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低强度脉冲超声对高糖诱导人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用
背景:研究表明,人脐静脉内皮细胞参与多种原因引起的血管结构紊乱和功能障碍,有可能成为相关疾病治疗的新靶点.目的:探讨低强度脉冲超声对高糖环境诱导的人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用及机制.方法:将人脐静脉内皮细胞随机分为正常对照组、高糖刺激模型组、低强度脉冲超声30,60,90 mW/cm2组.高糖刺激模型组和低强度脉冲超声组人脐静脉内皮细胞给予25 mmol/L葡萄糖高糖刺激处理24 h从而建立高糖模型;低强度脉冲超声组细胞造模后给予30,60,90 mW/cm2低频脉冲处理,每天20 min,连续7 d.采用MTT法检测各组细胞活力,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,比色法检测各组细胞Caspase-3、9活性,分光光度法检测丙二醛水平、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶及谷胱甘肽过氧化物酶活性,Western blot及RT-PCR检测各组细胞中JNK的表达.结果与结论:①与正常对照组比较,高糖刺激模型组细胞活力明显降低(P<0.01),细胞凋亡率升高(P<0.01),丙二醛水平以及Caspase-3、9活性均显著提高(P<0.01),超氧化物歧化酶、过氧化氢酶及谷胱甘肽过氧化物酶活性降低(P<0.01),JNK表达水平上调(P<0.01);②与高糖刺激模型组比较,低强度脉冲超声组细胞活力提高(P<0.01),细胞凋亡率、丙二醛水平以及Caspase-3、9活性降低(P<0.01),超氧化物歧化酶、过氧化氢酶及谷胱甘肽过氧化物酶活性提高(P<0.01),JNK表达水平下调(P<0.01),照射强度90 mW/cm2时以上变化明显;③低强度脉冲超声可能通过提高细胞的抗氧化能力以及调控细胞中的JNK信号转导通路以抵抗细胞凋亡,进而抑制高糖诱导的人脐静脉内皮细胞损伤;照射强度90 mW/cm2时作用显著.
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色素上皮衍生因子对高糖刺激下大鼠视网膜Müller细胞形态及活性的影响
目的：检测色素上皮衍生因子（PEDF）对高糖刺激下体外培养SD大鼠视网膜Müller细胞形态及活性的影响，探讨PEDF对Müller细胞的保护作用。方法实验分为对照组、高糖模型（HG）组、PEDF干预高糖模型（HG＋PEDF）组。采用反复胰蛋白酶消化法培养纯化SD大鼠视网膜Müller细胞，免疫荧光双标鉴定纯度，应用倒置相差显微镜、透射电子显微镜、CCK-8试剂盒、SOD试剂盒及MDA试剂盒检测各组Müller细胞形态与活性的改变及超氧化物歧化酶（SOD）活力与丙二醛（MDA）含量的变化。结果对照组、HG组、PEDF＋HG组细胞吸光度分别为0．67±0．03、0．54±0．03、0．63±0．03，SOD活力分别为（196．69±22．15）、（153．42±15．54）、（180．32±16．47）U／mg prot，MDA含量分别为（2．11±0．43）、（2．86±0．33）、（2．40±0．28）nmol／mg prot。与对照组相比， HG组Müller细胞形态发生明显改变，细胞活性及SOD活力降低（P＜0．01），MDA含量升高（P＜0．01）；与HG组相比，PEDF＋HG组Müller细胞形态改变较小，细胞活性升高（P＜0．01），SOD活力升高（P＜0．05），MDA含量降低（P＜0．05）。结论外源给予PEDF可显著减轻高糖所致的Müller细胞形态、活性的改变及细胞损伤，对Müller细胞具有显著的保护作用。
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色素上皮衍生因子对高糖状态大鼠视网膜Müller细胞NF-κB表达的影响
目的：探讨色素上皮衍生因子（PE DF）对高浓度葡萄糖作用下体外培养大鼠视网膜Müller细胞损伤的保护作用及对核因子-κB（NF-κB）表达的影响。方法采用出生3～7 d的S D大鼠视网膜组织，应用酶消化法培养Müller细胞，应用免疫细胞荧光双标方法鉴定细胞。细胞随机分为正常对照组（对照组），高糖模型组（HG组）和PE DF干预高糖组（HG＋PE DF组）。采用Western boltting和免疫细胞化学染色法检测NF-κB 的表达。结果Western boltting结果可见，与对照组相比，HG组的NF-κB 蛋白表达明显增强（P＜0．01）；与 HG组相比，HG＋PE DF组NF-κB蛋白表达显著降低（P＜0．001）。免疫细胞化学染色法结果可见，NF-κB 在对照组仅有极少量在胞浆中表达，在 HG组胞浆和胞核中皆呈强阳性表达，两者差异具有统计学意义（P＜0．001）；而 HG＋PE DF组的NF-κB表达低于其在 HG组中的表达（P＜0．01）。结论体外25 mmol·L-1高糖刺激可增加大鼠视网膜Müller细胞NF-κB的表达，从而加重Müller细胞损伤；外源给予PE DF可以显著降低NF-κB 的表达从而减少Müller细胞损伤，对视网膜Müller细胞具有显著的保护作用。
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色素上皮衍生因子对高糖刺激下大鼠视网膜Müller细胞凋亡的影响
目的 探讨色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor,PEDF)对高糖刺激下视网膜Müller细胞凋亡的影响,为PEDF治疗糖尿病视网膜病变提供实验依据.方法 实验分3组,分别是正常对照组、高糖模型(HG)组(培养基内含有25mmol·L-1的葡萄糖)和PEDF处理高糖模型(HG+PEDF)组(在高糖培养基础上加入25 mg·L-1的PEDF).反复胰蛋白酶消化法培养纯化SD大鼠视网膜Müller细胞,免疫荧光双标鉴定纯度;应用倒置相差显微镜观察Müller细胞形态,AnnexinⅤ-FITC、PI染色流式细胞技术检测Müller细胞的凋亡率,RT-PCR测定Müller细胞bcl-2、bax mRNA的表达变化.结果 原代培养的Müller细胞传至3代时纯度为95％以上.正常对照组、HG组、HG+ PEDF组Müller细胞早期凋亡率分别为(1.223±0.106)％、(2.657±0.120)％、(1.907±0.117)％,bax mRNA相对灰度值分别为0.269±0.041、0.804±0.052、0.528±0.018,bcl-2 mRNA相对灰度值分别为0.904±0.021、0.413±0.015、0.521±0.010.HG组与正常对照组相比,Müller细胞形态发生明显改变,细胞凋亡率显著增加(P ＜0.001),bax mRNA表达显著升高,bcl-2 mRNA表达显著降低(均为P＜0.01);HG+ PEDF组Müller细胞凋亡率较HG组显著降低(P＜0.001),bax mRNA表达显著降低,bcl-2 mRNA表达显著升高(均为P＜0.01),但仍有别于正常对照组(均为P＜0.05).结论 外源给予PEDF可以显著减少高糖刺激引起的Müller细胞的凋亡,对视网膜Müller细胞具有显著的保护作用.
