谷氨酸、N-甲基-D-天冬氨酸和海人藻酸在体外对大鼠中脑腹侧神经元的影响

本研究分别以谷氨酸、N-甲基-D-天冬氨酸和海人藻酸作用于体外培养的新生大鼠中脑腹侧神经元,经抗酪氨酸羟化酶和抗γ-氨基丁酸双重免疫荧光染色,观察了谷氨酸等三者对不同神经元的毒性作用.结果表明,大鼠中脑腹侧部主要含有多巴胺和γ-氨基丁酸神经元,多巴胺神经元对谷氨酸等三者的毒性作用均较γ-氨基丁酸神经元敏感.多巴胺能神经元对谷氨酸毒性的脆性,在培养的第-周主要由海人藻酸受体介导,以后则以N-甲基-D-天冬氨酸受体为主.

c-fos和神经营养因子在大鼠脑缺血再灌流时的神经元表达特点

为了观察脑缺血再灌流时c-fos和神经营养因子在神经元表达的时空特点,探讨其在缺血性神经元损伤中的作用.本研究用阻塞SD大鼠大脑中动脉2 h、再灌流0.5～48 h制成局灶性脑缺血模型,用免疫组化方法观察了c-fos和神经营养因子一转化生长因子、神经生长因子和胶质源性神经营养因子在神经元的表达特点.结果表明,c-fos和转化生长因子分布相似.正常组无c-fos和转化生长因子阳性神经元;缺血再灌流0.5～48 h阳性的神经元主要位于非大脑中动脉供血区,缺血区皮质、纹状体和视前区神经元为阴性.而实验各组对照侧皮质神经元中等阳性.神经生长因子、胶质源性神经营养因子在缺血脑组织的分布相似.正常组、假性手术组,皮质、嗅结节、丘脑和下丘脑等区的神经元神经生长因子、胶质源性神经营养因子免疫反应为弱阳性乃至强阳性;再灌流0.5 h,缺血区皮质弱阳性,缺血周边区中等阳性;再灌流3～48 h,神经生长因子、胶质源性神经营养因子强阳性的神经元主要位于非大脑中动脉供血区和缺血周边区.此外,对照侧皮质大量的神经元呈强阳性.结论,上述资料提示即早基因c-ofs和神经营养因子具有促进神经元存活的作用.

NGF,BDNF,NT-3和GDNF在背根节不同神经元的配布的免疫组织化学证据

为了探讨神经生长因子、脑源性神经生长因子,神经营养素-3,胶原细胞源性神经生长因子在成年猫背根节神经元不同大小细胞的分布.取L6背根节制成20 μm厚冰冻切片,用上述四种因子抗血清进行免疫组化反应.计数每一种因子阳性大、中、小型(小于42 μm者为小型神经元;42～57 μm者为中型神经元;大于57 μm者为大型神经元)神经元的百分数.结果证明,此四种因子在背根节大、中、小神经元的阳性百分数分别为:1.2±0.7,2.1±0.9,3.3±1.1;1.7±0.4,11.2±1.2,30.0±1.5;26.7±2.2,6.2±1.2,1 3.2±2.9;27.4±3.3,8.1±1.7,20.1±2.4.表明:在成年猫L6背根节仅存在少数神经生长因子阳性细胞,而脑源性神经生长因子则主要配布于中、小神经元,神经营养素-3和胶质细胞源性生长因子的免疫阳性细胞主要是大神经元,但也包括一些中小神经元.提示此四种因子在成年猫背根节的生理功能可能与神经元的不同大小有关.

实验性哮喘豚鼠内脏感觉传入部位SP免疫反应的研究

用免疫组织化学方法结合显微图像分析,观察哮喘豚鼠脊神经节、结状神经节、脊髓和孤束核内P物质的变化.正常豚鼠C7～T5脊神经节及结状神经节内存在SP阳性反应细胞,其细胞质内充满棕色阳性反应颗粒,并可见大量的阳性反应纤维.P物质免疫反应也见于C7～T5脊髓后角板层Ⅰ、板层Ⅱ、中间带外侧核,呈点状分布,偶见阳性纤维.孤束核内可见大量的P物质阳性反应.哮喘豚鼠结状神经节、C7～T5脊神经节和相应节段脊髓后角、孤束核内P物质阳性反应的密度明显增多而平均灰度值却明显地低于对照组.上述结果表明,哮喘豚鼠内脏感觉传人部位P物质表达增强,提示这些部位的P物质可能参与哮喘的发病过程.

