人BDNF的克隆、表达及其活性检测

为了研究脑源性神经营养因子在大肠杆菌中的表达及其在治疗Parkinson病中的作用,采用RT-PCR技术,从人胚脑组织扩增及克隆了BDNF全长及其成熟蛋白编码基因,经测序证实后,将其分别克隆至表达载体pcDNA3.1与pGEX6p-1,构建了重组真核表达载体pcDNA3.1-BDNF和重组原核表达载体pGEX6p-BDNFs.pcDNA3.1-BDNF经脂质体介导转染至体外培养的E16胚鼠中脑星形胶质细胞,以G418筛选出抗性阳性克隆,该克隆株与E12-E14胚鼠中脑神经干细胞体外共培养,酪氨酸羟化酶免疫细胞化学反应显示,转染细胞株所表达的BDNF蛋白具有生物学活性,可延长前体细胞的存活并促进其向多巴胺神经元分化.将pGEX6p-BDNFs转化大肠杆菌,以IPTG诱导,获得了相对分子质量约为40 kD的GST-BDNF融合蛋白,其表达量约占菌体总蛋白的10%,并经免疫印迹证实具有特异的免疫反应性.

神经激肽A在大鼠结肠发育中的定性定量分析

探讨神经激肽A(NKA)在大鼠结肠发育中的表达及变化,应用免疫组织化学PAP法和图像分析系统观测大鼠胚胎13d至成年结肠中NKA的表达情况.结果显示:(1)在结肠,首先于胚胎17 d的肌间丛及上皮处出现NKA-IR的表达,随发育相继出现于纵肌、环肌、粘膜肌、固有膜、粘膜下层和粘膜丛,30 d时具备成年分布特征;(2)定量分析的结果与NKA-IR在结肠各层的变化一致;(3)NKA-IR细胞具有典型的肠道内分泌细胞的形态特征和分布特征.结果提示:(1)NKA在结肠的发生发育主要在生前5 d～生后4周内;(2)NKA在结肠的发生发育有两个关键时期,即生前5 d～生后1周和生后1月末;(3)NKA-IR细胞可能是肠道内分泌NKA的内分泌细胞;(4)NKA可能对大鼠结肠的发育具有重要作用,可能与结肠功能的建立密切相关.

脊髓损伤后水通道蛋白-4的时程变化

探讨脊髓损伤后水通道蛋白-4及其mRNA的变化规律,应用改良Allen脊髓损伤的模型,于术后1、3、7和14d取脊髓组织,采用免疫组织化学和原位杂交技术检测AQP-4的表达.结果表明,AQP-4及其mRNA表达丰富的部位主要集中在损伤脊髓的后索、前索和后角,以小胶质细胞和少突胶质细胞为主.AQP-4及其mRNA表达在脊髓损伤后1 d开始增加,在脊髓损伤后3 d达到高峰.随后下降,对应的病理改变为细胞内水肿.本研究结果提示:胶质细胞AQP-4表达增强与早期损伤性脊髓水肿密切相关,它可能是形成早期细胞内水肿的重要因素之一.

急性高眼压后大鼠视网膜谷氨酰胺合成酶的表达变化

为了探索谷氨酰胺合成酶在青光眼视网膜中的表达变化及其可能作用,本实验用急性高眼压模型,结合免疫组织化学染色和Western blot检测了急性高眼压后大鼠视网膜中谷氨酰胺合成酶的表达.结果显示:正常视网膜中,谷氨酰胺合成酶免疫组织化学染色主要见于Muller细胞胞体;0 d组中,Muller细胞胞体染色稍淡,而内网层中表达增加,且呈明显的点状分布;1d组、3 d组中Muller细胞胞体染色进一步变淡,但内网层中呈现弥散染色.至再灌第7 d、14 d,Muller细胞胞体又出现浓的染色.平均灰度值显示:与正常组相比,0 d组中谷氨酰胺合成酶表达有增加但差异无显著性;1 d组中表达显著增加,3 d组、7 d组表达逐渐减少,至第14d时基本恢复正常.Western blot显示谷氨酰胺合成酶为一分子量约为45 kD的单一蛋白带,与其它组相比,1 d组中表达显著增加.提示:急性高眼压导致的视网膜缺血再灌早期,Muller细胞中谷氨酰胺合成酶的快速重新分布和表达上调可能加速了胞外谷氨酸的代谢,对缺血再灌条件下的视网膜特别是节细胞起到保护作用.

