糖尿病大鼠胰腺差异表达蛋白质组分析

目的 运用蛋白质组学方法 ,对糖尿病大鼠胰腺蛋白质的表达进行分析.方法 用链脲佐菌素(STZ)诱发建立1型糖球病大鼠模型.用双向凝胶电泳(2D-PAGE)分离大鼠胰腺组织蛋白质,图像分析软件对比分析大鼠的双向电泳图谱,差异表达蛋白经胶内酶切,用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)分析获得肽质量指纹图,使用Mascot方法 进行检索签定.结果 对11个差异表达蛋白质进行分析鉴定,其中4个蛋白质得到有意义结果 .结论 糖尿病大鼠胰腺蛋白质组的分析,有助于探索糖尿病的发病机制.

心脏肌球蛋白结合蛋白C基因G4295A突变与中国家族性肥厚型心肌病临床表型的关系

目的 研究中国人家族性肥厚型心肌病(HCM)的致病基因突变位点,分析基因型与临床表型的相互关系.方法 在100例肥厚型心肌病患者以及120例健康对照者中进行心脏型肌球蛋白结合蛋白C基因(MYBPC3)突变筛查,聚合酶链式反应(PCR)扩增基因功能区外显子片段并对PCR产物进行测序分析.结果 在2例HCM(ZHQ和JXW)患者中发现MYBPC3基因第6号外显子第4295位碱基由G转换为A,结果 导致第258位的谷氨酸(Glu,E)转变为赖氨酸(Lys,K),正常对照组相同位置未发现异常.对这2例先证者进行家系调查发现ZHQ和JXW家族受调查者中分别还有2名和1名成员携带该突变基因,但均未发病.结论 MYBPC3基因为我国家族性HCM的致病基因之一,E258K突变所致肥厚型心肌病表型呈现外显率较低且临床症状相对较轻的特点.

槲皮素对小鼠体内和体外NIH-3T3细胞的抗氧化作用及其机理

目的 比较槲皮素对小鼠体内和体外H2O2处理前/后的NIH-3T3细胞抗氧化效应的差异并探讨其作用机理.方法 将NIH-3T3细胞分为4组,槲皮素前保护组(Qb)、槲皮素后保护组(Qa)、H2O2组(H2O2)和对照组(C).用试剂盒检测细胞内T-AOC、SOD、GSH-Px、GSH、MDA、NOS和NO2-/NO3-的水平;MTT和TUNEL法检测细胞凋亡率和生存率;免疫印迹和免疫组化技术检测细胞的cyclin D1、PTEN、NF-kB、HSP-70、BCl-2、BAX、及caspase-3的表达.另将20只Wistar大鼠等分为对照组和实验组,检测槲皮素灌胃前、后1、2及24 h血浆内T-AOC、SOD、GSH-Px、GSH、MDA、NOS和NO2-/NO3-的水平.结果 H2O2组细胞凋亡率增高,cyclin D1、mN及BCl-2的表达下调;BAX、HSP-70、NF-kB及caspase-3的表达上调;T-AOC,SOD,GSH-Px及GSH水平降低,NOS、NO2<'-./NO3-及MDA增高.动物灌胃后1 h、2 h血浆中T-AOC、SOD、GSH-Px、GSH,NOS及NO2-/NO3-的水平增高,MDA降低;24 h后基本恢复.结论 槲皮素在体内外皆可通过调节抗氧化酶体系发挥抗氧化作用,其效应依据H2O2处理与否和处理前/后等细胞的异质性而呈现一定差异.

