似全基因组的HBoV1在不同编码区进行同源性分析,并构建进化树；对HBoV1-4的不同编码区进行序列比对和进化分析,揭示HBoV1-4间的基因重组.结果 得到近似全长为5287 bp的HBoV1-NC序列,同源性分析发现HBoV1-NC与重庆株进化关系近,与广州株进化距离远；HBoV3可能由HBoV1和HBoV4重组进化而来,HBoV4可能由HBoV2与HBoV3重组进化而来.结论 本研究成功获得近似全基因组的HBoV-NC,HBoV1-4间存在着基因重组关系.
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儿童急性呼吸道博卡病毒感染的病毒载量与临床特征相关性研究
目的 研究急性呼吸道感染患儿人博卡病毒( human bocavirus，H BoY)病毒载量与临床特征的相关性。方法 对2009年l1月至2010年12月间956例呼吸道感染的患儿及251例健康对照组儿童鼻咽部抽吸物、咽拭子采用PCR法进行HBoV检测，进而对阳性样本进行实时荧光定量PCR法测定博卡病毒DNA载量，并结合患儿的临床检查进行综合分析。结果 实验组与对照组HBoV阳性率存在显著差异，下呼吸道感染病例HBoV的病毒载量水平与上呼吸道感染病例及对照组儿童差异均有统计学意义，上呼吸道感染病例与对照组儿童病毒载量无统计学意义，重症下呼吸道感染患儿与普通下呼吸道感染患儿HBoV的病毒载量无统计学差异，HBoV混合感染与独立感染患儿病毒载量亦无统计学差异。结论 博卡病毒常年均可引起发病，是儿童呼吸道感染的重要病原体之一，但可能不是儿童急性呼吸道感染的唯一因素。HBoV病毒载量并不能独立反映临床疾病感染的严重程度。
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太原地区儿童中人偏肺病毒及人博卡病毒感染的初步研究
目的 了解太原地区急性呼吸道感染(ARI)儿童中人偏肺病毒(hMPV)与人博卡病毒(HBoV)的流行病学及临床特征.方法 采集2012年11月至2013年2月因ARI至山西省人民医院儿科门诊就诊或住院的患儿咽拭子标本300例,应用实时PCR方法检测hMPV及HBoV.结果 所检测的300例标本中,hMPV检测阳性的标本为39例(13％,39/300),HBoV检测阳性的标本为6例(2％,6/300),主要导致急性下呼吸道感染(ALRTI).hMPV感染在＜3岁的儿童中多见,其中1～2岁年龄组检出率较高.结论 在本研究的监测时间中,hMPV是太原地区ALRTI儿童的重要病原体之一,HBoV感染率相对较低.
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人博卡病毒VP2病毒样颗粒诱导特异性细胞免疫反应的研究
目的 探讨酶联免疫斑点试验(ELISPOT)检测人博卡病毒(HBoV) VP2病毒样颗粒(VLPs)诱导特异性细胞免疫反应的佳条件.方法 HBoV VP2 VLPs免疫小鼠后,用ELISPOT方法检测小鼠的特异性细胞免疫反应,观察不同多肽刺激、不同细胞培养时间、不同细胞浓度以及不同浓度特异性刺激多肽条件下ELISPOT结果.结果 多肽P3(GYIPIENEL)及P5(LYQMPFFLL)刺激HBoV1 VLPs免疫小鼠脾脏淋巴细胞产生斑点数分别为233个/10(6)和157个/10(6)细胞,P8(GYIPVIHEL)刺激HBoV2 VLPs免疫小鼠脾脏淋巴细胞产生斑点数为113个/10(6)细胞；培养时间以24 h为佳,此时HBoV1与HBoV2实验组特异性分泌IFN-(ｒ)的比率分别为232个/10(6)和119个/10(6)细胞；小鼠脾脏淋巴细胞浓度以5×10(5)为佳,此时HBoV1与HBoV2实验组特异性分泌IFN-(γ)的比率分别为232个/10(6)和108个/10(6)细胞；刺激物浓度10μg/ml为佳,HBoV1与HBoV2实验组特异性分泌IFN-(γ)的比率分别为233个/10(6)和96个/10(6)细胞.结论 HBoV1与HBoV2特异性BABL/c小鼠T细胞表位多肽分别为HBoV1:P3；HBoV2:P8.检测人博卡病毒VP2病毒样颗粒诱导特异性细胞免疫反应ELISPOT方法佳实验条件为:培养时间24 h,细胞浓度5×10(5)细胞/孔,刺激多肽终浓度10 μg/ml,可用于HBoV在小鼠上的细胞免疫研究.
