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基于Smith-PID的数字PCR检测仪液路双闭环比值控制系统的设计
液路系统输出液体的精度、速度、稳定性是数字PCR检测仪实现功能的基础.针对基于微流控芯片的数字PCR检测仪中液路系统出现的大阻力、大滞后的问题,本文提出基于Smith-PID算法的双闭环控制系统的液路结构.根据注射泵、控制对象的数学模型以及Smith预估控制器原理,构建双闭环比值控制系统,并利用Simulink对于系统进行建模和仿真,得到相比于传统PID较好的系统的响应曲线.在数字PCR检测仪的液路系统验证中,对比响应曲线发现,与传统PID控制的双闭环液路相比,Smith-PID控制的双闭环比值控制系统的样品调节时间减少2/3,稀释液调节时间减少1/3,稳态误差减少8％,提高了系统流量输出的稳定性、准确性、快速性.
关键词： 数字PCR Smith-PID控制 双闭环比值控制 液路系统 -
数字PCR技术及其应用进展
数字PCR(Digital PCR,dPCR)是核酸绝对定量的新方法,该技术通过分液,将含有核酸模板的PCR反应体系分配到上万个反应器中进行PCR扩增,根据荧光信号的有或无,进行结果计数,通过泊松分布的统计处理,直接得出核酸的拷贝数.相比于实时荧光定量PCR(Quantitative PCR,qPCR),dPCR不需要建立标准曲线,应用前景更广.本文对dPCR的发展历史、原理及其应用进行了综述.
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基于微滴式数字PCR技术的甲型流感病毒绝对定量方法的建立及应用
数字PCR(Digital PCR,dPCR)是核酸绝对定量的新方法,然而,基于dPCR的甲型流感病毒(Influenza A virus,FluA)绝对定量方法还未系统建立.本研究首先对微滴式dPCR的退火温度进行了梯度优化,确定了dPCR反应的佳退火温度为64.4℃;利用FluA核酸标准品,确定了微滴式dPCR对FluA的检测范围为37.7～8.22×104拷贝/μL,检测的检出限为3.77拷贝/反应.微滴式dPCR的检测结果与标准品拷贝数的相关系数为e2=0.9988,提示该方法检测结果具有较高的可信度.用建立好的微滴式dPCR方法可对待测临床样本中的FluA进行了拷贝数定量.因此本研究建立了基于微滴式dPCR的FluA绝对定量方法,可有效地对临床样本中甲型流感病毒载量进行绝对定量,为临床研究中病毒载量的测定提供了一种技术.
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数字PCR中微滴生成尺寸与频率的数值模拟
目的 微滴合成是数字PCR中的关键技术,但其中两相流速与生成微滴大小和频率的关系尚不明确.本文采用VOF模型研究数字PCR系统中生成微滴的尺寸、频率与两相流速的关系.方法 将氟化油作为连续相,反应液(水)作为离散相,通过求解整体的动量方程和各自相的体积分数连续方程来实现相与相间的界面追踪,模拟出微通道内两相的流动情况,对不同两相流速下微通道内微滴生成的尺寸和频率进行研究.结果 在不同的流速条件下,微通道内会出现弹状流、滴状流和管状流3种流型.并且,对于弹状流和滴状流,随着连续相流速的增加,微液滴的生成尺寸减小,生成频率增加;而随着离散相流速的增加,微液滴的生成尺寸和频率都会增加.结论 在滴状流状态下,当连续相流速为0.048~0.064m/s,并且离散相流速为0.016~0.032m/s时,可高效生成数字PCR微滴.
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一种基于反相微乳液的数字PCR微滴的制备方法
目的 提出一种新型的微滴生成方式——油包水(W/O)包裹技术,为数字PCR实验过程中微滴的制备提供一种更便捷的方式.方法 通过配制一定比例的特定油相以及包含模板DNA等反应物的特定水相,在不同条件下形成W/O微滴,并进行PCR反应.结果 所形成的微滴粒径大小均匀,并且在进行PCR反应过程中热力学性能保持不变,微滴不会因温度升降而破裂,适合于数字PCR中微滴的制备.结论 生成的微滴可以有效地使模板DNA进行扩增反应.
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数字PCR在病毒检测中的应用及发展趋势
近年来数字PCR(digital PCR,dPCR)作为一种新兴的核酸扩增检测技术对比实时荧光定量PCR(real time fluorescence quantitative PCR,qPCR)以其不需要建立标准曲线,"单分子模板扩增"绝对定量,对影响PCR效率的抑制物不敏感,优异的检测灵敏性、特异性和极强的重复性以及现有的商业化平台技术的快速发展,在病毒学研究领域中越来越受到重视.本文对数字PCR在病毒检测中的应用优势以及未来发展趋势进行详细综述.
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数字PCR技术及其应用
数字PCR是继第一代、第二代PCR技术之后,迅速发展起来的一种核酸绝对定量技术.在大量反应室中独立扩增单分子核酸,采集产生的荧光信号,通过计算得到检测结果.在病原微生物检测、产前诊断以及癌基因诊断等领域发挥着重要作用.本文对数字PCR的原理、分类以及应用方面进行了综述.