大鼠黑质毁损程度的行为学评价

本研究通过观察黑质毁损大鼠的行为学变化及其与毁损程度的相关性,评价开野实验作为毁损程度观察指标的可行性.采用6-羟基多巴胺(6-OHDA)单侧一点注射毁损大鼠黑质致密区(SNc)多巴胺(DA)能神经元,采用开野实验和阿朴吗啡(APO)诱导旋转实验,观察术后1、3、5、7、14、21 d行为学变化;利用Nissl染色和免疫组织化学方法观察各时间点黑质形态学变化.结果显示:毁损侧黑质DA能神经元逐渐减少;开野实验中旋转、探究、后肢站立和穿梭行为在术后1 d即有显著改变(与对照组比较P＜0.05),其中,旋转行为与毁损程度呈正相关(r=0.471,P＜0.01),探究、后肢站立和穿梭行为与毁损程度呈负相关(r分别为-0.71 9、-0.589、-0.594,P＜0.01);术后14d毁损比例超过80%,APO诱导旋转实验阳性.因此开野实验可作为毁损早期反映大鼠脑内DA耗竭程度的敏感的行为学观察指标.

大鼠脑内大分子物质的引流通路及方法学研究

为探讨脑内大分子物质的引流通路,本研究微量注射示踪剂墨汁到大鼠右侧尾壳核,I组动物使用传统的脑内注射方法,II组动物采取改良方法防止示踪剂从进针处进入蛛网膜下腔,术后1、3、7、14、21 d处死动物,分别用肉眼、光镜及电镜观察墨汁在脑内、蛛网膜下腔、颈总动脉及颈部淋巴结的分布.结果显示:墨汁在两组动物脑实质内的分布趋势相同,即在白质内沿神经纤维弥漫性分布,7 d后在灰质内选择性地沿血管周围间隙分布,部分碳颗粒被管周细胞和巨噬细胞吞噬II组动物中观察到墨汁从大脑顶部进入蛛网膜下腔后沿其中的血管周围间隙分布并引流到脑的底部和嗅球及筛板区域,在耳蜗、前庭蜗神经和视神经等的脑神经鞘以及颈总动脉壁和颈部淋巴结有碳颗粒沉积;I组动物没有这种分布.以上结果表明,大鼠脑实质内的大分子物质在白质和灰质中的引流方式不同;进入脑脊液的大分子物质可由颈部淋巴系统引流;墨汁不是很好的研究脑实质内大分子物质引流的示踪剂.

骨髓间充质干细胞体外诱导为神经细胞的研究

本实验观察了大鼠MSCs向神经细胞方向的诱导分化情况,以期为MSCs在神经移植领域的临床应用提供理论基础.用含10 ng/ml bFGF+20%FBS的DMEM对MSCs进行预诱导24 h后,以含200 μmol/L的BHA+2%DMSO的无血清DMEM对MSCs进行诱导,观察诱导后细胞的光、电镜形态学变化,通过免疫组织化学法对诱导后细胞进行神经细胞表型及神经递质合成酶鉴定.结果显示:MSCs经BHA和DMSO诱导后,80%以上的细胞表现出神经元样形态,胞浆内可见较多Nissl体,并表达nestin、NSE、NF、MAP、SYN,部分诱导后的细胞表达ChAT、TH、GAD;电镜下观察,诱导后细胞核大而圆,核仁明显,胞浆内细胞器发达,可见大量粗面内质网和游离核糖体.提示,MSCs体外可被诱导分化为神经元样细胞,诱导后的细胞有合成某些神经递质的能力并具有发育早期神经元的超微结构特点.