二甲双胍抑制OLETF大鼠肝组织TNF-α表达

目的 观察自发胰岛素抵抗的OLETF大鼠糖脂代谢异常的同时肝组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达水平的变化以及二甲双胍治疗对TNF-α表达水平的影响.方法 以野生型的LETO大鼠作为对照(LETO组),OLETF大鼠分为OLETF组和OLETF/M组(二甲双胍每天100 mg/kg).治疗22周,测定肝组织三酰甘油含量,用Western blot方法 测定肝组织TNF-α蛋白表达水平,用定量PCR方法 测定TNF-α mRNA的表达水平.结果 与LETO组大鼠相比OLETF组大鼠空腹血糖、胰岛素以及三酰甘油、游离脂肪酸的水平显著升高,肝组织三酰甘油含量增加.同时,OLETF组大鼠肝组织TNF-α蛋白表达水平为LETO组大鼠的1.57倍(P<0.05),TNF-α mRNA表达水平是LETO组的1.67倍(P<0.05).经二甲双胍治疗,OLETF/M组大鼠的空腹血糖、胰岛素、游离脂肪酸及肝组织三酰甘油含量明显下降.OLETF/M组大鼠TNF-α的表达水平也显著受抑,其中蛋白表达水平较OLETF组下调59%(P<0.05)、mRNA水平下调45%(P<0.05).结论 抑制肝脏TNF-α表达是二甲双胍发挥改善胰岛素敏感性及肝脏脂肪变作用的重要纽带.

与心肌细胞共培养的小鼠胚胎干细胞向心肌样细胞分化

目的 探讨心肌细胞促进胚胎干细胞(ESCs)分化为心肌样细胞的诱导作用.方法 收集小鼠3.5 d胚龄的囊胚,将其培养在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上,4～5 d后取内细胞团接种在饲养层上分离培养出ESCs.取3～5代ESCs,先将ESCs悬浮培养形成2～3 d的拟胚体(EBs),再与新生大鼠心肌细胞共培养诱导向心肌细胞分化,相差显微镜下观察分化细胞的形态学变化,免疫细胞荧光技术检测心肌细胞特异性肌钙蛋白T(TnT)、α-肌动蛋白(α-actin)的表达.结果 诱导第3天起可见自发性、有节律跳动的拟胚体出现,12 d时第2组约有93%的拟胚体出现节律性收缩,显著高于其他各组,均表达心肌细胞特异性蛋白cTnT、β-actin,心肌细胞直接接触诱导组其分化比率达56.5%,高于其他各组,并且分化的细胞形态较单一.结论 心肌细胞和心肌细胞裂解液均可诱导ESCs向心肌细胞定向分化,且心肌细胞的诱导作用强于心肌细胞裂解液.

雌激素下调人乳腺癌细胞系MCF-7高迁移率蛋白的表达

目的 探讨雌激素与其拮抗剂他莫昔芬对人乳腺癌细胞系MCF-7高迁移率族蛋白(HMGB1)表达的影响.方法 在培养的MCF-7细胞中分别加入无水乙醇、不同浓度的17-beta-雌二醇(E2)和他莫昔芬培养4 d后.用实时荧光定量PCR和Western blot技术检测HMGBl Mrna和蛋白水平.结果 17-beta-E2浓度在10-6和10-4moL/L时,HMGBI Mrna和蛋白的表达均显著低于对照组(P<0.05).他莫昔芬浓度在10-6和10-4moL/L时,HMGB1 Mrna和蛋白的表达显著高于对照组(P<0.05).结论 雌激素能够下调HMGB1的表达,而其拮抗剂他莫昔芬则相反.

骨髓间充质干细胞经大鼠冠状动脉内移植的可行性

目的 研究骨髓间充质干细胞经冠状动脉内移植的安全性及可行性.方法 左侧开胸结扎SD大鼠左冠状动脉,2周后取心脏建立Langerndorff模型.将CM-DiI标记的骨髓间充质干细胞悬液注入主动脉根部,同时收集右心房回流的液体,离心后通过流式细胞仪计数细胞数量.观察是否有细胞经冠状静脉回流及数量比例.并在不同时间测LVSP、LVDP、±dp/dt、心率,评价其安全性.在体实验中取心梗后2周的大鼠,经左心室-主动脉途径将细胞悬液注射到临时阻断的主动脉根部,分别在移植后1及24 h和1及4周取材观察细胞在心脏内的位置及细胞的迁移情况.结果 离体实验发现经冠状动脉内注射骨髓间充质干细胞90%以上的细胞在心肌组织内存留,移植后LVSP、LVDP、±dp/dt、心率没有明显变化.在体内实验中发现细胞移植后早期大部分细胞分布在心外膜下心肌组织内,在心内膜下组织内较少细胞分布,而且大部分细胞在正常心肌组织内,只有少量在心梗区域.而在细胞移植后1～4周存活的细胞多在心肌梗死及交界区组织内,在正常组织内很少有移植细胞存在.结论 经冠状动脉途径进行细胞移植是安全可行的.