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数字PCR在产前诊断中的应用研究
数字PCR是20世纪初发展起来的新型核酸定量技术,可对微量模板进行绝对定量分析,与传统定量PCR相比具有更高的准确性和敏感性.目前数字PCR已广泛应用于临床各个领域.而在产前诊断中,因数字PCR可从高背景母体DNA中识别少量胎儿DNA分子,故其在介入性产前诊断及无创产前基因诊断胎儿非整倍体疾病、单基因病等方面具有重要作用.本文就数字PCR发展、原理及其在产前诊断的应用进行综述.
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地中海贫血无创产前诊断策略新进展
地中海贫血是中国南方地区高发的单基因遗传病,携带率、发病率高,目前无根治手段,对患儿家庭带来沉重负担,目前首要预防措施是借助有创产前诊断方法取得胎儿组织并进行分子诊断,预防重型地中海贫血患儿出生.但羊水穿刺、绒毛活检等方法具有损伤胎儿风险,时间窗较窄.而无创产前诊断方法使用孕妇血浆游离DNA检测具有早期、精准、快速、无创、痛苦小等优势.随着无创产前检测技术应用于临床,单基因病无创产前诊断对于地中海贫血的防控具有重要意义.高通量测序是目前重要的无创产前检测技术平台,而数字PCR同为高通量的数字化定量工具,成本更加低廉,基于两种平台产生的诊断策略,对于多种单基因遗传病的无创产前诊断有启示意义.本文主要介绍高通量测序及数字PCR两种数字化定量平台及其相关无创产前诊断策略进展.
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利用数字PCR法检测肺癌患者血浆游离DNA中T790M突变
目的:探讨数字PCR方法检测肺癌患者中血浆游离DNA中T790M突变的效果.方法:收集40例经穿刺活检证实存在T790M突变的晚期肺腺癌耐药患者和20例正常人的外周血标本并提取血浆游离DNA,分别采用ARMS法和数字PCR法检测血浆游离DNA中的T790M突变情况.结果:40例患者标本中数字PCR法检测到32例T790M突变阳性,ARMS发检测到27例T790M突变阳性.20例正常人标本中数字PCR和ARMS法均未检测到T790M突变.结论:数字PCR法可以作为一种新的检测血浆游离DNA中T790M突变的方法.
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利用循环上皮细胞采集器捕获循环肿瘤细胞进行基因突变检测
目的:克服传统体外循环肿瘤细胞捕获技术的检出率低、样本量受限制等的不足,应用一种新型循环肿瘤细胞的分离技术并开发其下游基因突变检测方法.方法:利用循环上皮细胞采集器在体外模拟捕获CTC的过程,并对捕获后的肿瘤细胞进行基因突变检测.结果:循环上皮细胞采集器捕获的肿瘤细胞系成功进行了已知EGFR基因T790M和L858R位点的突变检测.结论:初步建立了利用循环上皮细胞采集器分离循环肿瘤细胞并进行基因突变检测的方法.
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数字PCR技术概述
数字PCR(digital PCR,dPCR)是一种对核酸分子绝对定量及扩增的新技术.与传统的PCR相比,数字PCR具有更好的结果重现性而且对核酸分子的定量更为精确.该技术通过对核酸模板进行一定的稀释后,将其随机分配到大量的反应单元中进行扩增反应,当反应结束时依次对每个反应单元的阳性信号进行统计从而实现对核酸分子的定量分析.鉴于数字PCR技术具有其独特的优势,故在许多领域中都表现出巨大的潜能与应用前景,包括临床诊断、单细胞基因表达分析、拷贝数变异(copy number variation,CNV)分析等.本文主要对数字PCR的基本原理、分类及其应用等进行简要综述.
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数字PCR技术的发展和应用
数字PCR(digital PCR,dPCR)技术作为一种全新的核酸检测方法,通过把反应体系均分到大量反应单元中独立地进行PCR,并根据泊松分布和阳性比例来计算核酸数量.目前dPCR主要分为微滴式和芯片式两种.与传统PCR技术相比,dPCR具有高灵敏度、高精确度、高耐受性和绝对定量的优点.因此,dPCR技术在近年来得到了迅速的发展,广泛地应用于稀有突变检测、拷贝数变异分析和复杂样本基因表达检测等方面.
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数字PCR技术在临床诊断中的应用进展
数字PCR(dPCR)作为核酸检测和定量的新方法,在病原微生物检测、肿瘤相关基因检测、产前诊断等方面应用日益广泛.该文就其在HBV DNA、HIV DNA、表皮生长因子受体(EGFR)突变、异柠檬酸脱氢酶(IDH)突变、胎儿游离DNA等检测中的研究进展作一综述.
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数字PCR在肿瘤诊疗中的应用进展
数字PCR是一种新兴的核酸检测技术,具有灵敏度高、可定量分析的特点.基于数字PCR的液态活检,可用于极微量核酸样本及稀有突变位点的检测,尤其适用于肿瘤治疗过程中需多次反复取样的情况,实现动态监测,为肿瘤诊断、复发提供及时的基因信息.