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云南一种新型蝙蝠博卡病毒的鉴定与分析
目的：进一步发现云南新型蝙蝠病毒，并鉴定云南省蝙蝠携带博卡病毒（ bocavirus ）的遗传多样性。方法对采自景洪市的26只三叶蹄蝠进行了病毒宏基因组学分析，根据其结果对博卡病毒进行了PCR检测和全基因分析。结果与结论根据检测结果，从3只（11．5％）蝙蝠的肠道中发现了一种新型博卡病毒；通过全基因组扩增和分析，发现该病毒全长5203 nt，编码NS1、NP和VP1／VP2蛋白，分析显示该病毒NS1和VP1基因分别与博卡病毒代表种犬博卡病毒（canine bocavirus）1和犬微小病毒（canine minute virus）有高的氨基酸序列相似性，达到58．7％和53．3％。依据国际病毒分类委员会病毒新种判断标准，NS1蛋白基因氨基酸序列相似性低于85％，为博卡细小病毒属新种，因而该病毒是一新博卡病毒种；该研究为进一步了解我国蝙蝠携带病毒的多样性提供了参考，同时为研究博卡病毒的宿主范围和进化关系提供了重要的基础数据。
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儿科重症监护病房患儿博卡病毒感染的临床分析
目的：研究儿科重症监护病房中呼吸道感染患儿博卡病毒感染的临床特点。方法收集2010年6月至2011年12月因急性呼吸道感染入住本院儿科重症监护病房的患儿咽拭子标本450份。应用多重PCR技术对博卡病毒和呼吸道常见病毒进行检测，博卡病毒PCR阳性结果进行基因测序确定，并分析阳性病例的临床资料。结果450份咽拭子标本中，检出博卡病毒30例（检出率6.7％）。30例博卡病毒阳性标本中，16例为单独感染，占总阳性标本的53.3％；14例为混合感染，占总阳性标本的46.7％。根据小儿危重病例评分，16例单独感染患儿中13例为＞80分（非危重），2例为80～71分（危重），1例为＜70分（极危重）；14例混合感染患儿中12例为＞80分（非危重），2例为80～71分（危重）；单纯感染和混合感染所致疾病的危重程度差异无统计学意义（ P＞0.05）。结论博卡病毒能够引起儿童重症呼吸道感染，混合感染不会增加疾病的严重程度。
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儿童呼吸道感染博卡病毒流行病学特征分析
目的 分析儿童呼吸道感染博卡病毒(human bocavis,HBoV)流行病学特征,为临床合理诊治提供参考依据.方法 收集2009年1月至2016年12月在苏州大学附属儿童医院呼吸科住院治疗的16 913例呼吸道感染患儿的痰标本和临床资料,采用实时荧光定量PCR法检测HBoV,分析HBoV检出情况.结果 16 913例患儿中,HBoV阳性检出率为5.16％(873/16913例).男性患儿HBoV阳性检出率为5.42％(573/10566例),女性患儿为4.73％(300/6347例),男性患儿HBoV检出率高于女性患儿(x2=3.928,P=0.047).＜1岁、～3岁、～7岁以及≥7岁患儿的HBoV检出率分别为4.03％(325/7963例)、8.75％(401/4584例)、3.99％(134/3357例)、1.29％(13/1009例),各年龄组HBoV检出率差异有统计学意义(x2=182.075,P＜ 0.01).春夏秋冬四季HBoV阳性检出率分别为3.36％(146/4341例)、6.92％(295/4261例)、6.88％(287/4172例)、3.50％(145/4139例),夏秋季患儿HBoV阳性检出率明显高于冬春季(x2＝93.801,P＜ 0.01).结论 苏州大学附属儿童医院2009年1月至2016年12月呼吸道感染患儿HBoV检出率为5.16％,幼儿HBoV检出率高,男性患儿高于女性.夏秋季为HBoV感染的高发季节.
