酸敏感离子通道基因重组质粒的构建、表达及其活性测定

为了构建含有小鼠酸敏感离子通道(ASIC1a、ASIC2a)基因全长eDNA的重组质粒,并表达有生物学活性的ASIC1a和ASIC2a融合蛋白,本研究通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分别获得小鼠ASIC1a和ASIC2a全长cDNA,并将其克隆人真核表达载体pEGFP-N3中,构建含小鼠全长ASIC1a和ASIC2a基因的重组质粒pEGFP-ASIC1a和pEGFP-ASIC2a,经DNA测序鉴定序列正确.脂质体法分别将其转染至中国仓鼠卵巢细胞(CHO),荧光显微镜下观察小鼠ASIC1a和ASIC2a融合蛋白在细胞内的表达分布,Western blot检测其蛋白表达.酸性处理转染重组质粒细胞,并比较其细胞存活率及乳酸脱氢酶(LDH)的释放来评价融合蛋白的生物学活性.结果显示:本研究成功地分别将小鼠ASIC1a和ASIC2a全长eDNA克降入pEGFP-N3载体中,并将其转染至CHO细胞,荧光显微镜下观察到CHO细胞膜周围呈强绿色荧光条带,Western blot显示小鼠ASIC1a和ASIC2a融合蛋白分别在90 kD和88 kD处有表达.经酸性处理的转染ASIC1a和ASIC2a重组质粒的CHO细胞,分别较其在pH7.4条件下的细胞存活率明显降低,LDH释放量明显增高,且通道阻断剂可抑制该效应.上述结果提示,我们已成功构建出含小鼠ASIC1a和ASIC2a全长cDNA的重组质粒pEGFP-ASIC1a和pEGFP-ASIC2a,并使有生物学活性的ASIC1a和ASIC2a融合蛋白在CHO细胞中表达.

卵泡抑素诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞

本实验观察了卵泡抑素(follistatin)对骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经细胞分化的影响.利用Percoll密度梯度离心法及贴壁筛选法分离培养和扩增成人的8MSCs,通过流式细胞术分析鉴定BMSCs的纯度,用follishatin诱导第三代生长良好的MSCs向神经元转化,观察分化过程中细胞形态的变化,利用RT-PCR方法检测诱导前后BMSCs的神经元特异性烯醇化酶(NSE)和神经干细胞标记物巢蛋白(Nestin)的表达情况.结果显示:流式分析获得了纯度较高的BMSCs,细胞表达CD29、CD44、CD106和CD166,不表达CDM和CD45.诱导10 d后,细胞呈现双极、多极和锥体形的典型神经元细胞形态,并且在mRNA水平证明诱导分化后的细胞与对照组比较NSE和Nestin的表达增加(P<0.05).上述结果表明follistatin可以在体外诱导人的BMSCs分化为神经样细胞.

囊泡膜谷氨酸转运体与ASIC3或TRPV1在大鼠结状神经节内的共存研究

为了探讨囊泡膜谷氨酸转运体(VGluTS)与酸敏感离子通道亚基3(ASIC3)或瞬时感受器电位香草酸亚型1(TRPV1)样阳性产物在大鼠迷走神经结状神经节(nedose ganglia,NG)内的分布和共存,本研究采用免疫荧光组织化学双重标记技术,在激光共聚焦显微镜下观察了大鼠NG内VGluT1或VGluT2分别与ASIC3或TRPV1的共存情况.结果显示:(1)在NG内,VGluT2、ASIC3和TRPV1主要见于中、小型神经元的胞浆内,大型神经元少见,而VGluT1阳性神经元数量较少,主要见于大型或中型神经元;(2)部分VGluT2阳性神经元同时显示ASIC3或TRPV1免疫活性,其中VGluT2/ASIC3双标神经元分别占VGluT2阳性神经元的43.06%,占ASIC3阳性神经元的58.74%;而VGluT2/TRPV1双标神经元分别占VGluT2或TRPV1阳性神经元的56.17%和51.12%;(3)VGluT1与ASIC3或TRPV1双标神经元的数量很少,不到1%.以上结果提示,VGluT2主要存在于NG内中、小型神经元,这些神经元通常被认为是内脏伤害性信息的初级感受神经元,因而VGluT2分别与ASIC3或TRPV1的共存表明它们可能与内脏伤害性信息的产生和传递密切相关.