海人酸、使君子酸致Huntington病鼠纹状体NOS阳性细胞的变化

为了研究海人酸和使君子酸对大鼠纹状体NOS阳性细胞的影响,用神经毒海人酸、使君子酸破坏大鼠左侧尾壳核,将夜间活动超过600次、主动回避试验阳性率在35%以下的大鼠作为成功的Huntington舞蹈病模型.注射后2个月,将动物脑切片进行Nissl、NADPH-d组化和GFAP免疫组化反应.结果表明,海人酸和使君子酸均可使纹状体nNOS阳性神经元丢失、出现iNOS阳性胶质细胞和侧脑室扩大,两者无显著差异.在损伤中心区nNOS阳性神经元减少甚至消失,但这种变化自中心向周围呈渐变趋势;iNOS阳性胶质细胞呈两种不同形态:一类胞体略大而突起粗短,一类胞体小而突起相对较长.对侧纹状体及伤侧纹状体非损毁部均未见NOS阳性胶质细胞NADPH-d组化和GFAP免疫组化双重反应表明一些iNOS胶质细胞为GFAP阳性胶质细胞.本研究提示,海人酸和使君子酸均可使纹状体nNOS神经元减少消失,损毁区出现的NOS阳性胶质细胞为诱导型神经胶质细胞(iNOS).海人酸和使君子酸所引起的Huntington病模型鼠形态学及行为变化均无明显差异.

P物质阳性神经纤维对球海绵体肌和坐骨海绵体肌运动神经元的支配一HRP逆行示踪与免疫细胞化学研究

本研究应用HRP逆行示踪与免疫细胞化学相结合的双重反应技术观察了P物质纤维与前角躯体运动神经元的关系.用WGA-HRP经大鼠球海绵体肌和坐骨海绵体肌注射后,逆行示踪标记的运动神经元分布于L5和L6脊髓前角的背内侧核和背外侧核内侧部.SP能纤维广泛分布于脊髓灰质,其中以后角为密集.光镜下可见在前角的背内侧核和背外侧核内,SP阳性纤维呈点状和带有钮扣状膨大的纤维分布于逆行标记的运动神经元周围.电镜下可见SP阳性纤维终末含有少量的大型囊泡和多量的清亮小泡.常见SP阳性纤维末梢与HRP逆行标记的运动神经元有紧密联系,并证明二者形成突触结构.本研究首次证实脑下行P物质阳性纤维对调控球海绵体肌和坐骨海绵体肌运动神经元有直接支配关系,提示P物质能纤维参与阴茎勃起和射精过程.

Schwann细胞促进共培养和共移植的胆碱能神经元的存活和生长

移植神经细胞的低存活率是目前制约脑内移植临床应用的主要因素.本研究采用胚胎大鼠隔核神经元和新生大鼠Schwann细胞的联合培养和联合移植技术,分析了Schwann细胞促进胆碱能神经元存活和生长的可能性.结果显示,胆碱能神经元的存活及其突起生长与共培养或共移植Schwann细胞的存在与多少明显相关.分别与密度为6×103/cm2、1.8×104/cm2、5.4×104/cm2(密度比为1: 3:9)的Schwann细胞联合培养,存活的乙酰胆碱酯酶阳性细胞数之比为1:2.3:3.9;阳性细胞的突起总长度分别为281、428和640 μm.在与Schwann细胞混合移植的胚胎隔核细胞中存活的乙酰胆碱酯酶阳性细胞是单独移植的2.2倍,共移植的阳性细胞也有较密集的突起生长.结果提示,共培养和共移植Schwann细胞能显著提高胆碱能神经元的存活能力,促进其生长.