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人类博卡病毒与呼吸道合胞病毒偏肺病毒感染临床特征比较
目的 探讨人类博卡病毒(HBoV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、人类偏肺病毒(hMPV)所致儿童急性呼吸道感染临床特征的差异性.方法 选取2009年2月至2010年1月苏州大学附属儿童医院呼吸科收治的1885例因急性呼吸道感染住院的患儿,应用无菌负压吸引法采集鼻咽分泌物,采用直接免疫荧光法检测呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒(ADV)、流感病毒A(InfA)、流感病毒B(InfB)、副流感病毒1(Pinf1)、副流感病毒3(Pinf3)等呼吸道常见的7种病毒；逆转录-聚合酶链反应法(RT-PCR)检测hMPV感染；实时PCR方法检测HBoV感染.重点比较RSV、hMPV、HBoV 3组患儿的感染特征.结果 1885例标本中,检测到145份HboV-PCR阳性扩增产物,阳性率为7.69％,其中单纯HBoV感染120例(82.76％),混合其他病毒感染者25例(17.24％).HBoV检测阳性率在秋季呈现高峰,感染患儿的平均年龄为22.09月龄,较RSV、hMPV感染患儿年龄大.3种病毒引起急性呼吸道感染的临床特征相似,但RSV感染患儿以气促和喘息多见,HBoV感染患儿以发热更多见.结论 HBoV是苏州大学附属儿童医院急性呼吸道感染住院患儿的常见病原之一；HBoV感染的流行病学不同于RSV、hMPV,临床特征也不完全相似.
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广东地区急性呼吸道感染儿童人类博卡病毒的流行状况
目的 了解广东地区急性呼吸道感染患儿人类博卡病毒(HBoV)的感染情况.方法 收集广东地区2007年6月至2008年5月期间呼吸道感染患儿的鼻咽分泌物447份,采用PCR法检测HBoV衣壳蛋白(VP)基因片段,阳性标本作核酸序列测定,并与基冈库中的已知序列进行序列比对和系统进化树分析.结果 447例呼吸道感染患儿标本中HBoV阳件率为5.1%.其中10例患儿与其他病毒混合感染,占阳性标本的43.5%.阳件患儿的主要临床诊断为喘息性肺炎、毛细支气管炎和支气管肺炎,年龄分布从42 d到6岁,主要集中在1岁以内,HBoV感染的季节分布偏向夏、秋及晚春.经序列比对和进化树分析.阳性株的VP基因片段与瑞典株ST1的核酸及氨基酸序列同源性分别为97.8%～98.8%及99.3%～100.0%.结论 HBoV是广东地区儿童下呼吸道感染的重要病原之一,且在1岁以内患儿中高发.该地区HBoV流行株的VP基因片段较为保守,但也存在导致氨基酸改变的突变株.
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广东地区首例人博卡病毒的检出及鉴定
目的 建立人博卡病毒(HBoV)筛查检测平台,了解广东地区支气管肺炎患儿HBoV感染情况.方法 采用PCR技术筛查HBoV核蛋白(NP)基因片段,阳性标本作HBoV衣壳蛋白(VP)基因片段鉴定,并进行核酸序列和进化树分析.结果 从50例住院支气管肺炎患儿鼻咽分泌物中检测出1例HBoV,为广东地区首例,命名为GD-1株.HBoV VP基因部分序列分析与基因库中HBov VP基因序列同源性比对,除与韩国KNIH-2K6GJ2713株同源性为36%、与美国NH4549株同源性为77%外,与其他所有VP基因序列同源性均>95%,与法国株、北京株、加拿大株的同源性>98%.GD-1株HBoV部分VP基因片段与北京CZ株、加拿大株、西班牙株、意大利株等在同一基因进化簇主分枝中,与法国175/03/2002FRA株同在一个侧枝中.结论 广东地区存在HBoV感染,有进一步研究的必要性.
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5岁以下儿童喘息性疾病与呼吸道合胞病毒、偏肺病毒、博卡病毒的相关临床分析
目的：分析5岁以下喘息性疾病患儿与呼吸道合胞病毒（RSV）、人类偏肺病毒（hMPV）、人类博卡病毒（hBoV）感染的相关性。方法回顾性分析2010年1月至2013年1月因喘息住院且咽拭子病毒PCR检测阳性的5岁以下儿童共627例的病毒检测结果及临床资料。结果检测出RSV、hMPV、hBoV阳性者共286例，其中RSV 173例（27.59%）， hMPV 70例（11.16%），hBoV 43例（6.86%）。5岁以下喘息性疾病患儿RSV感染主要集中在冬春季节，hMPV主要在春季流行，hBoV主要在夏季流行。不同年龄段组、临床诊断组以及喘息严重程度之间病毒检出分布的差异均有统计学意义（P<0.001）。RSV在<6个月、毛细支气管炎以及中度喘息的患儿中检出率高；hMPV多见于1~3岁、喘息性支气管肺炎及轻中度喘息的患儿；而hBoV的检出率与年龄、疾病临床诊断和喘息严重程度无明显关联。结论 RSV是诱发婴儿早期喘息及毛细支气管炎的常见病毒，而hMPV和hBoV也是诱发儿童喘息的重要病毒。