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数字PCR法和探针扩增阻滞突变法检测非小细胞肺癌组织表皮生长因子受体突变的比较研究
目的 比较数字PCR法和ARMS法检测非小细胞肺癌组织EGFR基因突变的差异,验证数字PCR法的检测性能.方法 以ARMS法作为对照参考方法,对36例EGFR突变阳性的NSCLC标本,采用数字PCR法进行EGFR基因突变检测,对结果进行比较研究.结果 ARMS法显示的22例21外显子突变阳性标本中,数字PCR检测全为阳性;ARMS法显示的14例19外显子突变阳性标本中,数字PCR共检出13例19外显子突变阳性.且数字PCR法可以定量检测EGFR突变比率,与临床分期具有相关性.结论 数字PCR法与ARMS法的检测一致性较高,可以直接实现绝对定量,对指导患者的个体化治疗具有重要价值.
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基于芯片式数字PCR技术的乙型肝炎病毒绝对定量检测方法的建立及应用
目的 建立芯片式数字PCR技术用于乙型肝炎病毒的绝对定量检测,并对此方法的灵敏度、检出限、检测范围开展评估.方法 本研究设计了芯片式数字PCR用于乙型肝炎病毒绝对定量检测的引物探针,并对扩增条件、反应的体系进行了优化,采用阴性对照法和稀释法对检出限、检测范围和检测方法的重复性进行评估.同时与实时荧光定量PCR的结果作了平行比较.结果 芯片式数字PCR检出限为3.94×104 copies/ml,检测范围是3.94×104 copies/ml～2.82 ×107copies/ml,重复性的相对标准偏差(RSD)为2.89％～13.37％.相比较实时荧光定量PCR,对样本的浓度要求苛刻,高稀释倍数与阴性对照均出现阳性.结论 本研究建立了芯片式数字PCR技术用于乙型肝炎病毒的绝对定量方法,不必依赖对照品或标准品,可高度耐受PCR反应抑制剂,为乙型肝炎病毒载量的测定提供了一种新的检测手段.
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微滴式数字PCR(ddPCR)快速检测α珠蛋白基因αααanti-3.7三联体
目的 建立一种基于微滴式数字PCR(ddPCR)技术的α珠蛋白基因αααanti-3.7快速检测方法.方法 以β-actin为参比基因、a1基因X1/Y1盒之间的差异性序列为目的基因代表性扩增子,设计特异性引物和TaqMan探针,建立基于ddPCR技术的拷贝数定量方法;检测28例已知基因型和60例临床样本,评价此方法的灵敏度和准确性.结果 采用本研究建立的方法,28例已知基因型样本的检测结果均与靶基因型结果相符;60例临床样本中检出5例αα/αααanti-3.7,与MLPA的验证结果一致;方法学评价结果显示此ddPCR体系的灵敏度与准确性均达100％.结论 建立了一种α珠蛋白基因aaαanti-3.7三联体ddPCR检测方法,操作简单快速、结果准确可靠,可应用于人群筛查和临床常规分子诊断.
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用微滴式数字PCR检测母体游离DNA中父源性β-地中海贫血CD41-42突变
目的 建立一种用微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)技术检测母体血浆游离DNA中父源CD41-42突变基因的排除性β-地中海贫血(简称 β-地贫)的无创产前诊断方法.方法 以 β-actin基因为参照序列,β-地贫CD41-42突变基因为目标序列,设计特异性引物和TaqMan探针,建立基于Bio-Rad ddPCR技术的检测体系.通过对目标基因的浓度梯度样本进行检测,评估该方法的准确性、灵敏度和线性检测范围.对20例孕妇的血浆样本进行检测,对该方法进行应用评价.结果 建立的ddPCR检测方法能够准确检测出母体血浆游离DNA中的β-地贫CD41-42突变基因的目标序列.目标序列浓度比例为5.00％～0.50％的相对误差均小于0.05,线性回归方程Y=1.0101X-0.0071,R 2=0.9994.20例孕妇血浆游离DNA样本的检测结果与随访确诊结果完全相符.结论 建立了一种用ddPCR技术检测母体血浆游离DNA中父源β-地贫CD41-42突变的方法,其操作简单、快速、结果准确、可靠,适用于夫妇为非同型β-地贫基因携带且父方为CD41-42突变的排除性无创产前诊断.
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实时定量PCR发展概述
实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,简称qPCR)是一种通过荧光信号对PCR进程进行实时监测,并对未知模板进行定量分析的一种核酸定量技术,该技术在临床诊断和生命科学等多领域发挥着重要的作用.现就生物制品领域有着重要应用价值的中介探针聚合酶链反应(mediator probe polymerase chain reaction,MP PCR)和数字聚合酶链反应(digital polymerase chain reaction,dPCR)新技术加以介绍,同时也对qPCR技术中的关键因素(如参考基因选择和核酸质量评价)以及qPCR低限度标准(minimum information for the publication of real-time quantitative PCR,MIQE)指南作一概述.
关键词： 实时定量聚合酶链反应 中介探针PCR 数字PCR MIQE指南