大鼠脊髓损伤后NGF及其受体TrkA在运动神经元及神经胶质细胞表达的变化

为探讨脊髓损伤后运动神经元及神经胶质细胞内神经生长因子(NGF)及其高亲和力受体(TrkA)表达的变化,用改良Allen重击法损伤SCI组动物T12脊髓,按伤后存活时间再将动物分为脊髓损1 d组、2 d组和5 d组.各组动物的脊髓切片经ABC法免疫组织化学染色,用光镜观察TrkA及NGF在脊髓前角运动神经元表达的变化和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)及NGF免疫反应阳性胶质细胞的反应性增生程度,并进行图像分析.结果显示:脊髓损伤后前角运动神经元TrkA及NGF的表达随脊髓损伤后动物存活时间的延长逐渐上调;脊髓白质和灰质内尤其是皮质脊髓束内GFAP及NGF阳性胶质细胞明显增生;与此同时,室管膜细胞内亦可见明显的NGF免疫反应产物.上述结果表明,脊髓损伤可刺激脊髓前角运动神经元表达TrkA及NGF,通过自分泌维持受损神经元的存活;损伤部位反应性增生的胶质细胞亦可产生NGF,通过旁分泌作用于脊髓前角运动神经元或皮质脊髓束的轴突末梢,以维持运动神经元的存活及促进皮质脊髓束的再生;适时补充外源性神经营养素或改变损伤局部的微环境将有利于受损脊髓的修复和再生.

自体移植脾组织内GAP-43神经的生成机制

为探索自体移植脾组织内GAP-43神经的再生机制,将Wistar大鼠42只随机分为实验组和对照组.实验组切除脾脏以后,切取1/2脾脏,切成1 mm×1 mm×1 mm大小的组织块植入大网膜内,术后7、14、30、60、90、120、180 d取脾组织标本通过原位杂交检测GAP-43 mRNA、NGF mRNA和TrkA mRNA,同时进行免疫组化染色观察GAP-43神经.对照组手术松动脾脏,在术后相同时间点取脾组织作对照观察.结果显示:术后30 d检测到移植脾组织内有GAP-43mRNA、NGFmRNA和TrkAmRNA表达,90 d达高峰后开始下降;术后60 d明显可见GAP-43染色阳性神经纤维,90 d密度大,主要存在于血管周围,以后无明显改变.结果提示:自体移植脾组织内GAP-43神经再生与内源性NGF和TrkA表达密切相关.

雌性大鼠下丘脑5-羟色胺1A和2A受体亚型的定位分布

本研究应用免疫细胞化学技术观察了雌性成年SD大鼠下丘脑内5-HT1A受体亚型(5-HT1AR)和5-HT2AR免疫阳性结构的分布.结果显示:5-HT 1AR免疫阳性神经元在视前区大细胞核、视前室周核、视上核和下丘脑外侧前核等核团内密集分布.在内侧视前核、外侧视前区、下丘脑室周核、下丘脑外侧区、背内侧核、腹内侧核、结节核、结节乳头体核、乳头体内侧核和乳头体外侧核等结构内也有较多的分布;而在正中视前核、视交叉上核、下丘脑室旁核、下丘脑背侧核、弓状核、乳头体上核和乳头体前核等部位有散在的分布.与5-HT1AR不同,5-HT2AR免疫阳性反应产物主要见于纤维和终末,阳性胞体少且染色淡.5-HT2AR阳性胞体见于下丘脑室旁核、视上核、腹内侧核、结节核、视前内侧区、外侧区、外侧前核、下丘脑背内侧核等处.另外,在视前区前内侧视前核、视交叉上核背侧和外侧可见围绕血管分布、密集成团簇状、带有大小不同膨体的阳性神经纤维缠结.本文结果提示5-HT1AR阳性结构广泛地分布于大鼠下丘脑,而5-HT2AR在下丘脑分布较为局限.二者不同的分布特点,提示它们可能介导5-HT在下丘脑的不同生理功能.

亚低温减少大鼠短暂性全脑缺血后皮质iNOS诱导的神经元凋亡

为研究亚低温对大鼠脑缺血再灌注后皮质iNOS表达、NO产生及神经元凋亡的影响及探讨亚低温的神经保护机制,用大鼠短暂全脑缺血模型,采用Nissl染色观察存活神经元、免疫组化法检测iNOS、硝酸还原酶法检测NOx-水平和TUNEL染色结合电子显微镜观察检测凋亡神经元.结果显示:常温缺血组额叶皮质iNOS表达、NOx-水平增高,出现凋亡神经元;低温缺血组iNOS表达、NOx-水平明显低于常温缺血组,未检测到凋亡神经元.上述结果提示,脑缺血后iNOS来源的NO参与了神经元的凋亡过程,亚低温可减少大鼠短暂性全脑缺血后iNOS诱导的神经元凋亡.