硫化氢抑制apoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化中ICAM-1的表达

目的 探讨硫化氢(H2S)对apoE基因敲除小鼠(apoE-/-小鼠)动脉粥样硬化中细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的调节作用.方法 6周龄雄性C57BL/6J和apoE-/-小鼠分为C57BL/6对照组、apoE-/-组、apoE-/-+硫氧化钠(NariS)组和apoE-/-+炔丙基甘氨酸(PPG)组,每组各8只,普通饮食饲养10周.硫电极法测定血清中H2S的含量;ELISA法测定血清中ICAM-1的含量;荧光实时定量RT-PCR法测定主动脉组织中ICAM-1 mRNA的表达.油红O染色观察小鼠主动脉根部斑块面积的变化.结果 与C57BL/6J小鼠相比,apoE-/-小鼠血清中H2S的含量明显下降(P<0.01),血清中ICAM-1的含量和主动脉组织中ICAM-1 mRNA的表达明显升高(P<0.01),主动脉根部出现明显斑块;给予NaHS后,apoE-/-小鼠血清中H2S的含量明显升高(P<0.05),血清和主动脉组织中ICAM-1的表达明显降低(P<0.01和P<0.05),动脉粥样斑块明显缩小(P<0.05);给予PPG后,apoE-/-小鼠血清中H2S的含量明显降低(P<0.05),血清和主动脉组织中ICAM-1的表达明显增高(P<0.05和P<0.01),动脉粥样斑块明显增大(P<0.01).结论 气体信号分子H2S可明显抑制动脉粥样斑块形成过程中ICAM-1的表达与分泌.

大鼠肌源性干细胞体外转分化为胰岛素分泌细胞

目的 探讨体外自体肌源性干细胞(MDSCs)定向诱导分化为胰岛素分泌细胞团的可行性.方法 用差速贴壁的方法 对SD大鼠MDSCs进行分离和培养,加入联合诱导剂培养7～12 d.通过形态学观察、双硫腙(DTZ)染色、免疫细胞化学染色、葡萄糖刺激实验和RT-PCR,对诱导细胞进行体外结构和功能鉴定.结果 联合诱导后12 d有典型的胰岛样结构出现;诱导后第12天细胞用表达胰岛素,而未诱导组细胞不表达;诱导后第7天检测到胰岛素(INS)、胰高血糖素(GLU)和生长抑素(SS)基因的表达.结论 体外诱导大鼠肌源性干细胞可定向分化为胰岛素分泌细胞存在可行性,本实验将可能为临床糖尿病干细胞治疗提供新的途径.

阿魏酸钠抑制Aβ25-35激活小鼠巨噬细胞引起的神经细胞损伤

目的 探讨阿魏酸钠(SF)抑制淀粉样β蛋白(Aβ25-35)激活巨噬细胞引起的神经细胞损伤及其机制.方法 单独培养小鼠腹腔巨噬细胞以及与神经细胞联合培养,加入10μmoL/L的Aβ25-35,保护组加入不同浓度的SF.单独培养的巨噬细胞,采用Western blot和ELISA法分析P38 MAPK水平和检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)生成量.神经细胞和巨噬细胞联合培养,采用免疫组织化学方法 和LDH检测试剂盒检测微管相关蛋白2(MAP-2)的表达水平和乳酸脱氧酶(LDH)漏出量.结果 SF能显著降低Aβ25-35诱导的腹腔巨噬细胞核蛋白P38 MAPK的含量及细胞的TNF-α水平,能显著地降低LDH漏出量,使MAP-2表达水平明显增加,呈剂量依赖性(P<0.05).结论 SF可抑制Aβ25-35诱导的P38 MAPK通路,使TNF-α水平降低,对神经细胞具有保护作用.