CEPO经Mashl信号促进大鼠局部脑缺血后纹状体内神经发生

为检测氨甲酰化促红细胞叶三成素(CEPO)在大鼠脑缺血后发生过程中的作用及其相关信号通路,本实验将成年大鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)后立即尾静脉给予CEPO(50μg/kg).结果显示:CEPO可显著降低大鼠MCAO后3 d梗塞面积,增加缺血侧神经于细胞增殖、促进神经干细胞分化成为神经元.CEPO的促神经发生效应与缺血侧纹状体内前神经元bHLH转录因子Mash1的表达上调密切相关.本结果提示CEPO对脑缺血具有神经保护作用,Mash1信号在缺血侧纹状体内可能介导CEPO增强的神经发生和神经元分化效应.

Caspase-3在大鼠齿状回生后发育过程中的作用研究

为探讨在大鼠海马齿状同(DG)生后发育过程中,活化的caspase-3在细胞增殖中的作用,本研究采用双重免疫荧光染色方法检测活化的caspase-3与Ki-67的表达情况及其相互关系.结果显示:在DG生后发育过程中,活化的caspase-3与Ki-67的表达无相关性,但明显存在小部分共表达的颗粒细胞.研究结果提示,在终生都有自我更新能力的DG中,活化的caspase-3在颗粒细胞增殖中可能存在重要的非凋亡作用.

Humanin拮抗Aβ_(31-35)诱导的神经元凋亡

为了研究Humanin(HN)对A_(31-35)诱导的大鼠皮层神经元凋亡的影响.本研究采用原代培养的大鼠皮层神经元,应用流式细胞术、TUNEL法、H033342染色法检测不同时间(0、8、16 h)加入不同浓度的HN对A_(31-35)致神经元凋亡的影响.结果显示:A_(31-35)(25μmol/L)引起培养皮层神经元的凋亡率明显增高,神经元凋亡率由7.43%上升到32.69%;凋亡指数由6.87%上升到28.36%(P<0.05).与Aβ_(31-35)同时或提前8 h给予不同浓度(5,10,20μmol/L)的HN对Aβ_(31-35)(25μmol/L)诱导的神经元凋亡均未产生影响;但20μmoVL的HN提前16 h孵育可明显抑制Aβ_(31-35)所致的神经元凋亡.其凋亡率由32.69%下降到20.36%,凋亡指数由28.36%下降到17.57%.本研究结果提示,HN拮抗Aβ_(31-35)致神经元凋亡作用具有剂量和时间依赖性.

14-3-3ζ蛋白单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用

为了探讨14-3-3ζ蛋白在中枢神经系统内的分布,本文采用纯化的基因重组型14-3-3～ζ白免疫Balb/c小鼠,用杂交瘤技术制备抗14-3-3ζ蛋白单克隆抗体;Western blot及免疫组织化学法鉴定抗体.结果显示:制备的单克隆抗体能特异性识别基因重组14-3-3ζ蛋白和大鼠脑匀浆32 kD蛋白.免疫组化染色结果显示,14-3-3ζ蛋白在大鼠中枢神经系统广泛分布,在皮层、海马、杏仁核和基底前脑的免疫阳性染色较强,免疫阳性产物位于神经元胞浆内.本研究结果提示,14-3-3ζ蛋白可能具有多样化的牛理功能.