人松果体钙化及其与胶原纤维的关系- NaOH消蚀法扫描电镜研究

用NaOH消蚀法扫描电镜观察了11例人松果体的钙化及其与胶原纤维的关系.研究表明,人松果体脑砂成群分布,位于松果体小叶和纤维隔内.松果体隔内的脑砂被胶原纤维包围,部分胶原纤维缠绕在脑砂表面,有少数胶原细纤维甚至被埋入脑砂之中.脑砂大小不等,主要为球形和桑椹状,球形脑砂和构成桑椹状脑砂的卵圆形钙化球则由更小的钙化微粒构成.脑砂的主要成分为钙、磷和银,分别占54.82%、25.83%和16.01%,还有少量的铁(3.34%).钙磷比值约为2.12.研究结果提示,胶原纤维与人松果体结缔组织的钙化的发生和发展密切相关.

Nrf3基因在帕金森病猴模型黑质中表达的研究

本研究目的在于采用mRNA差异显示技术及改进的硝酸银核酸染色技术.寻找1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶诱导侧与对照侧中脑黑质细胞之间的差异表达基因.用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶诱发单侧帕金森病猴模型后,将两侧黑质mRNA用3'端三个锚定引物与30种随机引物进行逆转录-聚合酶链反应,经聚丙烯酰胺凝胶电泳及硝酸银染色后显示扩增产物条带.结果:对获得的差异表达基因片段的序列分析、同源性比较及功能分析证明,差异基因中的一个(149 bp)为Nrf3基因片段.此结果提示:Nrf3可能参与小胶质细胞的生长,促进对变性神经元的吞噬作用,可为从分子水平了解人类帕金森病的发生机理提供依据.

成人骨骼肌细胞原代培养

本研究以获取基因治疗自体移植的载体为目的,观察了生长因子对成人骨骼肌卫星细胞增殖的影响.用手术中取得的成人骨骼肌进行体外组织块培养及酶消化培养,用成纤维细胞生长因子及表皮生长因子进行处理,作动态观察.结果证明,消化分离出的肌卫星细胞数量极少,培养不能成活;组织块培养肌卫星细胞的增殖与生长因子的作用有关,成纤维细胞生长因子及表皮生长因子处理组的增殖细胞数显著高于对照组.提示,生长因子可促进成年人骨骼肌卫星细胞增殖,但与其年龄及部位有一定关系.

P物质在人心传导系统中的分布

为观察P物质在人心传导系统中的分布,采用免疫组织化学方法显示10例非心血管疾病死亡者心传导系统中的P物质.结果发现,在心传导系统中有数量较少的P物质免疫阳性纤维和细胞,分布于窦房结、房室结和房室束等部位.本研究提示,在人心传导系统中,P物质阳性神经纤维可能有部分来自心内神经节,并且在结细胞之间以及窦房结和房室结之间的功能联系中具有重要作用.

大鼠三叉神经脊束核尾侧亚核Ⅱ层内CB样、PV样阳性终末与向臂旁核投射神经元的突触联系

为了观察三叉神经脊束核尾侧亚核Ⅱ层神经元与向臂旁核投射神经元的突触关系,选用Calbindin D-28k和Parvalbumin作为标志物,采用HRP逆行追踪与免疫组织化学技术相结合的双重反应技术对Ⅱ层内的Calbindin D-28k样和Parvalbumin样阳性神经元与三叉神经脊束核尾侧亚核向臂旁核投射神经元之间的突触联系进行了观察.HRP注入臂旁核后,逆标神经元主要位于同侧三叉尾侧亚核Ⅰ层至Ⅲ层.Calbindin D-28k和Parvalbumin样阳性胞体、纤维和终末主要集中在Ⅱ层内侧带.电镜下观察,此二者的阳性反应产物呈弥散分布;两者的阳性终末与HRP逆标神经元的胞体和树突之间主要形成轴-树突触,偶见轴-体突触;Calbindin D-28k样阳性终末与HRP逆标神经元的树突形成的非对称性突触占83%,Parvalbumin样阳性终末与HRP逆标神经元的树突形成的对称性突触占85%.此外,还观察到参与突触小球组成的初级传入纤维终末与HRP逆标神经元的树突形成突触联系.以上结果提示:(1)三叉神经脊束核尾侧亚核Ⅱ层的Calbindin D-28k样或Parvalbumin样阳性神经元可通过突触传递机制对三叉神经脊束核尾侧亚核向臂旁核投射的神经元进行调控,影响外周伤害性信息向上位脑结构的传递;(2)三叉神经脊束核尾侧亚核向臂旁核投射的神经元可能参与面口部伤害性信息的直接传递.