大鼠骨髓细胞诱导分化神经细胞的形态学观察

本实验探讨了从骨髓诱导培养分化神经细胞的方法,并从形态学上观察了其演变规律.抽取SD大鼠骨髓做全骨髓细胞培养,用光镜、扫描电镜观察不同阶段的形态变化,用免疫细胞化学方法进行鉴定.观察到骨髓细胞由单细胞、细胞分裂、形成克隆团(球)、出芽,直至形成突起成为神经元样细胞的演变过程.可确定神经元样细胞的前体在骨髓阶段是一类"大圆细胞".24h左右开始贴壁,前体细胞长出"足"样结构与细胞外基质相连接.培养25～35 d细胞分化为神经元样,神经元样细胞的形态多样,有球形、锥形、星形或梭形等,直径在15.3～36.5μm之间.应用免疫细胞化学鉴定出神经干细胞、神经元和胶质细胞.结果表明,骨髓细胞可分化为神经细胞,扫描电镜从超微结构上给予佐证.为骨髓细胞向神经细胞分化的发育过程提供了形态学资料.

Neurturin和NGF联合应用对AD模型鼠基底前脑NGFR阳性神经元的保护作用

本研究目的是探讨neurturin和神经生长因子(NGF)联合应用对穹窿-海马伞(FF)切断后基底前脑胆碱能神经元的保护作用.将这两种因子联合注射到FF切断的大鼠侧脑室,注射一个月后,取脑进行免疫组化结合图像分析方法对内侧隔核(MS)和斜角带核垂直支(VDB)的神经生长因子受体(NGFR)阳性神经元存活情况进行比较分析.结果表明:FF切断一个月后,损伤组损伤侧MS和VDB的NGFR阳性神经元大量减少(分别减少64.8%和51.4%),MS和VDB的NGFR阳性细胞的面积和周长显著降低(P＜0.01),OD值显著增高(P＜0.01);NGF组损伤侧NGFR阳性神经元受到保护,NGFR阳性经元数显著高于损伤组损伤侧(P＜0.01);联合组损伤侧NGFR阳性神经元也受到保护(MS和VDB细胞数分别只下降7.3%和15.4%),与损伤组损伤侧比较NGFR阳性细胞数增加了57.4%和36.0%(P＜0.01),也明显高于NGF组(P＜0.05);细胞形态学参数明显改善(P＜0.05),细胞膜受体含量显著提高(P＜0.05).结果提示,neurturin和NGF联合应用和NGF单独应用均能不同程度地保护基底前脑胆碱能神经元,联合应用效果更佳.

Neurturin对体外培养的GABA阳性神经元生长发育的作用

为探讨neurturin(NRTN)、神经生长因子(NGF)对新生大鼠海马的γ氨基丁酸能神经元生长发育的影响,本研究用免疫组化结合图像分析技术观察neurturin和NGF对体外培养海马的γ氨基丁酸能阳性神经元生长发育的作用.结果显示:培养4d时,NRTN组的γ氨基丁酸能阳性神经元细胞数目、突起数、胞体面积和长突起长度均与对照组有显著性差异(P＜0.05),NGF组各项指标与对照组均无显著性差异(P＞0.05),NGF+NRTN组突起数多于NRTN组(P＜0.05);培养8 d时,NRTN组各项指标均与对照组仍有明显差异(P＜0.05),NGF+NRTN组突起数仍多于NRTN组(P＞0.05).上述结果提示,neurturin对体外培养的新生大鼠γ氨基丁酸能阳性神经元生长发育有营养作用,但NGF对体外培养的新生大鼠γ氨基丁酸能阳性神经元无神经营养作用neurturin和NGF的联合应用并不比单独使用neurturin好.