外源性BDNF对急性高眼压后大鼠视网膜EIK-1磷酸化的影响

为了研究脑源性神经营养因子(BDNF)干预对急性高眼压(HIOP)后大鼠视网膜EIK-1磷酸化的影响,本实验将72只成年大鼠随机分为单纯高眼压组、BDNF预处理高眼压组和溶媒预处理高眼压组.BDNF预处理高眼压组和溶媒预处理高眼压组动物左眼于加压前2 d分别给予BDNF预处理或溶媒,右眼设为正常对照.各组动物左眼眼压升高至闪光视网膜电图b波消失的临界眼压并维持60 min,动物分别存活1、3、7、14 d后处死,冰冻切片行p-EIK-1的免疫组织化学染色.结果显示:单纯高眼压组急性高眼压后大鼠视网膜节细胞层p-EIK-1阳性细胞数较正常对照组下调(P<0.05);溶媒预处理高眼压组实验结果与单纯急性高眼压组相似.BDNF预处理高眼压组急性高眼压后1、3、7 d组大鼠视网膜节细胞层p-EIK-1阳性细胞数与正常对照组相似,14 d组下调(P<0.05).此结果提示外源性BDNF促进了急性高眼压后视网膜节细胞层EIK-1的活化,节细胞层EIK-1的磷酸化对受损的视网膜有保护作用.

哮喘大鼠脑内小胶质细胞激活的时程及形态变化研究

为探讨哮喘大鼠在连续激发不同阶段脑内小胶质细胞激活的时程及形态变化,本实验取健康雄性SD大鼠制备哮喘模型并诱发哮喘发作.48只SD大鼠随机分为对照组和实验组.对照组分为正常组和生理盐水组(n=8);实验组根据造模期间连续抗原激发的时间不同,分为连续激发3,7,14,21 d组(n=8).各组大鼠均进行呼吸功能检测、肺组织切片HE染色及脑组织抗OX-42免疫组织化学染色.结果显示:与对照组大鼠比较,实验组中各组大鼠呼吸功能各项指标均明显加重;肺组织病变程度逐渐增加;小胶质细胞由静息状态转变为激活状态,且数量明显增多.以上结果提示:哮喘大鼠脑内小胶质细胞被激活,在一定时间内小胶质细胞激活的程度随呼吸功能的降低及肺组织病变程度的增加而增加.

二苯乙烯苷通过抑制氧化应激对MPP~+诱导的PC12细胞凋亡的保护作用

为了探讨2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-o-β-D-葡萄精苷(2,3,5,4'-tetrahydroxystibene-2-o-β-D-glucoside,TSG)对1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methy1-4-phenylpyridinium,MPP~+)诱导PC12细胞凋亡的影响及其可能机制,本实验分为对照组,MPP~+处理组和TSG(1、5和10 μmol/L)预处理组.用Hoechst33258染色法和流式细胞术测定细胞凋亡,对活性氧(reactive oxygen species,ROS)敏感的荧光探针2,7-dichlomfluorescin dictate(DCF-DA),丙二醛(malondialdehyde,MDA)和总抗氧化能力(total anti-oxidation competence,T-AOC)检测试剂盒测定细胞的氧化应激的变化.结果显示:TSG三个浓度预处理后,对比MPP~+处理组,观察到TSG在一定范围内以剂昔依赖方式,使细胞核凝聚明显减少,细胞凋亡率降低.另外,TSG预处理后,PC12细胞中增高的ROS和MDA水平较MPP~+处理组明显有所减低,T-AOC有所增强.以上结果提示,TSG町抑制MPP~+诱导的PC12细胞的凋亡,其机制町能与TSG抑制氧化应激有关.

D-半乳糖调控SD大鼠大脑皮质巯醇抗氧化物(酶)致衰老的作用研究

构建D-半乳糖(D-gal)致衰老模型,探讨D-gal诱导衰老的分子机制,为临床治疗阿尔茨海默病(AD)提供理论依据.腹腔注射D-gal构建SD大鼠衰老模型,采用Moms水迷宫实验(MWM)进行行为学检测,采用化学比色法检测大脑皮质一氧化氮合酶(NOS)、一氧化氮(NO)、铜锌-过氧化物岐化酶(Cu,Zn-SOD)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽还原酶(GR)、谷胱甘肽s-转移酶(GSH-ST)、谷胱甘肽过氧化酶(GSH-PX)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA),总抗氧化能力(T-AOC)和过氧化氢(H_2O_2)的含量.结果显示:衰老模型组与正常对照组比较:逃避潜伏期明显延长(P<0.05),在第Ⅲ象限逗留的时间明显减少(P<0.05),跨越平台次数明显减少(P<0.05);皮质MDA、H_2O_2和NO的含量增加(P<0.05),SOD、GSH、GSH-ST、GSH-Px和T-AOC的含量降低(P<0.05),而NOS的含量没有明显变化(P>0.05).结果提示,D-gal能通过调控内源性巯基抗氧化物(酶)和NO的表达,减退学习记忆能力,而诱导SD大鼠神经系统的衰老.