微囊化转基因肌细胞治疗帕金森病大鼠模型的实验研究

为了探讨微囊化转酪氨酸羟化酶基因的细胞在帕金森病大鼠模型脑内存活,组织反应及对异常行为的治疗效果.本研究将带有酪氨酸羟化酶基因的载体-质粒pCMV-TH在体外通过脂质体转染技术转入原代培养的人胚骨骼肌细胞内.将转染后的肌细胞包裹在藻酸盐-多聚赖氨酸-藻酸盐构成的半透膜微囊中,然后将这些微囊化的能表达酪氨酸羟化酶的骨骼肌细胞植入模型大鼠脑的纹状体内.结果表明,微囊化的转基因细胞在脑内可存活至实验结束(16周),可表达酪氨酸羟化酶.微囊化细胞周围无显著免疫排斥反应及炎症反应.本研究结果表明:将用于异种移植的转基因细胞微囊化是使基因治疗实用化的有效手段.

大鼠生后脑下垂体前叶CGRP免疫反应阳性神经纤维的发育

应用免疫组织化学方法规察了大鼠生后其脑下垂体前叶CGRP免疫反应阳性神经纤维的发育变化.SD大鼠按生后天数分为P1～2、P8、P15、P30、P45等五个实验组.结果证明,P1～2 d,从周围脑膜中来的CGRP阳性神经纤维进入前叶浅表,形态较短直,前叶中央部未见阳性纤维.P8 d,CGRP阳性纤维的数量较P1～2 d者显著增多,CGRP阳性纤维细而弯曲,富含膨体,呈网状或簇状分布于前叶背侧中央部及吻侧部.P15 d,CGRP阳性纤维可分为粗直类纤维和弯曲的膨体型细纤维,前者分布于前叶大部分,后者主要呈网状或簇状分布于前叶吻端近腹侧部及背尾部.P30 d,CGRP阳性纤维也分为粗直类纤维和弯曲的膨体型细纤维,粗直类纤维分布于整个垂体前叶;弯曲的膨体型细纤维较P15 d者分布广泛.P45 d CGRP阳性纤维类型和分布接近成年大鼠.本研究结果表明,大鼠垂体前叶的CGRP阳性神经纤维随出生后年龄的增长,其类型、数量、分布逐渐由少到多,由分布于浅表到广泛分布于整个垂体前叶,呈现一种动态变化,说明出生后大鼠垂体前叶中CGRP阳性纤维发育迅速.

GDNF在人脑胶质瘤细胞中表达的检测及其cDNA的克隆

为研究人脑胶质细胞源性神经营养因子在脑胶质瘤中的表达及其在治疗神经系统疾病中的作用,本研究克隆了其前体蛋白及其成熟多肽的cDNA序列,将之用于真核及原核细胞表达.提取我国自建的脑胶质瘤细胞系BT325总RNA,设计两对引物用逆转录PCR法扩增上述两种长度的cDNA片段,然后重组于pGEM-T载体,酶切鉴定插人片段正确后测序.结果表明,脑胶质瘤细胞中只扩增出558 bp的胶质细胞源性神经营养因子全长cDNA片段,未见636 bp片段;且扩增效率较成熟多肽cDNA甚低.提示,该细胞合成的胶质细胞源性神经营养因子可能还存在不含有信号肽而只能在细胞内潴留的成熟多肽形式.作为自泌性生长因子,它可能调节瘤细胞生长等生物学行为;同时克隆到的胶质细胞源性神经营养因子全长及其成熟多肽的cDNA片段,可分别用于真核及原核细胞表达.