大鼠三叉神经节神经元5-羟色胺激活电流及其特征

采用全细胞膜片钳技术观察大鼠三叉神经节神经元5-羟色胺激活电流(I5-HT)及其特征.在大多数受检细胞(64/87,73.6%)特别是中、小型细胞,外加5-HT可引起一快去敏感的内向电流,此内向电流可被5-HT 3受体特异性激动剂2-甲基-5-羟色胺所模拟,被5-HT 3受体拮抗剂ICS 250-930可逆性阻断.I5-HT浓度-反应曲线的阈浓度为3×10-7mol/L,饱和浓度约为3×10-3 mol/L,EC s0为21.4±2.2μmol/L,Hill系数为0.96.I5-HT的翻转电位在-2.5 mV左右.胞内透析GDP-β-S证明I5-HT不依赖于G蛋白而存在.本研究结果为了解5-HT3受体介导电流及其特征提供了有关的资料.

NGF对小鼠骨髓基质细胞体外诱导分化作用

为观察NGF等对小鼠骨髓基质细胞的诱导分化作用,从小鼠骨髓中分离培养基质细胞并传至第3代,采用bFGF预诱导24 h,NGF、维甲酸、β-巯基乙醇等诱导24 h后,进行NF-200、GFAP、fibronectin免疫荧光染色,荧光显微镜观察免疫阳性细胞.结果表明:诱导后小鼠骨髓基质细胞形态改变不明显,但出现表达NF-200、GFAP的细胞,而表达fibronectm的细胞减少,对照组几乎无NF-200和GFAP免疫阳性细胞,主要为表达fibronectin细胞.结论:NGF等可以在体外诱导小鼠骨髓基质细胞分化成表达NF-200和GFAP细胞.

杏仁基底外侧核电点燃癫痫模型的制作及观察

为了探讨杏仁基底外侧核电点燃癫痫模型的制作及意义,我们把双极电极插入大鼠左侧杏仁基底外侧核,给予慢性电刺激使大鼠达到点燃状态,观察其发作过程、行为改变并记录脑电图.结果发现29只接受刺激的大鼠,达到点燃的有24只,8.29±5.31次刺激出现5级痫样发作,10.87±3.44次刺激达到点燃,没有因抽搐发作而致死的点燃大鼠.脑电图记录到后发放时程在32.05～51.65 s之间.行为观察发现点燃大鼠比对照组易激惹.说明杏仁基底外侧核电点燃大鼠癫痫模型便于从行为、脑电图等多方面进行观察,是研究人类癫痫机制、药物治疗和预防的良好工具.

海马与糖尿病认知功能障碍

海马是学习、记忆的重要解剖基础和神经中枢,是近记忆回路的重要结构.海马与认知功能密切相关.而研究发现糖尿病患者广泛存在学习记忆功能减退等认知功能障碍,本文就海马与糖尿病认知功能障碍之间的关系作如下综述.

体外诱导人胚胎干细胞向神经细胞分化的研究进展

胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES)是从着床前胚胎内细胞团(inner cell mass,ICM)中分离出来的能在体外培养的一种全能干细胞.它具有在体外可以大量增殖并保持未分化状态和在一定条件下能向内、中、外三个胚层组织和细胞分化的生物学特性.胚胎干细胞也易于进行基因改造操作和制造嵌合体动物,从而成为细胞与个体之间的桥梁[1]以及临床移植治疗新的细胞来源.1998年Thomoson等[2]与Shamblott等[3]分别建立了来源于人类胚细胞群和原始生殖细胞的人胚胎干细胞系,科学家们看到了在体外培育所需的组织细胞以取代患者体内的病损组织细胞来治疗多种疑难病的曙光.

脑nestin-ir神经元的发现--形态、化学、投射和功能

巢蛋白(nestin)属于中间丝蛋白家族,由于其主要在胚胎期和成年的神经前体细胞表达的特性,自发现以来,一直被视为神经前体细胞的标志物.然而,本实验室首次观察到,正常成年大鼠和成人一些脑区内的神经元也呈nestin免疫阳性反应[1,2].关于这些nestin免疫反应阳性神经元(nestinir神经元)的许多特性尚需阐明,如这些nestin-ir神经元的化学属性是什么?是否为投射神经元?投射的靶区何在等.近几年来,本实验室针对这些神经元的分布、形态及其可能的特性和功能进行了一些相关的研究,现将已取得的研究成果作一综述.

Andrew Fielding Huxley生平简介