皮层电刺激对左旋多巴诱发异动症大鼠纹状体c-fos及ENK表达的影响

为了研究皮层电刺激对左旋多巴诱发异动症(LID)大鼠纹状体神经元c-fos及脑啡肽(ENK)表达的影响,探讨皮层-纹状体通路可塑性改变在LID发生机制中的作用,本实验制备Parkinson病(PD)和LID大鼠模型.将实验大鼠分成三组:正常对照组、PD组和LID组.电刺激运动皮层后.免疫组化法检测纹状体区c-yos、ENK、细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)及其活化形式磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(p-ERK1/2)的表达.结果显示:与对侧比较,皮层电刺激使各组同侧纹状体c-fos、ENK、ERK1/2、p-ERK1/2表达均增加(P<0.01);LID组c-fos(0.67±0.03)以及p-ERK1/2的表达(O.17±O.05)较PD组(0.08±0.03)和正常组(0.07±0.02)增加(P<0.05),LID组ENK(0.21±0.07)的表达和PD组(0.18±0.08)相比较无统计学羞异(P>0.05),但均较正常组(0.08 ±0.01)增加(P<0.01);三组ERK1/2的表达无统计学差异(P>0.05),但LID组p-ERK1/2的表达(0.17 ±0.05)较PD组和正常组有所增加(P<0.01).本研究结果表明,LID大鼠皮层-纹状体通路兴奋使纹状体c-fos以及p-ERK1/2表达增加,ENK的表达没有显著变化.上述结果提示皮层-纹状体通路活动增强以及p-ERK1/2表达的增加与LID的发生机制有关,而ENK在LID的发生过程中町能不发挥重要作用.

大鼠臂旁核内5-羟色胺阳性纤维和终末的来源

本研究采用荧光金(FG)逆行追踪与5-羟色胺(5-HT)免疫荧光组化染色相结合的双重技术观察了臂旁核(PBN)内5-HT阳性神经纤维和终末的来源.将FG注入PBN后,FG逆标神经元主要分布在三叉神经核簇、脑干网状结构外侧小细胞部、中缝核簇和中脑导水管周围灰质(PAG);免疫荧光组化染色的结果显示5-HT阳性神经元主要位于中缝核簇和PAG;在中缝核簇和PAG内可见FG逆标并呈5-HT阳性的双重标记神经元.上述结果表明,中缝核簇和PAG内的5-HT能神经元向PBN发出投射,它们在躯体和内脏感觉信息的传递和调控方面发挥重要作用.

P物质、血管活性肠肽和乙酰胆碱能神经在大鼠肠道内的分布及其关系

应用乙酰胆碱酯酶(AChE)组织化学和PAP免疫组织化学方法.比较观察P物质(SP)、血管活性肠肽(VIP)和AChE三种阳性神经元在大鼠十二指肠、空肠、回肠.结肠和直肠内的分布特征及其相互关系.结果显示:SP、VIP、AChE阳性神经神经元和纤维均分布于肠壁各层,从十二指肠、空肠到回肠逐渐增多,但从结肠到直肠则逐渐减少;AChE阳性神经元或纤维在肠壁各层丰富,其中VIP以粘膜层和粘膜下神经丛较丰富,SP以肠肌从较丰富;三者的分布密度为AChE>VIP>SP.AChE、SP和VIP阳性神经元胞体及神经纤维在不同肠段的分布密度有明显差异(P<0.05),提示可能与不同肠段肠动力调节功能有关.

中药龟板对Parkinson病大鼠模型BMP4表达的影响

为研究益肾中药龟板对Parkinson病(PD)模型大鼠骨形成蛋白4(BMP4)表达的影响,本研究将6-羟基多巴胺注入大鼠黑质建立PD大鼠模型,对模型大鼠行高、低剂鼍龟板水煎液口服治疗45 d后,采用ELISA和RT-PCR方法进行血清中BMP4酶联免疫试验和脑黑质、纹状体中BMP4 mRNA的检测.结果显示:PD模型组的BMP4表达明显降低.用龟板治疗后可以显著阻碍此趋势,而且高剂量组比低剂量组效果更为明显(P<0.05).本研究结果提示,龟板有明显的促进BMP4及BMP4 mRNA表达的作用.