通过筛选随机多肽文库研究Veli3 PDZ结构域配体结合特性

目的 研究Veli3 PDZ结构域配体的结合特性.方法 用Veil3 PDZ为诱饵蛋白,用酵母双杂交方法 筛选随机多肽文库.结合生物信息学方法 在各种数据库中检索与Veli3 PDZ识别规律相符合的天然人类蛋白质.然后根据蛋白质的功能和细胞定位等性质选择14个潜在新配体用酵母双杂交验证相互作用.文献检索与Veil3 PDZ配体结合的其他PDZ蛋白.结果 Veil3 PDZ结构域配体C-末端保守的氨基酸序列通式可以表示为:[E/X][S/T]X[V/I/L]-COOH(X表示任意氨基酸).这是Class I PDZ结构域配体的特点.用酵母双杂交实验证实14个生物信息方法 预测的潜在配体中有6个配体与Veil3相互作用.另一个PDZ蛋白PSD-95与已报道的Veil3 PDZ配体和本研究新发现的潜在配体有多个相互作用.结论 新发现的6个Veli3PDZ潜在配体为进一步研究Veil3的生物学功能提供新的线索.另外Veli3与PSD-95可能易于同时竞争结合同一配体,其生物学意义还有待进一步研究.

一株健康人γδT细胞克隆的建立及鉴定

目的 建立健康人γδT细胞克隆并进行鉴定.方法 以<'60>Co照射的同种异体PBMC作为饲养细胞,以有限稀释法对经过阳性分选的γδT细胞进行克隆化.用流式细胞术及分子生物学检测鉴定所获克隆,以MTT掺入法对所获克隆进行增殖实验检测.结果 获得一株γδT细胞单克隆,为VγV82亚型,CD4分子和CD8分子表达均为阴性.进一步的研究发现表位肽EP6不仅能够特异性结合γ8T细胞单克隆,而且能够促进其增殖.结论 成功建立了健康人外周血γδT细胞克隆,为深入研究γδT细胞抗原识别机制、亚群及功能奠定了坚实的基础.

Sca1+间充质干细胞支持造血干细胞向树突细胞分化

目的 研究Sca1+间充质干细胞对HSC向树突细胞(DC)分化的支持作用,并对获得的DC进行形态、表面标志以及功能的鉴定.方法 取健康Balb/c小鼠骨髓,通过MACS系统分离、纯化CD117+造血干细胞;以小鼠Sca1+间充质干细胞做饲养层,诱导CD117+造血干细胞定向分化为树突细胞,显微镜观测形态、流式细胞仪检测表面标志,并通过激光共聚焦显微镜和动物实验检测诱生细胞的功能.结果 培养第10天诱生的DC细胞表面树突较短小,呈毛刺状,高表达CD11b,低表达Ia,对外源颗粒具有吞噬功能,在动物器官移植实验中具有免疫抑制功能.结论 Sca1+间充质干细胞对CD117+HSC向DC分化具有支持作用.