尾状核、黑质、迷走神经背核内参与尾状核P物质抑制胃运动效应的递质

在向大鼠尾状核微量注射P物质引起胃肌电和运动出现抑制效应时,应用免疫细胞化学的方法观察了尾状核、黑质、迷走神经背核内P物质、酪氨酸羟化酶、胆碱乙酰化酶和γ-氨基丁酸免疫活性的变化.藉以探讨尾状核P物质的抑胃效应与经典递质多巴胺、乙酰胆碱和γ-氨基丁酸的关系.结果如下:(1)尾状核内合成多巴胺的限速酶酪氨酸羟化酶免疫反应阳性纤维活性明显增强,乙酰胆碱的合成酶-胆碱乙酰化酶免疫反应阳性细胞体数目显著增加,γ-氨基丁酸细胞体免疫反应活性明显增强.(2)黑质内γ-氨基丁酸能纤维免疫反应活性显著增强,胆碱乙酰化酶免疫反应阳性细胞数目也显著增加,P物质和酪氨酸羟化酶免疫反应无明显变化.(3)迷走神经背核内胆碱乙酰化酶免疫反应阳性细胞数目显著减少,P物质、γ-氨基丁酸免疫反应细胞数目显著增加.本研究提示:尾状核内的多巴胺、乙酰胆碱、γ-氨基丁酸,黑质内的γ-氨基丁酸、乙酰胆碱和迷走神经背核内的P物质、γ-氨基丁酸、乙酰胆碱等可能参与尾状核P物质的抑胃效应.

氯化锰对大鼠中脑多巴胺能神经元毒性的研究

本文通过锰诱导多巴胺能神经元凋亡及其可能的神经化学机制的研究,进而探讨锰中毒与帕金森病发病的相互关系.分离培养大鼠中脑黑质多巴胺能神经元用不同剂量MnCl2处理后,用荧光染料进行染色,观察了凋亡神经元数量.用腹腔注射及脑内单侧注射MnCl2染毒方法处理大鼠,并采用脑内微透析技术和高效液相色谱-电化学方法(HPLC-ECD)在活体检测了术后不同时间的纹状体细胞外液中DA及其代谢产物DOPAC、HVA以及5-HT的代谢产物5-HIAA等的含量;同时作丙二醛含量和过氧化物歧化酶活性检测.结果发现,凋亡神经元的细胞核缩小、不规则、染色质呈块状深染,凋亡细胞数量随MnCl2剂量升高而增多.MnCl2脑内注射侧与注射对侧相比,术后4、7、10、20 d的DA、DOPAC、HVA和5-HIAA含量均有不同程度的降低.腹腔染毒高、低剂量组20 d后大鼠整体纹状体匀浆的上述指标也明显降低.此外,染毒大鼠纹状体中丙二醛水平随染毒剂量增高而增高,过氧化物歧化酶活性随染毒剂量增高却下降.以上结果表明,锰中毒可能是引起帕金森病发病的原因之一.

Deltorphin Ⅰ单克隆抗体的制备及Deltorphin Ⅰ样免疫活性在在体和离体大鼠脑神经元的表达

本研究利用结合到BSA 上的 deltorphin Ⅰ肽(DADTⅠ)免疫Balb/c小鼠,成功地制备了特异性抗DADT Ⅰ单克隆抗体.交叉试验表明,所获抗体仅识别DADT Ⅰ和DADT Ⅱ而不识别其L型同分异构体LADT Ⅰ,也与其它DADT Ⅰ类似物无交叉反应.Epitope分析表明,该抗体识别DADT Ⅰ的N末端特异氨基酸序列,其中包括对其活性有重要影响的第二位的D-Alanine.利用这一抗体对成年大鼠脑组织和新生大鼠培养神经元进行了免疫组织化学研究.大鼠脑中有含量较低的DADT I样免疫活性,主要分布在某些特定部位的神经纤维和神经元胞体,如终纹床核、杏仁核、海马、伏核、下丘脑外侧区、黑质、中央灰质等部位.然而在培养的大鼠脑神经元,DADT I样免疫活性的含量却很丰富,神经元的胞体和突起均呈较强的DADT I样免疫活性.两项结果均提示哺乳动物脑神经元很可能产生一种与DADT I在结构上极其类似的物质.