脑缺血再灌注损伤后大鼠脑皮质TNF-α及其mRNA的时程变化

为了观察大鼠脑缺血再灌注损伤后大脑皮质TNF-α及其mRNA表达的时程变化,本实验采用大脑中动脉线栓法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注模型.用免疫组化染色法检测不同再灌注时间大脑皮质TNF-α的蛋白表达水平,以及用逆转录-多聚酶链反应法(RT-PCR)检测脑皮质内TNF-α mRNA的表达情况.结果显示:脑缺血1 h,再灌注12 h后大脑皮质内TNF-α及其mR-NA的表达开始升高,24 h后达到高峰,随后逐渐下降.两组大脑皮质TNF-α及其mRNA的表达水平差异有统计学意义(P<0.01),模犁组的TNF-α及其mRNA的表达水平明显高于假手术组.本研究结果表明,TNF-α在大鼠脑缺血再灌注损伤的调节过程中发挥重要作用.

Wnt信号转导途径对神经细胞分化和突触形成作用的研究进展

Wnt基因定位于染色体12q13上,它所调控的信号传导途径称为Wnt信号转导途径.早的该途径研究与肿瘤的发生、发展相关,近年随着研究的深入,发现它在生物发育,尤其是中枢神经系统的发育中发挥着重要的作用.

中枢神经系统髓鞘形成的研究进展

目前,随着产科及新生儿医学的发展,早产儿存活率明显提高,随之而来早产儿脑损伤数目明显增高.早产儿脑室周嗣白质软化(periventricular leukomalacia,PVL)是早产儿脑损伤的主要类型,其主要病理表现为脑白质损伤.

GDNF的表达调控与Parkinson病的神经保护治疗

Parkinson病(PD)是一种常见的神经退行性疾病,其主要病理变化是中脑黑质多巴胺能神经元的变性死亡.作为促进PD多巴胺能神经元存活的首选有效因子,胶质细胞源性神经生长因子(GDNF)的神经保护作用得到多数学者认同.

蜂毒及其组成成分的生理作用机制及进展一致痛或镇痛

蜂疗(apitherapy或bee therapy)的确切起源不明,但可以追溯到数千年前的古埃及,希腊和中国,在印度的吠陀经,圣经和古兰经中均有蜂产品包括蜂蜜、花粉、蜂胶、蜂王浆和蜂毒(bee venom,BV)应用的记载.在这些记载中,主要记录的是蜂产品的营养成分而不是蜂毒.

化疗药物紫杉醇在神经病理性痛发生中的作用

1. 化疗药物紫杉醇的概述紫杉醇(Paclitaxel,商品名为Taxol~R)是一种可从紫杉属植物Taxus brevifolia的树皮中提取的多萜醇类单体药物成分(图1).对紫杉醇生物活性的研究始于上个世纪七十年代早期,随着研究的深入,人们发现紫杉醇可以中断细胞分裂周期.

IL-6在CNS损伤修复中的作用

长期以来,人们普遍认为中枢神经系统(CNS)损伤后的炎症反应参与其继发性损伤,导致损伤部位附近的神经元和胶质细胞进一步丢失,从而加重功能障碍.近年来,大量的实验证据表明,CNS损伤后的炎症反应,除产生神经毒性作用外,还具有神经保护作用,这就导致炎症反应在一些CNS损伤实验模型中增加组织损伤,而在另一些实验模型中却发挥神经保护和促进修复作用.

痛传递中的氯离子调节机制

疼痛是医学中寓挑战的问题之一.由外周神经损伤或疾病引起的、以外周伤害性感受器和脊髓背角神经元兴奋性增强(外周敏化和中枢敏化)为特征的神经病理性痛,是临床常见也难控制的慢性痛之一,其机理包括:突触兴奋性增强、突触抑制性减弱(如去抑制)、神经元反应性增加,或以上任何几种情况的组合.

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