MR1 siRNA抑制人肝癌细胞BEL-7402的增殖

目的 研究MR1基因对肝癌细胞增殖的影响及机制.方法 化学合成MRI siRNA,用脂质体lipofectamine2000转染肝癌细胞系BEL-7402细胞,RT-PCR检测MR1 siRNA基因沉默效果.用SRB法、集落形成法和生长曲线法检测MR1 siRNA对BEL-7402细胞增殖的影响.流式细胞术检测BEL-7402细胞周期,用细胞同步化的方法 ,即与G2期阻滞药物噻氨酯哒唑(nocodazole)联合应用,以间接反映MR1 siRNA对肿瘤细胞周期的影响.Western blot法检测Cyclin D1蛋白.结果 (1)300 nmol/L MR1 siRNA处理BEL-7402细胞24 hA,MR1基因的mRNA水平明显降低.(2)经siRNA处理后,BEL-7402细胞存活细胞数明显下降,细胞生长速度明显减慢,集落形成率显著下降,Cyclin D1表达水平明显降低.(3)MR1 siRNA与nocodazole联合处理BEL-7402细胞后,G2期细胞比例显著减少,而G1期细胞明显增多.结论 MR1基因与人肝癌BEL-7402细胞增殖相关,抑制MR1表达,能够引起细胞的增殖抑制,其作用机制与诱导细胞的G1期阻滞有关.

VEGF降低家兔脑缺血再灌注损伤与caspase-3表达的关系

目的 探讨血管内皮生长因子(VEGF)治疗家兔局灶性脑缺血/再灌注损伤与半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)表达的关系.方法 复制兔局灶性脑缺血/再灌注模型,分别在缺血2 h,再灌注0、1和3 h应用微量进样器将VEGF立体定向导入梗死灶周,于再灌注3 d观察神经功能、梗死体积、水肿体积、灶周凋亡数和caspase-3表达.结果 缺血/再灌注0和1 h时,灶周给予VEGF,梗死体积分别较对照组下降23.3%、17.9%,相应的水肿体积、灶周凋亡率及caspase-3表达明显下降(P<0.01),神经功能恢复较好,用药越早越明显;再灌注3 h后给药,则无明显作用.梗死体积下降与caspase-3表达下降明显相关(P<0.05).结论 VEGF可能通过抑制caspase-3的表达减少脑缺血/再灌注损伤细胞凋亡的发生.

促进移植干细胞存活、分化和修复坏死心肌的策略

移植干细胞在缺血心肌微环境中的低存活率是影响干细胞移植治疗效果的关键.通过采取干预措施即利用细胞因子、药物、化合物等对移植于细胞进行体外预处理,或采用有利于干细胞存活、黏附或促进血管形成的基因对于细胞进行修饰,可直接和间接地提高干细胞在缺血心肌微环境中的存活和分化能力,从而有助于促进移植干细胞修复坏死心肌和改善心功能.

癌基因诱导的细胞衰老

癌基因诱导的衰老(OIS)是指癌基因突变所产生的异常增殖信号,通过MAPK和PI3K信号通路,使细胞处于生长停滞的状态,抑制细胞增殖.它的发生机制与异染色质的形成以及DNA损伤检测点反应的作用相关.衰老相关的β-半乳糖苷酶和异染色质灶是OIS的标记.随着人们对OIS的认识,新的肿瘤发生模式不断提出.对OIS机制的了解,有利于我们重新认识肿瘤的发生机制,为肿瘤治疗提供新的思路和方法 .

涡虫干细胞研究进展

涡虫具有极强的再生能力,其再生潜能归因于体内一类称为"neoblasta"的细胞群,这是成体涡虫体内仅有的一类具有增殖分化潜能的干细胞,即成体未分化细胞.这种细胞在涡虫体内可以发生迁移、增殖和分化,对虫体组织器官损伤的修复或替代具有重要作用.本文就涡虫干细胞方面的研究进展作一简要介绍.

黏着斑激酶与纤维化

黏着斑激酶(FAK)是一种非受体胞质酪氨酸蛋白激酶,处于细胞内多条信号传导通路的交汇点,活化后可调节多种细胞生物学行为.研究发现,FAK在多种纤维化疾病的发生发展中发挥重要作用,有可能成为纤维化疾病治疗的新途径.