面口部三叉神经躯体性初级传入和内脏性初级传入在三叉神经脊束间质核汇聚的电镜研究

本教研室既往研究曾发现三叉神经脊束间质核不仅接受支配面、口部皮肤和粘膜的下牙槽神经、舌神经和眶下神经等三叉神经范围的初级传入,还接受舌咽、迷走神经的内脏初级传人.继之又证明,投射于三叉神经脊束间质核的舌神经、眶下神经和舌咽、迷走神经的初级传人终末都主要分布在相当于闩水平的三叉神经脊束间质核的梭形、柱状膨大部分,且两者的终末分布区存在着明显的重叠.因此设想,此两种传人终末可能汇聚于三叉神经脊束间质核内的神经元并与之形成突触联系.为了证实此点,本研究将HRP和神经毒ricin分别注入于舌咽、迷走神经和眶下神经,在电镜下对它们的终末分布状态和联系进行了探索.发现有多数的此两类终末与树突分别构成突触连结;还发现一些标记的和溃变的终末共同汇聚于同一间质核神经元,其数量分别占标记终末总数的1.43%和变性终末总数的6.57%.本文首次在形态学上证明直接来自三叉神经躯体性和来自Ⅸ、Ⅹ脑神经内脏性初级传人终末汇聚于间质核神经元形成双重突触连结.推论,来源不同的外周躯体性和内脏性传人信息可能藉此汇聚而互相作用实现功能上的整合.

永生化神经前体细胞及其应用

神经前体细胞是在一定环境下可向神经元或神经胶质细胞分化的多潜能细胞,永生化神经前体细胞(immortalizedneural progenitor cells)则具有无限增殖分裂能力.基因修饰的永生化神经前体细胞的回体移植(ex vivo)治疗中枢神经系统(CNS)疾病已成为近年来神经生物学的研究热点之一[1].将这些神经前体细胞株移植到受损的脑或脊髓组织中之后不仅可存活,再增殖、整合,并分化为神经元和神经胶质细胞,而且能合成神经营养因子、相关的神经递质和代谢酶.

少(寡)突胶质细胞迁移研究进展构

少(寡)突胶质细胞是中枢神经系统的髓鞘形成细胞.作为绝缘层的髓磷脂包卷神经元轴突有利于轴突的正常快速电传导[1].它在胚胎早期起源于室层(ventricular zone, VZ)和室下层(subventricular zone, SVZ)[2-4].在脊髓,少突胶质细胞由神经管腹侧的室层产生,然后向两侧及背侧迁移[5-7].在胚胎晚期和新生儿早期,少突胶质细胞前体经一定距离的迁移后形成有髓神经纤维的髓鞘.近年来在多发性硬化、脑白质发育不良等脱髓鞘疾病或髓鞘形成障碍治疗的研究中,细胞移植已成为一大热点[8-10].而移植入受体的少突胶质细胞或其前体的迁移能力能否形成髓鞘的必需条件?则是一个值得探索的问题.本文就近年来关于少突胶质细胞及其前体迁移的研究进展做扼要综述.

反义方法及其在疼痛研究中的应用

分子生物学领域的新进展极大地促进了基因克隆和测序的发展.有人预测到2005年人类基因组计划将提供3,000～10,000种新的基因用于药物研究[1],其中约1/3的基因将用于研究疼痛.因此,对这些新基因的功能研究提出了更高的要求.目前研究基因功能的方法很多,包括增强基因表达和减弱或阻断基因表达等.减弱或阻断基因表达主要有基因敲除(knock-out)和基因下调(knock-down)两种方法.

哺乳动物松果体的构造和功能

哺乳动物的松果体,是脑内一个重要的神经内分泌转换器(transducer),产生多种生物胺类和肽类物质,与机体的生长、发育、成熟和衰老等生命进程密切相关. 哺乳动物松果体的形状、大小、位置存在着很大的种系和个体差异.其重量也随季节和年令而变化,且可因光照周期的影响而变化.

学术会议