雌二醇对人大网膜前脂肪细胞增殖和分化的影响

体脂分布有件别差异性,绝经前女性低内脏脂肪使她们比男性和绝经后女性的代谢性疾病患病率低;绝经后妇女同经前妇女相比网膜的脂肪细胞变得更大,这些均提示性激素在调节体脂分布上有重要的作用.目前雌二醇对原代培养网膜前脂肪细胞作用仍处于争议中,且大多局限于啮齿类的研究.本实验在成功地培养原代人大刚膜前脂肪细胞的基础上,对雌二醇的作用进行了初步研究.

冠脉搭桥患者血浆肾上腺髓质素和内皮素-1的变化

肾上腺髓质素(adrenomedullin,AM)是具有多种生物学效应,参与许多心血管系统疾病的病理过程,与疾病的严重程度相关[1-2].内皮素-1(endothelin-1,ET-1)与AM共同调节基础状态下的血管紧张度,引起血管的自主收缩及扩张.有关影响AM和ET-1分泌的因素很多,但心外科冠脉搭桥术对其影响尚未见报道,我们探讨体外和非体外循环两种冠脉搭桥方式对血浆AM及ET-1的影响.

去甲肾上腺素增强大鼠腹腔巨噬细胞免疫功能

交感神经对免疫组织具有广泛的支配[1],但是其免疫调控作用尚不清楚.去甲肾上腺素是交感神经末梢释放的主要神经递质,因此通过体外实验观察不同浓度去甲肾上腺素对巨噬细胞免疫功能的影响,探讨交感神经系统对免疫功能的影响.

内源性CO抑制肾性高血压大鼠离体血管反应性

体内由血红素加氧酶(HO)催化血红索代谢的产物一氧化碳(CO)可通过刺激血管平滑肌的可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)和钙激活的钾通道及抑制ET-1和血小板源生长因子-β(PDGF-β)的表达,发挥舒血管的作用.我们曾报道[1],HO/CO系统可降低肾性高血压大鼠的血压.本研究通过体内外实验进一步探讨HO/CO舒张血管平滑肌的可能机制.

老年大鼠组织mRNA分析中内参基因的选择

目的 探讨用于老年大鼠组织基因mRNA表达分析的内参基因选择.方法 用实时反转录PCR技术评价5个管家基因3-磷酸甘油醛脱氢酶(G3pd)、β-肌动蛋白(ACTB)、H3组氨酸3B(H3f3b)、酸性核糖体磷蛋白P0(Arbp)和18S核糖体RNA(18S)的表达水平.结果 老年大鼠肾组织中表达稳定的是管家基因ACTB,心脏和肺组织中表达稳定的是G3pa;而Arbp在不同组织之间的表达差异小.结论 老年大鼠组织间基因表达mRNA分析应使用至少两个参照基因:一个是核糖体基因18S,另一个适合的内参基因是Arbp.

简便高效的原代HUVECs培养

目的 建立简便高效的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)体外分离、培养、冻存方法 ,以获得大量HUVECs为相关医学基础研究及组织工程学提供良好细胞来源.方法 新鲜脐静脉内灌注0.25%胰蛋白酶消化,获得HUVECs,内皮细胞培养基(ECM)进行培养.倒置显微镜观察细胞形态,免疫细胞化学、RT-PCR检测VWF、CD144的表达.HUVECs加入10%甘油的冻存液,置于液氮保存4周,冻存复苏后Western blot检测VWF、CD144蛋白水平的表达.结果 HUVECs体外生长2～3 d可铺满单层,细胞呈梭形,漩涡状排列牛长,传代后可见管腔样结构;高表达VWF和CD144;冻存后复苏的细胞分裂增殖旺盛,蛋白水平高表达VWF、CD144.结论 脐静脉灌注胰蛋白酶消化法配合ECM培养可获取大量高纯度的内皮细胞,可作为相关研究良好的细胞来源.

内聚力的复杂特性

术后酸痛、发热、肠瘘

患者、女、63岁,因"腹部闭合伤剖腹探查术后4月,伴间歇性腹疼、发热3月余"人院.1 病例摘要1.1 病史现病史:2007年5月16日6时左右,摔倒撞击上腹部,即感腹部疼痛不适,伴恶心呕吐.